Method Article

Fabricação de uma matriz de microambiente celular Artificial multiplexado

DOI:

10.3791/57377

⸱

September 7th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Integrated Cell-Material Sciences (WPI-iCeMS), Kyoto University, 2Department of Life Science and Technology, School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology, 3Biomaterials Center for Regenerative Medical Engineering, Foundation for Advancement of International Science, 4Faculty of Science and Natural Resources, Universiti Malaysia Sabah, 5Institute for Chemical Research, Kyoto University, 6Ecole Normale Supérieure

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artigo descreve a metodologia detalhada para preparar uma matriz multiplexado Artificial celular microambiente (MACME) para manipulação de alta produtividade de física e química sugestões imitando na vivo o microambiente celular e para Identifica o ambiente celular ideal para as células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) com perfis de célula única.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microambiente celular consiste em uma variedade de pistas, como fatores de crescimento, matrizes extracelulares e interações intercelulares. Estes tacos são bem orquestrados e são fundamentais na regulação de funções de células em um sistema vivo. Embora um número de pesquisadores tentaram investigar a correlação entre fatores ambientais e funções celulares desejadas, muito permanece desconhecido. Isto é principalmente devido a falta de uma metodologia adequada para imitar tais pistas ambientais em vitroe testar simultaneamente diferentes pistas ambientais nas células. Aqui, nós relatamos uma plataforma integrada de canais microfluídicos e uma matriz de nanofibras, seguido de análise de célula única de alto teor, para examinar células estaminais fenótipos alterados por fatores ambientais distintas. Para demonstrar a aplicação desta plataforma, este estudo centra-se sobre os fenótipos de self que renova as células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs). Aqui, apresentamos os procedimentos de preparação para uma matriz de nanofibras e a estrutura de microfluidic na fabricação de uma matriz de multiplexado Artificial celular microambiente (MACME). Além disso, as etapas gerais da único-célula de criação de perfil, pilha que mancha com vários marcadores fluorescentes, várias imagens de fluorescência e análises estatísticas, são descritas.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De1,(hPSCs) as células-tronco pluripotentes humanas2 auto renovar ilimitadamente e se diferenciar em várias linhagens de tecido, que poderiam revolucionar o desenvolvimento de drogas, terapias baseadas em células, engenharia de tecidos e medicina regenerativa 3 , 4 , 5 , 6. pratos de cultura geral e placas de microtitulação, no entanto, não são projetadas para permitir a manipulação de célula precisa de física e química a nível celular, com o intervalo de nano - para micrometros, que é um fator crítico para a expansão celular, auto-renovação e diferenciação. Para resolver este inconveniente, estudos têm investigado os papéis do microambiente celular na regulação da célula-destino decisões e célula funções4. Nos últimos anos, um número crescente de estudos têm sido realizado para reconstruir o microambiente celular em vitro7,8. Processos de fabricação de micro e nano estabeleceram esses microambiente através da manipulação de químicos9,10,11,12,13, 14,15,16,17 e19,de física18,20 pistas ambientais. Até agora, não havia nenhum relatórios sistematicamente, investigar os mecanismos subjacentes de pistas ambientais físicas e químicas na célula destino decisões e funções dentro de uma única plataforma.

Aqui, apresentamos uma estratégia baseada em princípios de design simples, para estabelecer uma plataforma robusta de triagem (Figura 1). Primeiro, descrevemos o processo de desenvolvimento de uma plataforma integrada para a criação artificial, versátil microambiente celular usando uma matriz de nanofibras e uma estrutura de microfluidic: matriz de The multiplexado Artificial celular microambiente (MACME) (Figura 1A e 2A). A matriz de nanofibras tem 12 microambiente diferentes em diferentes combinações de materiais de nanofibras e densidades. Eletrofiação foi usada para fabricar nanofibras. Os materiais de nanofibras, tais como o poliestireno (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22e gelatina (GT)23, foram projetados para testar suas propriedades químicas, que podem afetar a aderência de célula e manutenção da pluripotência ( Figura 2B). Densidades de nanofibras eram variadas, alterando o tempo de eletrofiação e as gerado nanofibras foram definidas de acordo com suas densidades (DNF, com D = XLow/Low/Mid/High). A estrutura de microfluidic é composta de polidimetilsiloxano (PDMS), abrigando 48 câmaras de cultura de células, que podem ser posicionadas junto as dimensões padrão de microplacas de 96 poços. PDMS é um polímero biocompatível e gás-intercambiáveis, geralmente usado para fabricar de dispositivos microfluídicos24. Cada canal microfluidic foi projetado para ser 700-µm de largura e 8,4 mm de comprimento e tinha duas entradas em suas bordas (tabela 1). As câmaras tinham diferentes alturas (250, 500 e 1000 µm) para manipular as iniciais célula-semeadura densidades (0.3, 0.6 e 1.2 × 105 células/cm2), que podem correlacionar com a sobrevivência, proliferação e diferenciação de hPSCs25 (Figura 2C). O número de células semeado em uma câmara é proporcional a densidade da coluna acima do piso da câmara, e, portanto, célula inicial, densidade de semeadura era controlada por introduzir a mesma suspensão de eritrócitos em câmaras de cultura com diferentes alturas. Todos os canais foram projetados para serem ≥ 250 µm-alta26 para minimizar os efeitos da tensão de oxigênio baixo27 e tensão de cisalhamento28 sobre as células. Alturas de canal de 250, 500 e 1000 µm são abreviadas aqui como XCD com X = Low, Mid e alta, respectivamente. Os ambientes com nanofibras distintas densidades e densidades de semeadura de células iniciais foram encurtados como "Densidade de density_Cell de Material_NF" (por exemplo, GT_HighNF_HighCD: um ambiente caracterizado por nanofibras GT de alta densidade e alta inicial célula-semeadura densidade).

