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Artigo de método

Isolamento dos capilares cerebrais do tecido do cérebro humano fresco

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DOI:

10.3791/57346

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12 de setembro de 2018

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1Sanders-Brown Center on Aging, Department of Pharmacology and Nutritional Sciences, University of Kentucky, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Kentucky, 3Department of Neuroscience, University of Kentucky

Neste artigo

Resumo

Capilares do cérebro isolado do tecido do cérebro humano podem ser usados como um modelo pré-clínicos para estudar a função de barreira sob condições fisiológicas e fisiopatológicas. Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para isolar os capilares do cérebro do tecido do cérebro humano fresco.

Resumo

Função de barreira hemato - encefálica compreensão sob condições fisiológicas e fisiopatológicas é fundamental para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas que mantêm a promessa para melhorar a entrega de drogas do cérebro, melhorar a proteção do cérebro e tratar o cérebro transtornos. No entanto, estudando a função humana barreira sangue - cérebro é um desafio. Assim, há uma necessidade crítica de modelos adequados. A este respeito, os capilares do cérebro isolados do tecido do cérebro humano representam uma ferramenta única para estudar a função de barreira, como próximo a situação humana no vivo quanto possível. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para isolar os capilares do tecido do cérebro humano em um alto rendimento e com pureza e qualidade consistente. Capilares são isolados do tecido do cérebro humano fresco usando homogeneização mecânica, gradiente de densidade centrifugação e filtração. Após o isolamento, os capilares do cérebro humano podem ser usados para várias aplicações, incluindo ensaios de vazamento, imagem de célula viva e ensaios baseados em imunológico para estudar a expressão da proteína e função, atividade enzimática ou sinalização intracelular. Cérebro humano isolado capilares são um modelo exclusivo para elucidar o Regulamento da função humana barreira hemato - encefálica. Este modelo pode fornecer insights sobre patogênese do sistema nervoso central (SNC), que irá ajudar o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para o tratamento de doenças do SNC.

Introdução

A barreira sangue - cérebro é uma interface rigidamente controlada entre o sangue e o cérebro que determina o que entra e sai do cérebro. Anatomicamente, células endoteliais compõem a barreira sangue - cérebro e formam uma rede capilar complexa, contínua. Fisiologicamente, essa rede capilar fornece o cérebro com oxigênio e nutrientes ao simultaneamente eliminação de dióxido de carbono e produtos de resíduos metabólicos. Importante, a evidência suporta que as alterações para a barreira contribuam para inúmeras patologias, incluindo a doença de Alzheimer, epilepsia e acidente vascular cerebral1,2,3,4,5 , 6 , 7. cérebro células endoteliais também servem como uma barreira ao tratamento, bloqueando a absorção de drogas no cérebro, por exemplo., quimioterapia de glioblastoma multiforme seguindo tumor ressecção8,9, 10. a este respeito, os capilares do cérebro humano isolado representam um único ex vivo modelo de barreira hemato - encefálica que se assemelha a barreira propriedades in vivo, que permite o estudo da função de barreira e disfunção em saúde e a doença. Neste artigo, nós fornecemos um protocolo para isolar os capilares do cérebro do cérebro humano em um capilar de consistentemente de alta qualidade e rendimento para estudar a barreira sangue - cérebro.

