Isolamento dos capilares cerebrais do tecido do cérebro humano fresco

Summary

Capilares do cérebro isolado do tecido do cérebro humano podem ser usados como um modelo pré-clínicos para estudar a função de barreira sob condições fisiológicas e fisiopatológicas. Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para isolar os capilares do cérebro do tecido do cérebro humano fresco.

Abstract

Função de barreira hemato - encefálica compreensão sob condições fisiológicas e fisiopatológicas é fundamental para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas que mantêm a promessa para melhorar a entrega de drogas do cérebro, melhorar a proteção do cérebro e tratar o cérebro transtornos. No entanto, estudando a função humana barreira sangue - cérebro é um desafio. Assim, há uma necessidade crítica de modelos adequados. A este respeito, os capilares do cérebro isolados do tecido do cérebro humano representam uma ferramenta única para estudar a função de barreira, como próximo a situação humana no vivo quanto possível. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para isolar os capilares do tecido do cérebro humano em um alto rendimento e com pureza e qualidade consistente. Capilares são isolados do tecido do cérebro humano fresco usando homogeneização mecânica, gradiente de densidade centrifugação e filtração. Após o isolamento, os capilares do cérebro humano podem ser usados para várias aplicações, incluindo ensaios de vazamento, imagem de célula viva e ensaios baseados em imunológico para estudar a expressão da proteína e função, atividade enzimática ou sinalização intracelular. Cérebro humano isolado capilares são um modelo exclusivo para elucidar o Regulamento da função humana barreira hemato - encefálica. Este modelo pode fornecer insights sobre patogênese do sistema nervoso central (SNC), que irá ajudar o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para o tratamento de doenças do SNC.

Introduction

A barreira sangue - cérebro é uma interface rigidamente controlada entre o sangue e o cérebro que determina o que entra e sai do cérebro. Anatomicamente, células endoteliais compõem a barreira sangue - cérebro e formam uma rede capilar complexa, contínua. Fisiologicamente, essa rede capilar fornece o cérebro com oxigênio e nutrientes ao simultaneamente eliminação de dióxido de carbono e produtos de resíduos metabólicos. Importante, a evidência suporta que as alterações para a barreira contribuam para inúmeras patologias, incluindo a doença de Alzheimer, epilepsia e acidente vascular cerebral^1,2,

Protocol

As informações abaixo baseia-se na atual segurança e as normas reguladoras da Universidade de Kentucky, Lexington, KY, EUA. Como uma precaução de segurança, consulte programa de segurança biológica da instituição e as mais atuais regulamentos e recomendações antes de trabalhar com tecido humano.

Atenção: O tecido humano pode ser uma fonte de patógenos transmitidos pelo sangue, incluindo o vírus de imunodeficiência humana (HIV), vírus da hepatite B (HBV), vírus da hepatite C (HCV) e outros. Trabalhar com tecido humano representa o risco de infecção por patógenos transmitidos pelo sangue. Portanto, certas considerações de segurança e regulame....

Results

Os isolamentos de tecido cerebral humano rendem uma suspensão enriquecida nos capilares do cérebro humano (figura 1B) com pequenas quantidades de vasos maiores, glóbulos vermelhos, outras células únicas e alguns detritos de células. Alguns capilares são ramificados, e, em alguns, os glóbulos vermelhos são aprisionados nos lúmens capilares. O capilar típico tem uma 3 – 7 µm de diâmetro e é aproximadamente 100-200 µm comprimento com lúmens abertos; a maioria da.......

Discussion

O presente protocolo descreve o isolamento dos capilares do cérebro humano intacto e viável de tecido fresco. Nesta seção, discutiremos em detalhes a seguir: 1) modificações para o protocolo 2) solução de problemas de erros comuns, 3) as limitações da técnica, 4) o significado do modelo em relação ao existente e modelos alternativos barreira hemato - encefálica, e 5). potenciais aplicações para capilares do cérebro humano isolado.

