Deteção de alta sensibilidade de Micrometastases gerado pelo Organoids GFP de Lentivirus-transfectadas cultivadas de um Tumor de cólon derivado de paciente

Resumo

Para permitir a detecção altamente sensível do câncer colorretal humano divulgação células (CRC) colonizar os tecidos, mostramos aqui um protocolo para transdução eficiente de particulas de Lentivirus de proteína verde fluorescente (GFP) em células de organoides CRC PDX-derivado antes da sua injeção em ratos destinatários, com a observação microscópica de estéreo-fluorescência.

Resumo

Apesar dos avanços atuais no tratamento do câncer colorretal humano (CRC), poucas terapias radicais são eficazes para as fases finais da CRC. Para superar este desafio clínico, modelos de rato de enxerto heterólogo tumor usando linhas de células de carcinoma humano há muito estabelecidos e muitas mouse transgênicos foram desenvolvidos modelos com tumores como modelos pré-clínicos. Eles imitam parcialmente as características de carcinomas humanos, mas muitas vezes não conseguem recapitular os principais aspectos da malignidade humana, incluindo a invasão e metástase. Assim, modelos alternativos que melhor representam a progressão maligna no CRC humana há muito aguardados.

Aqui mostramos geração de xenografts tumor derivado de paciente (PDXs) implantação subcutânea de pequenos fragmentos CRC cirurgicamente dissecado de um paciente. O cólon PDXs desenvolver e histopatologicamente assemelham-se a CRC no paciente. No entanto, alguns micrometastases espontâneas são detectáveis em secções transversais convencionais de afetados órgãos distantes no modelo PDX. Para facilitar a detecção de disseminação metastática para órgãos distantes, nós extraídas as células do tumor organoides os cólon PDXs na cultura e eles infectados com lentivirus GFP antes da injeção no altamente imunodeficientes Shi-NOD/scid IL2Rγ^nulo Ratos (NOG). Orthotopically injetado PDX-derivado CRC organoides células consistentemente positivo de tumores primários de forma de GFP em ratos do destinatários. Além disso, a desenvolver espontaneamente micrometastatic colônias expressando GFP notavelmente são detectadas nos pulmões destes ratos por microscopia de fluorescência. Além disso, intrasplenic injeção de CRC organoids frequentemente produz colonização hepática. Tomados em conjunto, estas descobertas indicam GFP-rotulados células de organoides CRC PDX-derivado para ser visualmente detectável durante um processo de várias etapas denominadas cascata de invasão-metástase. Os protocolos descritos incluem o estabelecimento de PDXs de CRC humana e cultura 3D das correspondentes CRC organoides células transfectadas por particulas de Lentivirus de GFP.

Introdução

Câncer colorretal (CRC) é a segunda causa principal de mortes de câncer em todo o mundo¹. A resposta insuficiente a terapias convencionais de pacientes com estágio avançado da doença indica a ineficácia das tentativas de curar radicalmente CRCs. Para desenvolver abordagens terapêuticas mais eficazes, se estabeleceram vários modelos pré-clínicos rato de câncer que imitam as características dos CRCs. Várias linhas de célula CRC foram amplamente utilizadas para gerar xenografts tumor devido a sua comodidade e facilidade de manipulação. Cultura a longo prazo de linhas de células de câncer, no entanto, muitas vezes provoca a seleção de populações de....

Protocolo

O paciente fornecidos escrito consentimento informado e o projeto foi aprovado pelo Comitê de ética de pesquisa da faculdade de Medicina Universidade de Juntendo. Os experimentos de rato também foram aprovados pelo Comitê de ética em pesquisa Animal da faculdade de medicina Juntendo.

1. estabelecimento de CRC PDXs em camundongos imunodeficientes

Procedimentos experimentais para estabelecer PDXs CRC (etapa 1) estão descritos na figura 1A.

1. Prepare o tecido primário de CRC imediatamente após a ressecção cirúrgica do tumor do paciente.
2. Lave o tecido primário de CRC po....