Em 1969, Siakotos et al. 11 foram os primeiros a relatar o isolamento dos capilares do cérebro do tecido cerebral bovina e humana usando densidade gradiente centrifugação e vidro do grânulo coluna separação. Mais tarde, Goldstein et al. 12 melhorado este método adicionando várias etapas de filtração para diminuir a quantidade de tecido necessário para estudar os capilares do cérebro isolados de ratos, mantendo a atividade metabólica de transporte de glicose. Desde então, pesquisadores otimizado o procedimento de isolamento capilar inúmeras vezes, melhorar o modelo capilar método e cérebro com cada iteração13,14,15. Por exemplo, Pardridge et al. 16 isolado bovina capilares usando digestão enzimática, ao invés de homogeneização mecânica e posteriormente passou uma suspensão capilar através de um filtro de malha de 210 µm e uma coluna de vidro do grânulo. Essas modificações melhoraram a mancha de exclusão trypan azul dos capilares do cérebro isolado e assim, aumentaram a viabilidade celular endotelial. No início de 1990, Damasceno et al. 17 isolado bovina e rato capilares que eram claras de contaminação neuronal e mantida a atividade metabólica de γ-glutamil transpeptidase (γ-GTase) e fosfatase alcalina. Em 2000, Miller et al. 18, usado isolado de rato e capilares do cérebro suínos em combinação com microscopia confocal para mostrar o acúmulo de substratos de transporte no lúmen dos capilares. Posteriormente, nosso laboratório tem continuado a otimizar o processo de isolamento capilar do cérebro e nós estabelecemos transporte ensaios para determinar a P-glicoproteína (P-gp)19,20,21, câncer de mama resistência da proteína (BCRP)22,23e proteína de resistência a múltiplas drogas 2 (Mrp2)24 atividade de transporte. Em 2004, publicou dois relatórios onde costumávamos capilares de cérebro de rato isolado para investigar diversas vias de sinalização. Em Hartz et al. 21, encontramos que o peptídeo endotelina-1 reversível e rapidamente reduzida função de transporte de P-gp em capilares cerebrais, actuando através do receptor (ETB) do receptor B de endotelina, óxido nítrico sintase (NOS) e proteína quinase C (PKC). Em Bauer et al . 19, temos demonstrado que a expressão do receptor nuclear receptor pregnane X (PXR) e mostrou PXR-modulação da função de expressão e transporte de P-gp em capilares do cérebro. Em experimentos com ratos transgénicos de PXR humanizados, nós expandidos nessa linha de pesquisa e mostrou na vivo de aperto da barreira por estrogenos P-gp através da ativação de hPXR25. Em 2010, Hartz et al. 26 usado essa abordagem para restaurar a expressão da proteína de P-gp e transportar a atividade em ratos transgénicos precursora amiloide humano proteína (hAPP) overexpress hAPP. Além disso, restaurando a P-gp no hAPP ratos reduziram significativamente níveis de cérebro de42Aβ e beta amiloide (Aβ)40.

Além de estudar a sinalização de caminhos, capilares de cérebro isolado podem ser usados para determinar as alterações na permeabilidade capilar que nos referimos como vazamento capilar. Em particular, o ensaio de fugas de Texas Red é usado para avaliar o escapamento do corante fluorescente Vermelho Texas do lúmen capilar ao longo do tempo e estes dados são usados para analisar taxas de fugas. Taxas de vazamento capilar aumentada em comparação com aqueles dos capilares de controle indicam alterações na integridade física da barreira hemato - encefálica2. Isto é valioso porque existem numerosos estados patológicos associados rompimento da barreira, por exemplo., epilepsia, esclerose múltipla, doença de Alzheimer e cerebral traumática lesão27,28,29, 30. Outros grupos também têm utilizado isolados capilares para discernir as vias de sinalização que regulam a expressão de proteínas e atividade de transporte de proteínas31,32,33,34, 35,36,37. Finalmente, continuamos a otimizar esse método para o isolamento dos capilares do cérebro humano e, recentemente, mostramos a expressão aumentada de P-gp no humana barreira hemato - encefálica, em pacientes com epilepsia, em comparação com indivíduos de controle livre de apreensão38 . Tomados em conjunto, estes desenvolvimentos demonstram que os capilares do cérebro isolado podem servir como um modelo versátil para estudar a função de barreira.

Vários in vivo, ex vivoe em vitro barreira hemato - encefálica modelos têm sido utilizados em pesquisa básica e rastreio de drogas industriais, principalmente com o objetivo de testar a entrega da droga para o cérebro39,40,41 ,42,,43,44. Além de isolados ex vivo capilares do cérebro, modelos atuais da barreira hemato - encefálica incluem modelos em silico , em vitro cultura celular de células endoteliais capilares do cérebro isolado ou linhas de células imortalizado de vários espécie, em vitro de cultura de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) que se diferenciar em células endoteliais capilares do cérebro e microfluidic modelos em um chip.

