Um protocolo é apresentado para simultaneamente extraindo metabolitos, proteínas e lipídios de uma amostra de solo único, permitindo tempos de preparação de amostra reduzida e multi-omic análises de espectrometria de massa das amostras com quantidades limitadas.
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Artigo de método
O protocolo de mplexas para Multi-omic análises de amostras de solo
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Espectrometria de massa (MS)-com base metaproteomic integrado, metabolómica e estudos lipidomic (multi-omic) estão transformando nossa capacidade de compreender e caracterizar as comunidades microbianas em sistemas ambientais e biológicos. Estas medições são mesmo permitindo análises reforçadas das comunidades microbianas complexo solo, que são os mais complexos sistemas microbianos conhecidos até à data. Multi-omic análises, no entanto, têm desafios de preparação de amostra, desde extrações separadas são normalmente necessários para cada estudo omic, amplificando assim consideravelmente o tempo de preparação e a quantidade de amostra necessária. Para resolver essa limitação, um método de 3-em-1 para a extração simultânea de metabolitos, proteínas e lipídios (mplexas) da mesma amostra de solo foi criado através da adaptação de uma abordagem baseada em solvente. Este protocolo de mplexas tem provado para ser simples e robusto para muitos tipos de amostra, mesmo quando utilizado para quantidades limitadas de amostras complexas. O método mplexas habilitado também extremamente rápida multi-omic medições necessárias para obter uma melhor compreensão dos membros de cada comunidade microbiana, ao avaliar as mudanças que ocorrem após perturbações biológicas e ambientais.
Introdução
Avaliar as comunidades microbianas do solo tem implicações importantes para a compreensão de carbono ciclismo e mudança climática. Estudos recentes no entanto evidenciaram dificuldades, como a falta de genomas sequenciadas para microbiota em vários tipos de solo e a função desconhecida de muitas das proteínas detectadas. Estes resultam de desafios devido ao solo, sendo a mais complexa comunidade microbiana conhecida até à data de1,2,3. Análises multi-omic, que combinam os resultados de estudos de lipidomic, metatranscriptomic, metaproteomic, metabolómica e metagenomic, recent....
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Protocolo
Nota: Os solos muito molhados podem ser liofilizados antes da extracção sem detrimento para a eficácia da extração. Solo úmido também pode ser usado mas deve ser considerado ao adicionar os reagentes em proporções específicas.
Nota: É recomendável usar 20g de peso do solo seco por extração, que deve ser dividido entre dois tubos de 50 mL (máximo de solo de 10 g por tubo de 50 mL). As extrações podem ser escaladas cima ou para baixo depende do amostra disponível.
Nota: As amostras de solo seco podem ser peneiradas através de uma tela de 3 mm para homogeneizar e remover pedras e pequenas raízes. Não peneira de amos....
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Resultados
Quando o protocolo de mplexas foi usado para extrair as moléculas do solo de pradaria nativa de Kansas (um solo Mollisol), as análises de três vias previstas resultados 3376 peptídeos, 105 lipídios e 102 metabólitos polares (todas as identificações exclusivas). Enquanto o protocolo de mplexas tem sido bem estabelecido para geral extração de lipídios e metabolitos12,13,14,
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Discussão
É importante notar que nem todos os laboratórios terão o mesmo equipamento disponível para que certos métodos, por exemplo, a etapa de Lise, podem ser adaptados. Aqui usamos num Vortex e sonicating, no entanto, o uso de um batedor de grânulo grande 50ml funcionaria. Se não houver um Liofilizador com uma temperatura do coletor capaz de-105 º C, as amostras podem ser secos sob uma corrente de azoto. Também os tipos de solo variam muito e podem incluir areia, silte, argila, turfa e barro (etc), e também pode variar.......