Resultados

Um adenocarcinoma colorretal primário diagnosticado como moderadamente diferenciado tinha sido ressecado cirurgicamente de um mulher de 76 anos com classificação TNM, estágio IIIa, seguida de quimioterapia pós-operatória. O principal CRC immunohistochemically de células coradas positivo para antígeno carcinoembryonic, Ki-67, pan-cytokeratin e E-caderina. Peças do tumor ressecado também por via subcutânea foram implantadas em ratos NOG para gerar o modelo PDX de cólon. Células de organoide.......

Discussão

Embora o modelo CRC PDX tem sido amplamente utilizado para estudar o crescimento do tumor primário, se este modelo também é aplicável para investigar a metástase do tumor ainda não foi totalmente elucidado. Metástases espontâneas também foram mal detectáveis no fígado e pulmões de vários comunicados cólon PDX de modelos de^4,10. Para detectar micrometastases com alta sensibilidade, desenvolvemos um protocolo para transducing particulas de Lentivirus de GFP em CRC .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Camundongos NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG)	The Central Institute for Experimental Animals, Kanagawa, Japão		Cria camundongos machos de 6 semanas de idade em condições livres de germes e patógenos específicos
clipes de feridas 2× Fabricação	Natsume de	#C-21-S	Autoclave antes do uso
Seringa Hamilton tamanho da agulha: calibre 22	Tokyo Science, Japão		Desinfete com álcool 70% e PBS estéril.
Placa de 6 poços	BMBio	#92006
Placa de 12 poços	BMBio	#92412
Tubo cônico de 15ml	Sumitono Baquelite	MS-57150
Tubo cônico de 50ml	Sumitomo Baquelite	MS-57500
microtubo	Eppendorf	#0030120086	Autoclave antes do uso
Hemocitômetro	Erma	#03-202-1
40μ filtro de células m	Corning	#352340
Matriz de membrana basal Matrigel	Corning	#354234	Armazene os produtos a -20°C. Coloque no gelo até usar
Colagenase tipo 1	Sigma	#C1030	150 mg/ml colagenase tipo1 em 1&vezes; PBS. Armazene aliqupts a -20° C por até 1 ano
Accutase	Innovate Cell Technologies	#5V2623A	Loja em 4 graus C.
DMEM/F-12 com GlutaMAX™	Gibco	#10565018	Loja a 4°C. Quente a 37° C antes de usar
Cell banker 1plus	ZENOAQ	#628	Armazene a 4°C. Use dentro de 1 mês
Penicilina	Gibco	#15140122	Armazene a 4°C. Use dentro de 1 mês
Streptomycin	Gibco	#15140122	Armazene a 4°C. Use dentro de 1 mês
hEGF	PEPROTECH	#AF-100-15	Armazene a -20°C. Adicione ao meio no mesmo dia do uso
Y27632, um inibidor de ROCK	Wako	#253-00591	Armazenar a -20°C. Adicionar ao meio on mesmo dia que usar
o meio de cultura	Gibco		DMEM/F-12 com GlutaMAX™ suplemento suplementado com 5% de FBS, 100 U/ml de penicilina e 100 µ g/ml de estreptomicina. Conservar a 4ºC. Utilizar no prazo de 1 mês.
Meio de cultura organoide CRC com 1% ou 5% de FCS			DMEM/F-12 com suplemento GlutaMAX™ (Gibco #10565018) suplementado com 1% ou 5% de FCS, 100 U/ml de penicilina, 100 µ g/ml de estreptomicina, 2 ng/ml de hEGF e 10 µ M Y27632, um inibidor de ROCK. Armazene a 4°C. Use dentro de 1 mês.
o regente de transfecção FuGENE 6	Roche	11814 443001
Minisart 0,45 µ filtro m	Sartorius stedim	17598-K
5 ml tubos de centrífuga de polipropileno	Beckman Coulter	326819
PRRL-GFP vector	Presente do Dr. Robert A. Weinberg
pCMV-VSV-G	Presente do Dr. Robert A. Weinberg
pCMV-dR8.2 dvpr	Presente do Dr. Robert A. Weinberg
o balde oscilante SW55Ti rotor	Beckman Coulter
a Zeiss Axioplan 2 microscópio de estereofluorescência	Zeiss