In silico modelos são mais usados no desenvolvimento de drogas para a seleção de candidatos a fármacos com base no previsto de absorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME) Propriedades. Métodos como modelos de relacionamento (QSPR) estrutura-Propriedade quantitativa e quantitativa estrutura-atividade relação (QSAR) são métodos populares usados na seleção da elevado-produção de bibliotecas para prever a penetração do cérebro de candidatos da droga 45 , 46. estes modelos são úteis para moléculas de tela para propriedades de penetração da barreira.

Betz et al 47 estabeleceu monocamadas de células endoteliais capilares do cérebro culta como um sistema de modelo em vitro barreira hemato - encefálica. Em vitro celular cultura modelos usando tecido fresco ou linhas de células endoteliais imortalizado como células endoteliais microvessel cerebral humana (hCMECs) podem ser outra ferramenta de seleção da elevado-produção para penetração do cérebro ou estudos mecanicistas. No entanto, modelos de cultura de células endoteliais capilares cerebrais faltam a tensão de cisalhamento fisiológico do fluxo de sangue para dentro do lúmen capilar, estão limitados a complexidade geral biológica e se submetem a mudanças na expressão e localização de componentes importante barreira como proteínas de junção apertada, íon, transportadores, enzimas e receptores de superfície canais48,,49,50. Inversamente, monocamadas endoteliais derivado hPSCs, tem permeabilidade de sacarose baixa em comparação com as culturas hCMEC/D3 e conter expressão polarizada de alguns transportadores barreira hemato - encefálica, moléculas de adesão e junções apertadas51, 52. no entanto, essas células também estão sujeitos a alteração de propriedades na cultura, e o sistema deve ser validado para sua recapitulação na vivo Propriedades barreira52.

Mais recentes tendências em pesquisa da barreira hemato - encefálica incluem utilizando sistemas de cultura de tecido 3D para criar capilares artificiais, usando a tecnologia do órgão-on-chip para gerar dispositivos microfluídicos, ou utilizando a tecnologia de fibra oca53, 54 , 55. capilares artificiais, no entanto, têm significativamente maiores diâmetros (100 – 200 µm) do que o cérebro os capilares (3 – 7 µm). Daí, o cisalhamento forças em vitro não totalmente se assemelham a situação na vivo . Esta mensagem é dirigida em dispositivos microfluídicos "blood-brain-barrier-on-a-chip", onde os compartimentos de "sangue" e "cérebro" de forma artificial de membranas e fluidos são bombeados através destes dispositivos, gerando forças de cizalhamento microfluidic. Da mesma forma, co culturas de células de músculo liso vascular e células endoteliais em várias combinações com astrócitos também têm sido usadas com a tecnologia de fibra oca para recriar reológicos parâmetros presentes na vivo condições56 , 57 , 58. no entanto, desconhece-se o quanto este modelo reflete outras propriedades da barreira sangue - cérebro, tais como transporte, metabolismo, sinalização e outros. Estes modelos capilar e chip artificiais são adequados para seleção da elevado-produção de drogas, mas as células usadas para gerar esses modelos também estão sujeitos a alterações durante a cultura.

Fatias de cérebro congelado e fixo ou cerebrais primários, culturas de células endoteliais capilares são modelos adicionais que podem ser usados paraestudar a microvasculatura humana5,59,60,61. Por exemplo, imuno-histoquímica do tecido cerebral fixa é usada para determinar a localização da proteína, e a expressão em saudável em relação ao tecido doente.

Além de fatias de tecido e os modelos em vitro capilares do cérebro descrito acima, recentemente isolados podem ser utilizados para estudar a função da barreira hemato - encefálica. As limitações deste modelo capilar isolada incluem a dificuldade para obter o tecido do cérebro humano fresco, ausência de astrócitos e neurônios e um processo de isolamento relativamente demorado. Uma vantagem do modelo capilar cerebral isolado é que este modelo se assemelha a situação na vivo e, portanto, pode ser usado para caracterizar a função de barreira e disfunção. Importante, ele também pode ser usado para discernir os mecanismos de sinalização usando uma infinidade de ensaios e técnicas moleculares3,19,,62,63.

