Artigo de método

Co de expressão de várias proteínas da fusão fluorescente quimérico de forma eficiente em plantas

DOI:

10.3791/57354

⸱

1 de julho de 2018

 ,  , 
1College of Life Sciences, South China Agricultural University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Temos desenvolvido um novo método para expressar co várias proteínas da fusão fluorescente quimérico em plantas para superar as dificuldades dos métodos convencionais. Ele tira vantagem do uso de um plasmídeo de expressão única que contém várias proteínas funcionalmente independentes expressando cassettes para alcançar expressão co de proteína.

Resumo

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Informações sobre a spatiotemporal localization(s) subcelular de uma proteína são fundamentais para entender suas funções fisiológicas nas células. Proteínas fluorescentes e geração de proteínas fluorescentes fusão tem sido usados descontroladamente como ferramenta eficaz Visualizar diretamente a localização da proteína e a dinâmica nas células. É especialmente útil para compará-los com marcadores de organela conhecido depois da expressão co com a proteína de interesse. No entanto, abordagens clássicas co na expressão de proteínas em plantas geralmente envolvem múltiplos plasmídeos de expressão independente e portanto tem inconvenientes que incluem eficiência baixa expressão co e variação do nível de expressão do que na hora despesas em cruzamento genético e triagem. Neste estudo, descrevemos um método robusto e inovador para expressão co de múltiplas proteínas fluorescentes quiméricoes em plantas. Ele supera as limitações dos métodos convencionais usando um vetor de expressão única que é composto de várias fitas expressando semi-independentes. Cada gaveta de expressão da proteína contém seus próprios elementos de expressão de proteínas funcionais, e, portanto, pode ser ajustado com flexibilidade para atender à demanda diversificada de expressão. Além disso, é fácil e conveniente para realizar a montagem e manipulação de DNA fragmentos no plasmídeo de expressão por meio de uma reação de uma etapa otimizado sem digestão adicional e passos de ligadura. Além disso, é totalmente compatível com tecnologias atuais de bio-imagem fluorescente proteínas derivadas e aplicações, tais como o traste e BiFC. Como uma validação do método, utilizamos este novo sistema receptor de classificação vacuolar express co fluorescente fundido e proteínas de membrana transportadora secretoras. Os resultados mostram que suas localizações subcellular perspectiva são os mesmos como em estudos anteriores pela expressão transiente e transformação genética em plantas.

Introdução

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Proteínas quiméricas fluorescente fusão tem sido consideradas como ferramentas úteis para estudar a dinâmica intracelular e Localização subcellular e entender melhor suas funções fisiológicas e trabalho mecanismos1,2, 3 , 4. é especialmente benéfico para as proteínas de repórter de organela conhecido co express com a proteína em questão para ilustrar melhor sua lógica spatiotemporal, distribuição e funções dentro do sistema endomembranoso em células4 , 5 ,

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Protocolo

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1. primer Design estratégia e amplificação de DNA

  1. Desenha os primers para clonagem molecular de fragmentos de DNA. Os primers compõem 20 sequências de ligação específica do gene de bp e 20 a 25 bp-extremidade 5' saliência sequências, que são a sequência complementar sobreposição de moléculas de DNA adjacentes (ver tabela 1 , por exemplo).
    Nota: A montagem posterior de cada DNA fragmentos, enlace de cassettes de expressão de diferentes proteínas, e integração com o vetor de expressão final todos dependem de reconhecimento das sequências adjacentes sobrepostos.
  2. Amplificar fragmentos de DNA, incluindo o promotor, repórter fluoresce....

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Resultados

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Nós desenvolvemos um método robusto e altamente eficiente para a expressão co de múltiplas proteínas quiméricas fusão fluorescente em plantas. Ele rompe as barreiras do convencional abordagens usam múltiplos plasmídeos separados co na expressão de proteínas, como mostrado na figura 1A, B, através de expressão transiente ou transformação genética estável. Neste novo método, geramos um vetor de expressão única que é composto de várias .......

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Discussão

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Aqui temos demonstrado um método novo expressar robustamente co proteínas quiméricas fusão fluorescente em plantas. Ele pode ser usado tanto para expressão transiente e transformação genética e é compatível com o atual fluorescentes à base de proteínas de bio-imagem, moleculares e bioquímicos aplicativos e tecnologias9,10,13 . Além disso, ele supera as dificuldades dos métodos convencionais que usam vários plasmídeos de expressã.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Agradecemos os membros do laboratório de discussões úteis e comentários Wang. Este trabalho é apoiado pela Nacional Natural Science Foundation da China (NSFC, grant, n. º 31570001) e a Fundação ciência Natural da província de Guangdong e cidade de Guangzhou (conceder 201707010024 e n. º 2016A030313401) para H.W.

....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Polimerase KOD-FXTOYOBOKFX-101
Sma INEBR0141L/S/V
Tris-HClBBIA600194-0500
MgCl2BBIA601336-0500
dNTPNEB#N0447V
DTTBBIC4H10O2S2
PEG 8000BBIA100159-0500
NADBBIA600641-0001
T5 exonucleaseEpicentroT5E4111K
Polimerase de DNA de alta fidelidade de fusoNEBM0530S
Taq DNA polimeraseNEBB9022S
Murashige e Skoog Mistura de Sal Basal (MS)SigmaM5524
EtanolBBIA500737-0500
Tween 20BBIA600560-0500
AgarBBIA505255-0250
SpermidineBBIA614270-0001
Partículas microtransportadoras de ouroBio-Rad165-22631.0 µ m
CaCl2BBICD0050-500
MacrotransportadoresBio-Rad165-2335
Disco de rupturaBio-Rad165-2329
Tela de paradaBio-Rad165-2336
TriptonaOXOIDLP0042
Extrato de leveduraOXOIDLP0021
NaClBBIA610476-0001
KClBBIA610440-0500
GlicoseBBIA600219-0001
Higromicina BGenviewAH169-1G
WortmanninSigmaF9128
Brefeldin ASigmaSML0975-5MG
Dimetilsulfóxido (DMSO)BBIA600163-0500
T100 TermocicladorBio-RadCâmara de crescimento 1861096
PanasonicMLR-352H-PC
PSD-1000/He sistema de entrega de partículasBio-Rad165-2257
Pulsador de genesBio-Rad1652660
CubetaBio-Rad1652083
Centrífuga de bancadaEppendorf5427000097
Microscópio confocalZeiss LSM7 DUO (780& 7Live)
NanoDrop 2000 / 2000c EspectrofotômetrosThermo Fisher ScientificND-2000
EPS-300 Fonte de alimentaçãoTanonEPS 300
microscópio fluorescenteMshotMF30
AgroseBBIA600234
ampicilinaBBIA100339
etileno diamina tetraacetie ácidoBBIB300599

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  2. Tsien, R. Y., Miyawaki, A. Seeing the machinery of live cells. Science. 280 (5371), 1954-1955 (1998).
  3. Wang, H.

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