O protocolo de mplexas para Multi-omic análises de amostras de solo

Summary

Um protocolo é apresentado para simultaneamente extraindo metabolitos, proteínas e lipídios de uma amostra de solo único, permitindo tempos de preparação de amostra reduzida e multi-omic análises de espectrometria de massa das amostras com quantidades limitadas.

Abstract

Espectrometria de massa (MS)-com base metaproteomic integrado, metabolómica e estudos lipidomic (multi-omic) estão transformando nossa capacidade de compreender e caracterizar as comunidades microbianas em sistemas ambientais e biológicos. Estas medições são mesmo permitindo análises reforçadas das comunidades microbianas complexo solo, que são os mais complexos sistemas microbianos conhecidos até à data. Multi-omic análises, no entanto, têm desafios de preparação de amostra, desde extrações separadas são normalmente necessários para cada estudo omic, amplificando assim consideravelmente o tempo de preparação e a quantidade de amostra necessária. Para resolver essa limitação, um método de 3-em-1 para a extração simultânea de metabolitos, proteínas e lipídios (mplexas) da mesma amostra de solo foi criado através da adaptação de uma abordagem baseada em solvente. Este protocolo de mplexas tem provado para ser simples e robusto para muitos tipos de amostra, mesmo quando utilizado para quantidades limitadas de amostras complexas. O método mplexas habilitado também extremamente rápida multi-omic medições necessárias para obter uma melhor compreensão dos membros de cada comunidade microbiana, ao avaliar as mudanças que ocorrem após perturbações biológicas e ambientais.

Introduction

Avaliar as comunidades microbianas do solo tem implicações importantes para a compreensão de carbono ciclismo e mudança climática. Estudos recentes no entanto evidenciaram dificuldades, como a falta de genomas sequenciadas para microbiota em vários tipos de solo e a função desconhecida de muitas das proteínas detectadas. Estes resultam de desafios devido ao solo, sendo a mais complexa comunidade microbiana conhecida até à data de^1,2,3. Análises multi-omic, que combinam os resultados de estudos de lipidomic, metatranscriptomic, metaproteomic, metabolómica e metagenomic, recent....

Protocol

Nota: Os solos muito molhados podem ser liofilizados antes da extracção sem detrimento para a eficácia da extração. Solo úmido também pode ser usado mas deve ser considerado ao adicionar os reagentes em proporções específicas.

Nota: É recomendável usar 20g de peso do solo seco por extração, que deve ser dividido entre dois tubos de 50 mL (máximo de solo de 10 g por tubo de 50 mL). As extrações podem ser escaladas cima ou para baixo depende do amostra disponível.

Nota: As amostras de solo seco podem ser peneiradas através de uma tela de 3 mm para homogeneizar e remover pedras e pequenas raízes. Não peneira de amos....

Results

Quando o protocolo de mplexas foi usado para extrair as moléculas do solo de pradaria nativa de Kansas (um solo Mollisol), as análises de três vias previstas resultados 3376 peptídeos, 105 lipídios e 102 metabólitos polares (todas as identificações exclusivas). Enquanto o protocolo de mplexas tem sido bem estabelecido para geral extração de lipídios e metabolitos^12,13,14,