Nosso laboratório tem acesso a ambos os tecidos frescos e congelados do cérebro humano através do centro de Sanders-Brown sobre o envelhecimento (IRB #B15-2602-M)64. Neste contexto, as autópsias seguem um protocolo padrão, cérebros são obtidos em < 4h e todos os procedimentos estão em conformidade com diretrizes de melhores práticas NIH Biospecimen65. Dado este acesso exclusivo ao tecido do cérebro humano, estabeleceu e otimizado um protocolo para isolar os capilares do cérebro do tecido do cérebro humano que resulta em um alto rendimento dos capilares do cérebro humano intacto, viável. Dois pontos de extremidade comuns de interesse são para determinar a expressão da proteína e atividade. A este respeito, nós e os outros estabeleceram vários ensaios que podem ser usados com os capilares do cérebro isolado para estudar a expressão da proteína e níveis de atividade. Estes ensaios incluem mancha ocidental, ensaio de Western simples, ensaio imunoenzimático (ELISA), reação em cadeia da polimerase transcrição reversa (RT-PCR), reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), zimografia, ensaios de atividade de transporte, e ensaios de vazamento capilar. Estes ensaios permitem aos pesquisadores estudar alterações na função de barreira em condições patológicas humanas, determinar caminhos que regem a atividade e expressão da proteína e identificar alvos farmacológicos para o tratamento da barreira hemato - encefálica associada doenças.

Tomados juntos, recentemente capilares do cérebro isolado podem servir como um modelo robusto e reprodutível a barreira sangue - cérebro. Especialmente, este modelo pode ser combinado com muitos ensaios diferentes para determinar uma grande variedade de pontos de extremidade para estudar a função de barreira.

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Protocolo

As informações abaixo baseia-se na atual segurança e as normas reguladoras da Universidade de Kentucky, Lexington, KY, EUA. Como uma precaução de segurança, consulte programa de segurança biológica da instituição e as mais atuais regulamentos e recomendações antes de trabalhar com tecido humano.

Atenção: O tecido humano pode ser uma fonte de patógenos transmitidos pelo sangue, incluindo o vírus de imunodeficiência humana (HIV), vírus da hepatite B (HBV), vírus da hepatite C (HCV) e outros. Trabalhar com tecido humano representa o risco de infecção por patógenos transmitidos pelo sangue. Portanto, certas considerações de segurança e regulamentação são imperativas, ao trabalhar com tecido humano para proteger o pessoal de laboratório. Trabalhar com tecido humano nos EUA requer um laboratório de nível 2 de biossegurança, bem como as precauções de segurança e formação de acordo com o NIH seção IV-B-7, OSHA Act de 1970 cláusula 5(a)(1) e programa de institucional de segurança biológica do usuário. Em geral, aprovação do Comitê institucional de biossegurança e/ou Conselho de revisão institucional deve ser obtida antes da realização de qualquer pesquisa envolvendo humanos materiais (tecido, fluidos corporais). O treinamento é necessário para todo o pessoal a trabalhar com materiais humanos e inclui treinamento de segurança do laboratório básico, por exemplo, químicos higiene e segurança do laboratório, bem como formação específica para a segurança biológica, resíduos perigosos e humanos patógenos transmitidos pelo sangue. Todo o pessoal a trabalhar com materiais humanos é altamente recomendado para obter vacinas de hepatite B, antes de trabalhar com materiais humanos. Pessoal é obrigado a usar equipamentos de proteção individual específico enquanto estiver trabalhando com materiais humanos, por exemplo., um jaleco algemado e uma cara de escudo e usando luvas de todos os tempos. Todo trabalho é realizado em uma armário de biossegurança (classe 2). Todos os equipamentos que vem no contato com materiais humanos e qualquer resíduos de materiais humanas é tratado adequadamente para evitar contaminação e/ou infecção do pessoal. Todos os equipamentos e as superfícies são limpas com 10% de etanol água sanitária e 75%, após cada procedimento envolvendo materiais humanos. Um derramamento com materiais humanos deve ser imediatamente limpas. Produtos vidreiros é esterilizado após cada utilização. Resíduos, incluindo os tecidos humanos não fixado, são coletado em um saco de resíduos de risco biológico rotulado e esterilizada. Farelos são coletados em um recipiente de punção e estanques rotulado como de risco biológico. Todos os resíduos de materiais humanos é Descartado de acordo com regulamentos de segurança biológica da instituição.