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Divulgações
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Agradecimentos
Os autores gostaria de agradecer Nathan Johnson por sua assistência na elaboração de figuras. Esta pesquisa foi apoiada pelo programa Pan-omics que é financiado pelo departamento de energia dos Estados Unidos escritório de biológicos e pesquisa ambiental (programa de ciência genômica), o Microbiomes no desenvolvimento de pesquisas dirigido laboratório de transição (menta) Iniciativa no Pacific Northwest National Laboratory, bem como o nacional institutos de saúde nacionais Instituto de Ciências de saúde ambiental (R01 ES022190) e NIH (P42 ES027704). KEBJ gostaria de agradecer HD084788 R21 apoio financeiro desenvolver e validar as técnicas de extração multi-omic romanc....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Clorofórmio | Sigma-Aldrich | 650498 | Armazenado a -20° C ! Cuidado O clorofórmio tem efeitos potenciais agudos à saúde, irritação da pele e possíveis queimaduras químicas, irritação do sistema respiratório, pode afetar os rins, fígado, coração. Use óculos, roupas e luvas de proteção adequados, trabalhe em um exaustor. |
| Metanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Armazenado a -20° C ! Cuidado O metanol pode causar irritação do trato respiratório, da pele e dos olhos, pode danificar os nervos, rins e fígado. Use óculos, roupas e luvas de proteção adequados, trabalhe em um exaustor. |
| Água purificada do sistema de purificação de água Millipore Milli-Q | . | ||
| Dodecil sulfato de sódio | Sigma-Aldrich | L6026 | ! Cuidado O SDS causa toxicidade aguda e é inflamável. É um irritante para a pele, os olhos e as vias aéreas. Use luvas e óculos de segurança. |
| Kit de extração de proteína do solo | MoBio, Kit de extração de proteína do solo NoviPure, Qiagen | 30000-20 | |
| DL-ditiotreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| 1M Trizma HCL | Sigma-Aldrich | T2694 | |
| Ácido tricloroacético | Sigma-Aldrich | T0699 | ! Cuidado O TCA é cáustico, tóxico e pode causar queimaduras na pele. Use luvas e óculos de segurança. |
| Acetona | Sigma-Aldrich | 650501 | Armazenado a -20° C ! Cuidado A acetona pode causar irritação do trato respiratório e da pele e dos olhos. Líquido e vapor inflamáveis. Use óculos de segurança, luvas e jaleco, trabalhe em um exaustor. |
| Ureia | Sigma-Aldrich | 208884 | ! Cuidado A ureia é irritante para os olhos e a pele, use luvas e óculos de segurança |
| Bicarbonato de amônio | Fluka | 09830 | |
| Tripsina | Promega | V528A | 20µ g frascos Kit de |
| ensaio de proteína de ácido bicinchonínico | Pierce | 23227 | |
| Formato de amônio | Sigma-Aldrich | 09735 | |
| Acetonitrila | Sigma-Aldrich | 34998 | ! Cuidado A acetonitrila é um irritante para a pele e os olhos. Altamente inflamável. Use luvas e óculos de segurança. Trabalhe em uma capela de exaustão. |
| Ácido trifluoroacético | Sigma-Aldrich | T6508 | ! Cuidado O TFA é extremamente perigoso em caso de contato com a pele, contato com os olhos, ingestão e inalação. Pode produzir danos nos tecidos, particularmente nas membranas mucosas dos olhos, boca e trato respiratório. O contato com a pele pode produzir queimaduras. Use luvas, jaleco, óculos de segurança e trabalhe em um exaustor. |
| Cloridrato de metoxiamina | Sigma-Aldrich | 226904 | ! Cuidado O cloridrato de metoxiamina causa queimaduras graves e sérios danos aos olhos, pode causar sensibilização pelo contato com a pele. Use óculos de segurança, luvas e jaleco, trabalhe em um exaustor. |
| Piridina | Sigma-Aldrich | 270970 | ! Cuidado A piridina pode causar irritação na pele e nos olhos, depressão do sistema nervoso central. O vapor pode causar incêndio repentino. Use óculos de segurança, luvas e jaleco, trabalhe em um exaustor. |
