Artigo de método

Microdissection de segmentos de tecido Renal primária e incorporação com tecnologia de construção romance livre de andaime

DOI:

10.3791/57358

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27 de março de 2018

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1Department of Surgery, Medical University of South Carolina

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Engenharia de tecido renais construções oferecem uma solução para a escassez de órgãos e os efeitos deletérios da diálise. Aqui, descrevemos um protocolo para micro dissecar murino rins para isolamento dos segmentos córtico-medular. Esses segmentos são implantados livre de andaime celular construções, formando organoids renal.

Resumo

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Transplante de rim é agora uma terapia convencional para o estágio final da doença renal. No entanto, com cerca de 96.000 pessoas na lista de espera e apenas um quarto desses pacientes realizar o transplante, há uma grande necessidade de alternativas para aqueles com falência de órgãos. A fim de diminuir as consequências prejudiciais da diálise juntamente com os custos globais de saúde incorre, investigação está em curso em busca de soluções alternativas para a transplantação de órgãos. Implantáveis engenharia de tecido renais celulares construções são uma tal abordagem viável para substituir a funcionalidade renal perdida. Aqui, descrita pela primeira vez, é o microdissection dos rins murino para isolamento de vida córtico segmentos renais. Esses segmentos são capazes de rápida incorporação dentro de construções de andaime-free endotelial-fibroblasto que lhe permitam conexão rápida com a vasculatura hospedeiro uma vez implantada. Os rins do rato adulto foram colhidos em dadores vivos, seguidos pelo estereoscópio microdissection obter segmentos renais 200-300 µm de diâmetro. Várias construções renais foram fabricadas usando segmentos renais primários, colhidos a partir de apenas um rim. Este método demonstra um procedimento que poderia salvar o tecido renal funcional de órgãos que seria caso contrário serão descartados.

Introdução

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Doença renal crônica (DRC) é um do atual saúde pública desafios em todo o mundo1. A prevalência de DRC nos Estados Unidos é mais 14% do total da população, com mais de 600.000 americanos sofrem de forma mais severa, estágio final da doença renal (DRT)2. As atuais opções de tratamento disponíveis para aqueles com DRT incluem transplante renal e diálise. Apesar de aproximadamente 25.000 pacientes submetidos a transplante renal a cada ano, um número significativo de pacientes é adicionado anualmente levando a uma grande disparidade entre aqueles que aguardam um órgão de salvamento e aqueles recebendo transplante

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Protocolo

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Todos os procedimentos cirúrgicos animais descritos abaixo foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e usar Comité (IACUC) na Medical University of South Carolina, antes de qualquer animais cirurgias ou uso de quaisquer tecidos animais.

1. murino nefrectomia

  1. Não uma máscara cirúrgica e tampão bouffant para minimizar o risco de contaminação. Manter a esterilidade durante a configuração da área cirúrgica.
    1. Coloque cortinas cirúrgicas não-fenestrado na mesa de operação.
    2. Abre a mochila de instrumentos esterilizados para as cortinas estéril. Os instrumentos necessários para nefrectomia incluem 3 hemostatos ....

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Resultados

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O protocolo descrito produz aproximadamente 50 segmentos renais por seção de3 mm 2 piramidal do tecido renal. Os segmentos renais que foram processados e fotografados tem componentes tubulares e glomerulares em proporções diferentes (ver Figura 2). Os segmentos intactos foram submetidos a um ensaio para determinar a viabilidade de diferentes segmentos de uma vez a cada 24 horas durante três dias. Verde-fluorescente calceína-AM está presente com ati.......