Posteriormente, descrevemos como executar análises de célula única para investigar sistematicamente o comportamento da célula em resposta a fatores ambientais (Figura 1B). Como um prova de conceito, identificamos o ambiente celular ideal para hPSC auto-renovação, que é uma função chave para hPSC manutenção (Figura 1B)29. Citometria baseada em imagem, seguida de análises estatísticas, permite a interpretação quantitativa de respostas fenotípicas celulares individuais para ambientes celulares. Entre uma variedade de funções celulares, este artigo fornece um procedimento detalhado para identificar as condições ideais para a manutenção de hPSC auto-renovação.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. fabricação de matriz MACME

Nota: Todos os materiais e equipamentos estão listados na tabela de materiais.

  1. Elaboração de máscaras para uma matriz de nanofibras e um molde para uma estrutura microfluídicos
    1. Crie imagens de tridimensionais (3D) de máscaras usadas para as matrizes de nanofibras e moldes para estruturas microfluidic usando pacotes de software 3D-computação gráfica (tabela 1).
      Nota: As imagens 3D são lidos e impressos por uma impressora 3D. O impresso de máscaras e molde têm as mesmas dimensões com imagens 3D, definidas usando o software de gráficos no passo 1.1.1.
    2. Imprima máscaras e um molde baseado sobre estes projetos usando uma impressora 3D.
      Nota: Neste protocolo, uma impressora de jato de tinta-como 3D com resina UV-curable foi usado30. A resolução da impressora foi 635 × 400 dpi e 15 µm em X, Y e Z, respectivamente, no entanto, o real X, Y resolução foi aproximadamente quatro vezes inferior.
  2. Preparação de nanofibras-matriz (Figura 3A)
    1. Prepare soluções de polímero para eletrofiação.
      1. Dilua o líquido PMGI 13% com tetrahidrofurano de 9% (p/v)22.
      2. Dissolver 0,08 g de PS (peso molecular de número médio (Mn): 130.000) em THF:dimethylformamide (relação de volume de 1:1),21e adicionar THF:dimethylformamide para trazer o volume até o final 1 mL (solução a 8% (p/v) PS).
      3. Dissolver 0,1 g de GT na água: ácido acético: etil acetato de (relação de volume de 1:1.6:2.1) e adicionar água: acetato do ácido acético: etílico para trazer o volume até o final 1 mL (solução a 10% (p/v) GT) como descrito23,31.
    2. Use um magnetron sputtering máquina, depositar uma fina camada de platina com uma espessura de 5 nm em um poliestireno (PS) placa base (127,7 × 85,5 mm), que serve como um cátodo na configuração da eletrofiação.
    3. Carrega cada solução de polímero em uma seringa de 5 mL, equipada com uma agulha 23-G aço inoxidável.
    4. Lugar e a seringa com a agulha em uma bomba de seringa com 12 cm para além do coletor do dispositivo eletrofiação de âncora.
    5. Conectar a agulha da seringa para uma fonte de alimentação de alta tensão e definir para aplicar a 11 kV.
    6. Defina a taxa de bombeamento de 0,2 mL/h.
    7. Manter a temperatura e umidade em 30 ° C e 30 < % (v/v).
    8. Coloque a máscara sobre a placa de base preparada no passo 1.2.2.
    9. Fabricar nanofibras na placa de base através dos furos da máscara com densidades distintas, alterando o tempo de eletrofiação (por exemplo, 20, 60, 90 e 180 s).
    10. Remova a máscara da placa de base.
      Nota. Etanol pode ser pulverizado sobre as electrospun GT nanofibras antes de remover a máscara para evitar descascando GT nanofibras juntamente com a máscara.
    11. Repita o passo 1.2.4-1.2.10 até a conclusão da fabricação de nanofibras-matriz.
    12. Coloca a matriz de nanofibras num exsicador a 25 ° C, durante 16 h para evaporar o solvente restante.
    13. Crosslink GT nanofibras com 0,2 M 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimida cloridrato (EDC) e 0.2 M N-Hidroxisuccinimida (NHS) em etanol a 25 ° C, durante 4 h23.
    14. Enxágue o GT nanofibras duas vezes com etanol 99,5% (v/v) e vácuo-seco a 25 ° C, durante 16 h.
  3. Fabricação de estruturas de microfluidic (Figura 3B)
    1. Misture 2 g de PDMS cura agente e 20 g de base PDMS (01:10 peso ratio; Pre-PDMS). 24
    2. Despeje a mistura de pre-PDMS para o molde fabricado na etapa 1.2.
    3. De gás da mistura pre-PDMS em um dessecador por 30 min.
    4. Cure a mistura pré-PDMS em estufa a 65 ° C durante 16 h.
  4. Matrizes de montagem de MACME (Figura 3B)
    1. Descole a estrutura PDMS curada no passo 1.3.4 do molde e limpo com álcool etílico 70% (v/v).
    2. Trate a descarga de corona atmosférica no lado inferior da estrutura PDMS32.
      Nota: Neste protocolo, a corona é alta em toda a superfície de uma camada de 3 ou 4 vezes com um aparelho de descarga de corona "Handy". Tratamento de plasma de oxigênio foi substituído com a descarga de corona atmosférica para alterar a aderência a superfície.
    3. Monte a estrutura PDMS com a matriz de nanofibras rapidamente.
    4. Forno-asse a 65° C por 2 dias.