Nota: Nosso laboratório obtém amostras frescas córtex frontal de indivíduos falecidos, através do centro de Sanders-Brown sobre o envelhecimento (IRB #B15-2602-M). Critérios de inclusão são: inscrição no estudo de coorte longitudinal autópsia UK-ADC e um intervalo Post-Mortem (PMI) ≤ 4 h64. Autópsias sigam um protocolo padrão e todos os procedimentos estão em conformidade com diretrizes de melhores práticas NIH Biospecimen65. Um PMI curta de menos de 4 h é da maior importância para assegurar a viabilidade capilar depois de isolamento. Tecido fresco e congelado pode ser usado. Se o congelamento for necessário, tecido cerebral humano recentemente obtidos deve ser choque congelado em nitrogênio líquido e armazenado a-80 ° C. Tecido fresco ou descongelado deve ser armazenado no buffer de isolamento (veja abaixo) e processado rapidamente. Encontramos esse 10 gramas de tecido humano fresco rende cerca de 100 mg de capilares de cérebro (peso úmido).

1. instalação

  1. Preparação do amortecedor
    Nota: O volume de reserva necessária depende da quantidade de tecido. Todos os volumes de tampão no protocolo a seguir baseiam-se 10 g de tecido do córtex cerebral humano.
    1. L isolamento Buffer: Usar 1,5 L de fosfato salino de Dulbecco (DPBS; 2,7 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 136,9 milímetros de NaCl, Na2HPO4de 8,1 mM, 0.9 mM CaCl2, 0,49 mM MgCl2) e completar com 5 mM D-glicose (1,35 g ) e piruvato de sódio 1 mM (0,165 g). Depois de adicionar a glicose e piruvato, ajuste o pH 7,4 com hidróxido de sódio. Esfriar e guarde o buffer de 4 ° C antes de usar.
    2. Albumina de soro bovino (BSA): Adicione 10 g de pó de BSA a 1 L de tampão de isolamento para uma concentração final de BSA de 1%. Mexa lentamente para evitar bolhas, ajustar o pH 7,4 e armazenar a 4 ° C durante a noite. Imediatamente antes da utilização, misture suavemente; Evite a formação de bolhas para evitar a desnaturação da albumina.
    3. médio de gradiente de densidade: pesar 18 g de médio gradiente de densidade para um frasco de vidro e adicionar uma barra de agitação magnética. Adicione 60 mL de tampão de isolamento e agitar vigorosamente por 5 min até todo pó é suspenso. Loja durante a noite a 4 ° C, para permitir que o meio de gradiente de densidade dissolver. Mexa por 10 minutos antes do uso.
    4. Armazenar todos os buffers a 4 ° C; manter todas as ferramentas e buffers no gelo durante o procedimento de isolamento inteira. Misture todos os buffers antes do uso.
  2. Instalação experimental
    1. Monte o pilão do moinho Potter-Elvehjem tecido para o misturador eletrônico de sobrecarga. Coloque o moedor de tecido Potter-Elvehjem e o homogenizacao homogenizador com pilão no gelo sob o capô. Preparar uma malha de filtro de 300 µm (5 x 5 cm2), dobre-o para um cone e inserir e anexá-lo a um 50 mL tubo Falcon com fita (figura 1A).
    2. Coloque anéis conexão e filtros de tensão da pilha (tamanho de poros: 30 µm) em tubos Falcon de 50ml. Prepare os sacos de resíduos de risco biológico. Coloque equipamentos necessários na biossegurança do armário (ver Tabela de materiais).

2. preparação da amostra cérebro

Nota: A figura 1A mostra o gráfico de fluxo de trabalho do processo de isolamento todo descrito abaixo. Tecido cerebral humano pode originar-se de qualquer parte do córtex e pode ser usado fresco ou congelado. Tecido de cérebro congelado pode ser descongelado à temperatura ambiente (nenhum buffer; ~ 30 min para 10 g). Para obter resultados comparáveis, o tecido cerebral deve ser obtido com a mesma região do cérebro para cada experimento. Este protocolo é otimizado para fresco (PMI < 4h) córtex cerebral humano que não tenha sido congelado.