Discussion

É importante notar que nem todos os laboratórios terão o mesmo equipamento disponível para que certos métodos, por exemplo, a etapa de Lise, podem ser adaptados. Aqui usamos num Vortex e sonicating, no entanto, o uso de um batedor de grânulo grande 50ml funcionaria. Se não houver um Liofilizador com uma temperatura do coletor capaz de-105 º C, as amostras podem ser secos sob uma corrente de azoto. Também os tipos de solo variam muito e podem incluir areia, silte, argila, turfa e barro (etc), e também pode variar.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Clorofórmio	Sigma-Aldrich	650498	Armazenado a -20° C ! Cuidado O clorofórmio tem efeitos potenciais agudos à saúde, irritação da pele e possíveis queimaduras químicas, irritação do sistema respiratório, pode afetar os rins, fígado, coração. Use óculos, roupas e luvas de proteção adequados, trabalhe em um exaustor.
Metanol	Sigma-Aldrich	34860	Armazenado a -20° C ! Cuidado O metanol pode causar irritação do trato respiratório, da pele e dos olhos, pode danificar os nervos, rins e fígado. Use óculos, roupas e luvas de proteção adequados, trabalhe em um exaustor.
Água purificada do sistema de purificação de água Millipore Milli-Q			.
Dodecil sulfato de sódio	Sigma-Aldrich	L6026	! Cuidado O SDS causa toxicidade aguda e é inflamável. É um irritante para a pele, os olhos e as vias aéreas. Use luvas e óculos de segurança.
Kit de extração de proteína do solo	MoBio, Kit de extração de proteína do solo NoviPure, Qiagen	30000-20
DL-ditiotreitol	Sigma-Aldrich	43815
1M Trizma HCL	Sigma-Aldrich	T2694
Ácido tricloroacético	Sigma-Aldrich	T0699	! Cuidado O TCA é cáustico, tóxico e pode causar queimaduras na pele. Use luvas e óculos de segurança.
Acetona	Sigma-Aldrich	650501	Armazenado a -20° C ! Cuidado A acetona pode causar irritação do trato respiratório e da pele e dos olhos. Líquido e vapor inflamáveis. Use óculos de segurança, luvas e jaleco, trabalhe em um exaustor.
Ureia	Sigma-Aldrich	208884	! Cuidado A ureia é irritante para os olhos e a pele, use luvas e óculos de segurança
Bicarbonato de amônio	Fluka	09830
Tripsina	Promega	V528A	20µ g frascos Kit de
ensaio de proteína de ácido bicinchonínico	Pierce	23227
Formato de amônio	Sigma-Aldrich	09735
Acetonitrila	Sigma-Aldrich	34998	! Cuidado A acetonitrila é um irritante para a pele e os olhos. Altamente inflamável. Use luvas e óculos de segurança. Trabalhe em uma capela de exaustão.
Ácido trifluoroacético	Sigma-Aldrich	T6508	! Cuidado O TFA é extremamente perigoso em caso de contato com a pele, contato com os olhos, ingestão e inalação. Pode produzir danos nos tecidos, particularmente nas membranas mucosas dos olhos, boca e trato respiratório. O contato com a pele pode produzir queimaduras. Use luvas, jaleco, óculos de segurança e trabalhe em um exaustor.
Cloridrato de metoxiamina	Sigma-Aldrich	226904	! Cuidado O cloridrato de metoxiamina causa queimaduras graves e sérios danos aos olhos, pode causar sensibilização pelo contato com a pele. Use óculos de segurança, luvas e jaleco, trabalhe em um exaustor.
Piridina	Sigma-Aldrich	270970	! Cuidado A piridina pode causar irritação na pele e nos olhos, depressão do sistema nervoso central. O vapor pode causar incêndio repentino. Use óculos de segurança, luvas e jaleco, trabalhe em um exaustor.
N-Metil-N-(trimetilsilil)trifluoroacetamida com 1% de trimetilclorossilano	Sigma-Aldrich	69478	! Cuidado MSTFA + 1% TMCS pode causar corrosão da pele, sérios danos aos olhos e toxicidade de órgãos-alvo específicos. Líquido e vapor inflamáveis. Use óculos de segurança, luvas e jaleco, trabalhe em um exaustor.
Cloreto de potássio	Sigma-Aldrich	P9541
Sistema de purificação de água Milli-Q	Millipore		MPGP04001
Vortex	Scientific Industries	SI-0236	Vortex Genie 2
Sonda Sonicator	FisherBrand		modelo FB505
Centrífuga refrigerada	Eppendorf		modelo 5810R
Tubo de 50mL rotor de caçamba oscilante	Eppendorf	A-4-44
Rotor de ângulo fixo de 50mL	Eppendorf	FA-45-6-30
Balance	OHAUS		modelo V22PWE150IT
Controlador de pipeta sorológica	Eppendorf	12-654-100
10mL, 25mL pipetas sorológicas de vidro	FisherBrand	13-678-27F, 13-678-36D
Thermomixer com Thermotop	Eppendorf	5382000015, 5308000003
0,9 - 2,0 mm de mistura de contas de aço inoxidável	NextAdvance	SSB14B
0,15 mm contas de granada	MoBio	13122-500
Placa de agitação magnética	FisherBrand	11-100-16SH
Barra de agitação magnética	FisherBrand	14512130
tiras de papel de pH, pH intervalo 0– 14	FisherBrand	M95903
15mL, tubo de centrífuga cônico de polipropileno 50mL	Genesee Scientific	21-103 21-108	compatível com clorofórmio
50mL	MoBio	13000-V1-50
Balde de gelo	FisherBrand	02-591-44
Frascos de vidro de 27.25x70mm	FisherBrand	03-339-22K
Respirar Membranas de placa mais fáceis Midwest	Scientific	BERM-2000
Toalhetes com álcool	Diversified Biotech	BPWP-1000
Incubadora de agitador de aquecedor	Benchmark, Incu-Shaker Mini
Rotador de tubo de rotisserie analógico	SoCal BioMed, LLC	82422001
Kit de preparação de amostras auxiliadas por filtro	FASP; Expedeon	44250
Leitor de microplacas	Biotek, EPOCH-20
Graus Celsius Freezer	Fisher	13986149-80
Graus Celsius Freezer	Stirling Ultracold	SU78OUE
Q-Exactive ion trap espectrômetro	de massa Cromatógrafo
Agilent 7890A acoplado a um único quadrupolo Espectrômetro de massa 5975C	Agilent Technologies, Inc.
LTQ-Orbitrap Velo	Thermo Scientific
Waters NanoEquityTM Sistema UPLC	Millford, MA
Frasco de mídia de 250mL	FisherBrand	1395-250
Frasco de águas	Frasco	de
MS e inserções	MicroSolv	9502S-WCV, 9502S-02ND
Glass Frasco de HPLC e tampas de pressão	MicroSolv	9512C-0DCV, 9502C-10C-B
Placa de 96 poços de HPLC	Agilent	5042-6454
Frasco de vidro grande 27,25x70mm	FisherBrand	03-339-22K
Liofilizador	Labconco	7934021
Espátula de cabeça chata de aço inoxidável polido	Spoonula; FisherBrand	14-375-10
Kim wipes	Kimberly-Clark	34721
XBridge C18, 250x4.6 mm, 5 μ M com coluna de guarda de 4,6x20 mm	Waters	186003117, 186003064
Sistema HPLC da série Agilent 1100 Agilent	Technologies	G1380-90000
Tubo de centrífuga de 1,7mL	Hamilton Sorenson	11700
, 5mL, 50µ L e 250µ L	Hamilton	81517, 80975, 81175
Pipetas Pasteur	FisherBrand	13-678-20A
Lâmpadas de Pipeta Pasteur	Sigma-Aldrich	Z111597
Bath Sonicator	Branson 1800 Limpador
Centrífuga a Vácuo	Sistema
Colunas MicroSpin, C18 Sílica	O Grupo Ninho	SEM SS18V