| N-Metil-N-(trimetilsilil)trifluoroacetamida com 1% de trimetilclorossilano | Sigma-Aldrich | 69478 | ! Cuidado MSTFA + 1% TMCS pode causar corrosão da pele, sérios danos aos olhos e toxicidade de órgãos-alvo específicos. Líquido e vapor inflamáveis. Use óculos de segurança, luvas e jaleco, trabalhe em um exaustor. |
| Cloreto de potássio | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Sistema de purificação de água Milli-Q | Millipore | MPGP04001 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex Genie 2 |
| Sonda Sonicator | FisherBrand | modelo FB505 | |
| Centrífuga refrigerada | Eppendorf | modelo 5810R | |
| Tubo de 50mL rotor de caçamba oscilante | Eppendorf | A-4-44 | |
| Rotor de ângulo fixo de 50mL | Eppendorf | FA-45-6-30 | |
| Balance | OHAUS | modelo V22PWE150IT | |
| Controlador de pipeta sorológica | Eppendorf | 12-654-100 | |
| 10mL, 25mL pipetas sorológicas de vidro | FisherBrand | 13-678-27F, 13-678-36D | |
| Thermomixer com Thermotop | Eppendorf | 5382000015, 5308000003 | |
| 0,9 - 2,0 mm de mistura de contas de aço inoxidável | NextAdvance | SSB14B | |
| 0,15 mm contas de granada | MoBio | 13122-500 | |
| Placa de agitação magnética | FisherBrand | 11-100-16SH | |
| Barra de agitação magnética | FisherBrand | 14512130 | |
| tiras de papel de pH, pH intervalo 0– 14 | FisherBrand | M95903 | |
| 15mL, tubo de centrífuga cônico de polipropileno 50mL | Genesee Scientific | 21-103 21-108 | compatível com clorofórmio |
| 50mL | MoBio | 13000-V1-50 | |
| Balde de gelo | FisherBrand | 02-591-44 | |
| Frascos de vidro de 27.25x70mm | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Respirar Membranas de placa mais fáceis Midwest | Scientific | BERM-2000 | |
| Toalhetes com álcool | Diversified Biotech | BPWP-1000 | |
| Incubadora de agitador de aquecedor | Benchmark, Incu-Shaker Mini | ||
| Rotador de tubo de rotisserie analógico | SoCal BioMed, LLC | 82422001 | |
| Kit de preparação de amostras auxiliadas por filtro | FASP; Expedeon | 44250 | |
| Leitor de microplacas | Biotek, EPOCH-20 | ||
| Graus Celsius Freezer | Fisher | 13986149-80 | |
| Graus Celsius Freezer | Stirling Ultracold | SU78OUE | |
| Q-Exactive ion trap espectrômetro | de massa Cromatógrafo | ||
| Agilent 7890A acoplado a um único quadrupolo Espectrômetro de massa 5975C | Agilent Technologies, Inc. | ||
| LTQ-Orbitrap Velo | Thermo Scientific | ||
| Waters NanoEquityTM Sistema UPLC | Millford, MA | ||
| Frasco de mídia de 250mL | FisherBrand | 1395-250 | |
| Frasco de águas | Frasco | de | |
| MS e inserções | MicroSolv | 9502S-WCV, 9502S-02ND | |
| Glass Frasco de HPLC e tampas de pressão | MicroSolv | 9512C-0DCV, 9502C-10C-B | |
| Placa de 96 poços de HPLC | Agilent | 5042-6454 | |
| Frasco de vidro grande 27,25x70mm | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Liofilizador | Labconco | 7934021 | |
| Espátula de cabeça chata de aço inoxidável polido | Spoonula; FisherBrand | 14-375-10 | |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 34721 | |
| XBridge C18, 250x4.6 mm, 5 μ M com coluna de guarda de 4,6x20 mm | Waters | 186003117, 186003064 | |
| Sistema HPLC da série Agilent 1100 Agilent | Technologies | G1380-90000 | |
| Tubo de centrífuga de 1,7mL | Hamilton Sorenson | 11700 | |
| , 5mL, 50µ L e 250µ L | Hamilton | 81517, 80975, 81175 | |
| Pipetas Pasteur | FisherBrand | 13-678-20A | |
| Lâmpadas de Pipeta Pasteur | Sigma-Aldrich | Z111597 | |
| Bath Sonicator | Branson 1800 Limpador | ||
| Centrífuga a Vácuo | Sistema | ||
| Colunas MicroSpin, C18 Sílica | O Grupo Ninho | SEM SS18V |
Referências
- Hultman, J., et al. Multi-omics of permafrost, active layer and thermokarst bog soil microbiomes. Nature. 521, 208-212 (2015).
- White, R. A. 3rd, et al. Moleculo long-read sequencing facilitates assembly and genomic binning from com....
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Reimpressões e permissões