  1. Preparação do tecido do cérebro humano: documentar o peso do tecido cerebral. Todos os números do protocolo a seguir são apropriados para 10 g de tecido cerebral humano fresco. Coloque o tecido cerebral em uma placa de Petri de 100mm. Cuidadosamente, remova todas as meninges com fórceps. Use um bisturi para cortar a massa branca.
  2. Picagem de tecido do cérebro humano: corte o tecido do cérebro com cuidado e piquem-o com um bisturi. Carne moída por cerca de 5 min (pedaços de 2 a 3 mm). Transferi o tecido cerebral para o Potter-Elvehjem moedor de tecido. Adicione 30 mL de tampão de isolamento.
    Nota: As peças de tecido picada são difíceis de ver, desde que o tecido cerebral se transforma em mingau através do processo de picagem.

3. a homogeneização

  1. Moedor de tecido Potter-Elvehjem (autorização: 150 – 230 µm): homogeneizar cada amostra com 100 golpes à velocidade de 50 rpm homogenizador. Documente o tempo cada 25 traços e o tempo total necessário para 100 traçados. Consulte a tabela 1 para um protocolo proposto homogeneização; o tempo total para homogeneização de 10 g de córtex frontal humano é cerca de 22 min. Não mexa no ar para evitar bolhas.
  2. Homogenizador homogenizacao (autorização: 80-130 µm): transferir o homogeneizado para um homogenizador homogenizacao no gelo. Homogeneizar a suspensão com 20 golpes (~ 6 s/curso, total de ~ 2 min). Evite bolhas.

4. centrifugação

  1. Distribua o cérebro homogenate igualmente em quatro tubos de centrifugação de 50 mL e o volume total do homogenate de documento. Distribua 50 mL de tampão de gradiente de densidade para os tubos de centrifugação (12,5 mL por tubo). Use 10 mL de tampão de isolamento para enxaguar o pilão e homogenizador e distribuir para os quatro tubos de centrifugação (~2.5 mL por tubo).
  2. Feche os tubos de centrífuga com tampas. Misture o homogeneizado, médio gradiente de densidade e tampão agitando vigorosamente os tubos. Centrifugar a 5.800 x g durante 15 min a 4 ° C (rotor de ângulo fixo); Seleccione uma velocidade de desaceleração média para manter o sedimento ligado ao tubo. Desprezar o sobrenadante e ressuspender cada em 2 mL de 1% de BSA.

5. filtração

Nota: Para separar os capilares de glóbulos vermelhos e outros detritos celulares, são necessárias várias etapas de filtração.

  1. 300 µm de malha: após a re-suspensão a pelota, filtrar a suspensão através da malha de 300 µm. Os capilares são filtrados através da malha, que navios maiores e restos de cérebro maiores continuam na malha. Lave cuidadosamente a malha com até 50 mL de 1% de BSA. Descarte a malha.
    Nota: Esta etapa de filtração limpa a suspensão capilar de qualquer maiores navios ou pedaços de detritos de cérebro.
  2. Filtro de tensão de célula 30 µM
    Nota: Esta etapa de filtração separa capilares de glóbulos vermelhos e outros restos de cérebro.
    1. Distribua o filtrado capilar da etapa 6.1 sobre os filtros de tensão de célula de cinco 30 µm (cerca de 10 mL do filtrado capilar por filtro de tensão de célula). Os capilares estão retidos por este filtro, Considerando que as células vermelhas do sangue, outras células únicas e restos de cérebro pequeno passam através do filtro e são recolhidos no filtrado.
    2. Lave cada filtro com 25 mL de 1% de BSA. Depois, despeje todos os filtrados sobre o sexto filtro para aumentar o rendimento. Lavar cada filtro com 50 mL de 1% de BSA; manter a célula estirpe filtros com contendo os capilares e descartar o filtrado.

