Micromanipulação de cromossomos em espermatócitos insetos

Resumo

Neste protocolo, descrevemos a seleção e a preparação de células adequadas para micromanipulação e o uso de um micromanipulador piezoelétrico para reposicionar os cromossomos dentro dessas células.

Resumo

A micromanipulação de cromossomos tem sido um método essencial para iluminar o mecanismo para congression do cromossomo, o ponto de verificação do eixo e movimentos de cromossomo anáfase e tem sido a chave para entender o que controla os movimentos do cromossomo durante a divisão celular. Um biólogo especializado pode usar um micromanipulador para desanexar cromossomos do eixo, para reposicionar cromossomos dentro da célula e para aplicar forças aos cromossomas usando uma agulha de vidro pequeno com uma ponta muito fina. Enquanto que as perturbações podem ser feitas para cromossomos usando outros métodos, como armadilhas ópticas e outros usos de um laser, até à data, nenhum outro método permite o reposicionamento dos componentes celulares na escala de dezenas a centenas de micra, com pouco ou nenhum dano à célula .

A seleção e preparação de células adequadas para a micromanipulação de cromossomos, especificamente, descrevendo a preparação do gafanhoto e grilo culturas primárias de maturação para o uso em imagem latente da viver-pilha e micromanipulação, são descritos aqui. Além disso, mostramos a construção de uma agulha a ser usado para mover-se com uma agulha de vidro acompanhada de cromossomos dentro da célula e o uso de um micromanipulador piezoelétrico controlado por joystick para reposicionar os cromossomos dentro das células de divisão. Um resultado de exemplo mostra o uso de um micromanipulador para desanexar um cromossomo de um eixo em uma maturação primário e reposicionar esse cromossomo dentro da célula.

Introdução

Micromanipulação revelou partes do mecanismo de um cromossoma congression, o ponto de verificação do eixo e movimentos de cromossomo anáfase. A mais antiga publicação descrevendo os resultados de experimentos de micromanipulação foi por Robert Chambers¹. Câmaras usado um micromanipulador mecânica com uma agulha de vidro anexado para sondar o citoplasma de um número de diferentes tipos de células. Infelizmente, os métodos de contraste que permitiu a visualização dos cromossomos e muitos outros componentes celulares em células vivas não estavam disponíveis na época, para que experimentos de Chambers não podem mostrar os efeitos de reposicionament....

Protocolo

1. preparação da cultura de pilha de maturação insetos primários para micromanipulação

1. Preparação de slide
   1. Obter uma lâmina de vidro de 75 mm x 25 mm com um orifício circular de 20 mm de diâmetro cortado no centro do slide.
      Nota: Estas foram cortadas de uma única folha de janela de vidro do tamanho de uma lâmina de vidro com um buraco no centro.
   2. Executar uma lamela de 25 x 25 mm #1.5 através de uma chama de bico de Bunsen 2 s.
   3. Aplique lubrificante vácuo ao redor da borda do furo no vidro slide
   4. Coloca a lamela sobre o buraco como na Figura 1. Pressione-o e certifique-se de forma a um se....

Resultados

A Figura 6 mostra uma micromanipulação de amostra de 2 espermatócitos primários de gafanhoto adjacentes em vários exemplos dos possíveis usos de micromanipulação. Esta experiência foi feita usando um microscópio de contraste de fase invertida,. A 0:00 (tempos mostrados estão em min:s) imagem mostra ambas as células antes da manipulação. Um cromossomo na célula inferior é mostrado sob tensão aplicada pela agulha micromanipulação (0:05; preto seta) e então comp.......

Discussão

Com a prática, a se mover cromossomos na célula pode se tornar segunda natureza. Agulhas que são suficientemente rígida e suficientemente fina com ponta são difíceis de "pegar o jeito de" fabricando, mas essa capacidade também vem com a prática. Agulhas, que são tão finas que eles deformam quando mudei o óleo halocarbono não será útil para empurrar os cromossomos na célula. Agulhas, que são tão blunt que suas dicas são visíveis e tão grande como 1/3 da largura de um cromossoma (ou maior) é muito prováveis matar a célula........

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Vidro de micro cobertura VWR	VWR	48366 249	25 mm x 25 mm, não 1.5
Graxa de Vácuo de Alta Temperatura Dow Corning	VWR	AA44224-KT
KEL-F Óleo #10	Valley Specialty Chemical	10189
, Aço Inoxidável	Sigma-Aldrich	S3271-1EA
Dumont #5 fine foreceps	Fine Science Tools	11254-20
0,85 mm de diâmetro externo, 0,65 mm de diâmetro interno Tubo de vidro Pyrex	Ordem	feita sob encomenda científica de Drummond--ligue ao pedido
Microscópio invertido, do contraste da fase com o objetivo deampliação 10X ou 16X e o objetivo alto da ampliação 60X ou 100X Algum	microforge do tipo
	construído sob medida ou micromanipulador de Narashige	MF-900
	construído sob medida ou Burleigh PCS-6000 com o manche decontrole feito sob encomenda	PCS-6300

Tesoura de Microdissecação Ohio