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Discussão

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Métodos usados para projetar o tecido renal vivo construções variam bastante no que se refere o tipo de células e biomateriais utilizados e em muitos casos, estão desatualizados ou não bem caracterizadas na literatura7. Enquanto muitos estão usando células-tronco abordagens ou sintetizando os componentes individuais da arquitetura renal isoladamente, é a perspectiva de recriar artificialmente um órgão inteiro com mais de 26 tipos diferentes de células diferenciadas de suspensões celulares esmagado.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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NIH institucional formação pós-doutoral Grant, NIH-HL-007260

....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Descartáveis hospitalares Bussede campo estéreis não fenestrados696
Descartáveis hospitalaresestéreis Fenestrados697
Pinças de mosquito Halsted 5 MiltexMil-7-4"Hemostat" curvo no manuscrito
Pinça Graefe extra fina, curvada com dentesFerramentas de ciência fina11155-10Pinça fina com dentes
Pinça Graefe Extra Fina, Serrilhada (sem dentes)Fine Science Tools11152-10Pinça Fina sem dentes
Tesoura Fina - Carboneto de TungstênioFine Science Tools14568-09Tesoura de Íris
Betadine Esfoliante Cirúrgico com Bomba, Povidona-iodo 7.5%Purdue Products L.P.67618-151-17
Almofada de gaze de algodão estéril (4" x 4")Fisher Healthcare22-415-469
Solução tamponada com fosfato de DulbeccoCorning21-030-CV
Solução de penicilina/estreptomicina, 100XCorning30-002-Cl
Isoflurano, USPFabricante: Piramal, Distribuidor: McKesson2254845
Removedor de PêlosNairNair 22600-23307Creme de Depilação em texto
200 Prova de EtanolDecon Laboratories2705Diluído a 70% Solução
de Etanol BioLite 60mm Prato de Cultura de TecidosThemo-Scientific130181
Press'n SealGlad12587-70441Aplicado ao Estereoscópio
SZX16 Microscópio EstéreoOlympusIluminador de Fibra Óptica SZX16
Cole Parmer41720-20
Tubo Autossustentável de Luz Dupla, 23" L GooseneckCole ParmerEW-41720-60
Cabo de Bisturi #3Estéril MiltexMil-4-7
Tamanho da Lâmina 15Bard-Parker371115
Agulha de Calibre 31 1/2ThermoFisher Scientific14-826FBecton Dickinson 305106
Dulbecco's Modified Eagle's MediumCorning10-017-CV
Fetal Select 100% Soro BovinoAtlas BiologicalsFS-0500-AD
Fibroblastos Dérmicos Humanos NormaisLonzaCC-2511
Células Endoteliais Microvasculares Adiposas HumanasLaboratórios de Pesquisa Sciencell7200
Lupas cirúrgicas (2,5x)Orascoptic(N / A) Custom Order
FGM-2 (Fibroblasto Basal Medium com FGM-2 SingleQuots Adicionados)LonzaCC-3131, CC-4126
EGM-2 (Endotelial Basal Medium com EGM-2 SingleQuots Adicionados)LonzaCC-3156, CC-4176
Live / Dead Viability / Cytotoxicity Kit para Células de MamíferosThermoFisher ScientificL3224
Anticorpo anticitoqueratina-18Abcamab668
IgG anti-camundongo de cabra, Alexa Fluor 633ThermoFisher ScientificA-21052
IgG anti-coelho de cabra, Alexa Fluor 546ThermoFisher ScientificA-11010
Anticorpo anti-fator de Von WillebrandAbcamab6994
Albumina, isotiocianato de fluoresceína ConjugadoSigma AldrichA9771-50MG
Hoescht 33342BD Pharmingen561908
Antecedentes BusterInnovex BiosciencesNB306
Lâmina de Aço Carbono ,

Referências

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  1. Jha, V., et al. Chronic kidney disease: global dimension and perspectives. Lancet. 382 (9888), London, England. 260-272 (2013).
  2. 2016 USRDS Annual Data Report: Epidemiology of Kidney Disease in the United States. U.S.R.D. , Available from: https://www.usrds.org/2016/download/v2_ESRD_16.pdf (2016).
  3. Hart, A., et al.

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