6. coleção capilar

  1. Vire os filtros e lave os capilares com 50 mL de 1% de BSA para cada filtro em tubos de 50 mL. Levemente aplique pressão com a ponta da pipeta de uma pipeta de 5 mL e movê-lo do outro lado do filtro para lavar os capilares do cérebro.
  2. Certifique-se de lavar todos os capilares do cérebro, especialmente a partir da borda do filtro. Evite bolhas, pois isto dificulta o processo de filtração e aumenta a chance de perda capilar.

7. lavar roupa

  1. Depois de coletar os capilares, centrifugue todas as amostras a 1.500 x g durante 3 min a 4 ° C (balançando o balde do rotor). Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em aproximadamente 3 mL de tampão de isolamento. Combine todos os chumbos ressuspensão de uma amostra em um tubo cônico de 15 mL e preenchê-lo com o tampão de isolamento. Centrifugar novamente a 1.500 x g durante 3 minutos a 4 ° C e lavar duas vezes mais.
  2. Documente a pureza capilar com um microscópio (ampliação de 100 X) e câmera (figura 1B).
    Nota: O rendimento de cérebro capilar de 10 g de tecido do cérebro humano é geralmente de cerca de 100 mg. Os capilares do cérebro isolado agora podem ser usados para experiências, processadas (ex., lisado, isolamento de membrana), ou ser congelado e armazenado a-80 ° C em cryotubes por um período mínimo de 6-12 meses (evitar vários ciclos de congelamento e descongelamento).

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Resultados

Os isolamentos de tecido cerebral humano rendem uma suspensão enriquecida nos capilares do cérebro humano (figura 1B) com pequenas quantidades de vasos maiores, glóbulos vermelhos, outras células únicas e alguns detritos de células. Alguns capilares são ramificados, e, em alguns, os glóbulos vermelhos são aprisionados nos lúmens capilares. O capilar típico tem uma 3 – 7 µm de diâmetro e é aproximadamente 100-200 µm comprimento com lúmens abertos; a maioria da...

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Discussão

O presente protocolo descreve o isolamento dos capilares do cérebro humano intacto e viável de tecido fresco. Nesta seção, discutiremos em detalhes a seguir: 1) modificações para o protocolo 2) solução de problemas de erros comuns, 3) as limitações da técnica, 4) o significado do modelo em relação ao existente e modelos alternativos barreira hemato - encefálica, e 5). potenciais aplicações para capilares do cérebro humano isolado.

O protocolo descrito aqui é otimizado para 10 g de tecido do có...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Queremos agradecer e reconhecer o Dr. Peter Nelson e Sonya Anderson no banco de tecidos do cérebro de UK-ADC para fornecer o cérebro humano todas as amostras de tecido (número de concessão de NIH: P30 AG028383 do Instituto Nacional do envelhecimento). Agradecemos a Matt Hazzard e Tom Dolan, serviços de tecnologia da informação, tecnologia acadêmica e engajamento de professores, Universidade de Kentucky para assistência gráfica. Este projecto foi apoiado pelo 1R01NS079507 número da concessão do Instituto Nacional de Disorders Neurological e curso (para B.B.) e 1R01AG039621 número de concessão do Instituto Nacional sobre o envelhecimento (para A.M.S.H).. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de distúrbios neurológicos e derrame ou do Instituto Nacional sobre envelhecimento. Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