O protocolo descrito aqui é otimizado para 10 g de tecido do có.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipamento de Proteção Individual (EPI)
Diamond Grip Plus Luvas de látex, Microflex Medium	VWR, Radnor, PA, USA	32916-636
EPI Jalecos de proteção descartáveis	VWR, Radnor, PA, USA	470146-214	EPI; devido à natureza do material de origem humana, recomenda-se o uso de um jaleco descartável
Face Shield, descartável	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA	19460102	EPI; devido à natureza do material de origem humana, o uso de um protetor facial descartável é recomendado
Materiais
Clavies Sacos de Autoclave de Alta Temperatura 8 x 12	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA	01-815-6
Versi Papel de Bancada Seco 18" x 20"	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	14-206-32	para cobrir áreas de trabalho
VWR Sharps Container Systems	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	75800-272	para bisturis usados
Alvejante 8,2% Clorox Germicida 64 onças.	Centro de Abastecimento do Reino Unido, Lexington, KY, EUA	323775
Equipment
4 ° C Frigorífico	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	13-986-148
Accume BASIC AB15 Medidor de pH	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	AB15
Heidolph RZR 2102 Control	Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA	501-21024-01-3
Sorvall LEGEND XTR Centrifuge	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	75004521
Microscópio de dissecação Leica L2	Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, EUA		usado para remover meninges
POLYTRON PT2500 Homogeneizador	Kinematica AG, Luzern, Suíça	Escala 9158168
P-403	Denver Instrument, Bohemia, NY, EUA	0191392
Mini Stir padrão	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA	1151050
Frascos Térmicos de Nitrogênio Líquido Dewar	Thermal Scientific, Mansfiled, TX, EUA	11-670-4C	usado para congelar o tecido?
Balança Analítica Voyager Pro	OHAUS, Parsippany, NJ, EUA	VP214CN
ZEISS Axiovert Microcope	Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, EUA		costumava verificar capilares isolados
Tools and Glassware
Finnpipette II Pipeta 1-5 mL	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA	21377823T1	lavar capilares filtro
Pipeta Finnpipette II 100-1,000 µ L	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	21377821T1	ressuspender pellet em BSA
Pipet Boy	Integra, Hudson, NH, USA	739658
50 mL Falcon tubes 25/rack - 500/cs	VWR, Radnor, PA, USA	21008-951
EISCO Scalpel Blades	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	S95938C	para picar tecido cerebral
PARAFILM	VWR, Radnor, PA, EUA	52858-000	para cobrir o béquer e o frasco volumétrico
Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 mL	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	21-377-304	para lavar os capilares do filtro
Seringa de 60 mL com Luer-Lok	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA	BD309653	usado com anel conector para filtrar capilares
Cabo de bisturi #4	Ferramentas de Ciência Fina, Foster City, CA, EUA	10060-13	usado para picar
Fórceps Dumont #5	Ferramentas de Ciência Fina, Foster City, CA, EUA	11251-10	usado para remover meninges
Moedor de Tecidos Potter-Elvehjem	Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, EUA	3431E25	Volume de 50 mL, folga: 150-230 μ m
Homogeneizador Dounce	VWR, Radnor PA USA	62400-642	Volume de 15 mL, liquidação: 80-130 μ m
Filtros Tecidos Spectra/Mesh (300 µ m)	Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, EUA	146424	Usado para filtrar a suspensão capilar para remover quaisquer meninges que possam ser deixadas
pluriFiltros (tamanho do poro: 30 µ m)	pluriSelect Life Science, Leipzig, Alemanha	43-50030-03
Anel Conector	pluriSelect Life Science, Leipzig, Alemanha	41-50000-03	reutilizar várias vezes
1 L Balão			para preparação de Tampão de
Isolamento 1 L Copo			para preparação de Barra
			de Agitação BSA 1%para preparação de 1% BSA e Ficoll®
Schott Bottle (60 mL)			para preparação de Ficoll® Balde de gelo
Ice	para manter tudo frio
	Louis, MO, EUA	A9647-500g prepara-se	em DPBS com Ca2+ & Mg2+ no dia anterior. Evite bolhas durante o preparo. Guarde na geladeira. Mexa lentamente por 10 minutos antes de usar.
DPBS com Ca2+ & Mg2+	Hyclone	SH30264.FS	DPBS - parte do tampão de isolamento
Ficoll PM400	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	F4375	A medição exata é importante aqui. Pese em garrafa com barra de agitação. Agite vigorosamente após adicionar DPBS. Mantenha na geladeira O/N. Ficará claro pela manhã. Mexa delicadamente por 10-15 min antes de usar. Mantenha no gelo até o uso.
Glicose (D-(+) Dextrose)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	G7528	Concentração de glicose (D-(+) Dextrose): 5 mM
Solução padrão de hidróxido de sódio	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	71474	para ajustar o pH do
piruvato de sódio	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	P2256	Concentração: 1 mM