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Materiais

Chemicals
Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Equipamento de Proteção Individual (EPI)
Diamond Grip Plus Luvas de látex, Microflex MediumVWR, Radnor, PA, USA32916-636
EPI Jalecos de proteção descartáveisVWR, Radnor, PA, USA470146-214EPI; devido à natureza do material de origem humana, recomenda-se o uso de um jaleco descartável
Face Shield, descartávelThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA19460102EPI; devido à natureza do material de origem humana, o uso de um protetor facial descartável é recomendado
Materiais
Clavies Sacos de Autoclave de Alta Temperatura 8 x 12Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA01-815-6
Versi Papel de Bancada Seco 18" x 20"Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA14-206-32para cobrir áreas de trabalho
VWR Sharps Container SystemsThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA75800-272para bisturis usados
Alvejante 8,2% Clorox Germicida 64 onças.Centro de Abastecimento do Reino Unido, Lexington, KY, EUA323775
Equipment
4 ° C FrigoríficoThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA13-986-148
Accume BASIC AB15 Medidor de pHThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USAAB15
Heidolph RZR 2102 ControlHeidolph, Elk Grove Village, IL, USA501-21024-01-3
Sorvall LEGEND XTR CentrifugeThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA75004521
Microscópio de dissecação Leica L2Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, EUAusado para remover meninges
POLYTRON PT2500 HomogeneizadorKinematica AG, Luzern, SuíçaEscala 9158168
P-403Denver Instrument, Bohemia, NY, EUA0191392
Mini Stir padrãoThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA1151050
Frascos Térmicos de Nitrogênio Líquido DewarThermal Scientific, Mansfiled, TX, EUA11-670-4Cusado para congelar o tecido?
Balança Analítica Voyager ProOHAUS, Parsippany, NJ, EUAVP214CN
ZEISS Axiovert MicrocopeCarl Zeiss, Inc Thornwood, NY, EUAcostumava verificar capilares isolados
Tools and Glassware
Finnpipette II Pipeta 1-5 mLThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA21377823T1lavar capilares filtro
Pipeta Finnpipette II 100-1,000 µ LThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA21377821T1ressuspender pellet em BSA
Pipet BoyIntegra, Hudson, NH, USA739658
50 mL Falcon tubes 25/rack - 500/csVWR, Radnor, PA, USA21008-951
EISCO Scalpel BladesThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USAS95938Cpara picar tecido cerebral
PARAFILMVWR, Radnor, PA, EUA52858-000para cobrir o béquer e o frasco volumétrico
Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 mLThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA21-377-304para lavar os capilares do filtro
Seringa de 60 mL com Luer-LokThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUABD309653usado com anel conector para filtrar capilares
Cabo de bisturi #4Ferramentas de Ciência Fina, Foster City, CA, EUA10060-13usado para picar
Fórceps Dumont #5Ferramentas de Ciência Fina, Foster City, CA, EUA11251-10usado para remover meninges
Moedor de Tecidos Potter-ElvehjemThomas Scientific, Swedesboro, NJ, EUA3431E25Volume de 50 mL, folga: 150-230 μ m
Homogeneizador DounceVWR, Radnor PA USA62400-642Volume de 15 mL, liquidação: 80-130 μ m
Filtros Tecidos Spectra/Mesh (300 µ m)Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, EUA146424Usado para filtrar a suspensão capilar para remover quaisquer meninges que possam ser deixadas
pluriFiltros (tamanho do poro: 30 µ m)pluriSelect Life Science, Leipzig, Alemanha43-50030-03
Anel ConectorpluriSelect Life Science, Leipzig, Alemanha41-50000-03reutilizar várias vezes
1 L Balãopara preparação de Tampão de
Isolamento 1 L Copopara preparação de Barra
de Agitação BSA 1%para preparação de 1% BSA e Ficoll®
Schott Bottle (60 mL)para preparação de Ficoll® Balde de gelo
Icepara manter tudo frio
Louis, MO, EUAA9647-500g prepara-seem DPBS com Ca2+ & Mg2+ no dia anterior. Evite bolhas durante o preparo. Guarde na geladeira. Mexa lentamente por 10 minutos antes de usar.
DPBS com Ca2+ & Mg2+HycloneSH30264.FSDPBS - parte do tampão de isolamento
Ficoll PM400Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAF4375A medição exata é importante aqui. Pese em garrafa com barra de agitação. Agite vigorosamente após adicionar DPBS. Mantenha na geladeira O/N. Ficará claro pela manhã. Mexa delicadamente por 10-15 min antes de usar. Mantenha no gelo até o uso.
Glicose (D-(+) Dextrose)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUAG7528Concentração de glicose (D-(+) Dextrose): 5 mM
Solução padrão de hidróxido de sódioSigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA71474para ajustar o pH do
piruvato de sódioSigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUAP2256Concentração: 1 mM
de Segurança Volumétrico Placa de Petri de 100 mm para picar tecido cerebral Raspador de células de cultura de tecidos VWR, Radnor, PA, EUA 89260-222 para remover o sobrenadante após centrifugaçãoBSA Fraction V, A-9647 Sigma-Aldrich, St. DPBS

Referências

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