2. carregar hESCs na matriz de MACME

  1. Para a cultura rotineira de H9 células estaminais embrionárias humanas (hESCs), manter as células em xeno-livre quimicamente definidas meio de cultura para hPSC manutenção33 suplementado com 10 µM Y-27632 ROCK inibidor34 (chamado hPSC médio) em uma cultura de pilha 35mm prato revestido com membrana basal matriz do gel (MG).
  2. Células de passagem em 4 a 7 dias usando uma protease tripsina recombinante.
  3. Esterilizar uma matriz MACME com 99,5% de etanol, por carregamento para as câmaras por 10 min e em seguida, remover o etanol. Repita este passo 3 vezes.
  4. Introduzir a 12 µ l de MG, 10 µ g/mL vitronectina (VN), e 0,1% (p/v) GT em controle de câmaras de cultura e incubar as câmaras a 37 ° C por 1 h para revesti-los sobre as superfícies da câmara.
    Nota: Neste protocolo, MG, VN e GT foram selecionados como proteínas de referência para a aderência de célula e cultura. Porque MG e VN são matrizes de cultura de pilha padrão usadas para a manutenção de hPSC auto-renovação, eles são usados como controles positivos; revestimento de GT bidimensional (2DGT) ou não-revestimento (NC) foram usados como controles negativos.
  5. Médio pré-aquecido hPSC Introduza todas as câmaras da matriz MACME. Incubar as câmaras por 30 min a 37 ° C.
  6. Lave H9 hESC cultivada em um prato de 35 mm com DPBS, adicionar 0,5 mL de uma protease tripsina recombinante para o prato e incubar a 37 ° C por 1 min e Aspire cuidadosamente com apenas os sobrenadantes misturados com protease.
    Nota: Na etapa de aspiração, as células não são desanexadas.
  7. Imediatamente adicione o hPSC médio, suavemente, dispense o meio contra a superfície do prato repetidamente para dissociar as células e transferir as células destacadas para um tubo cônico de 15 mL.
  8. Centrifugar a 200 x g, durante 3 min. Aspire o sobrenadante e suspender as células em um meio hPSC previamente aquecido.
  9. Introduza cada câmara microfluidic 12 µ l da suspensão celular (1,2 × 106 células/mL).
    Nota: Apresente células numa câmara de outro utilizando uma micropipeta. Porque o número de células semeado de câmaras é proporcional a densidade da coluna acima do piso da câmara, a densidade celular-semeadura inicial podia ser controlada mesmo que utilizaram-se amostras da mesma suspensão celular. Certifique-se de pipetagem é feito delicadamente. Remova o excesso de meio das câmaras de usando um bastão com ponta de algodão após o carregamento. A matriz MACME é compatível com pipetas de laboratório comumente usados e sistemas automatizados de pipeta, e não exige qualquer equipamento especial.
  10. Mude hPSC médio cada 12 h e cultura por 4 dias.
    Nota: Volumes constantes do meio (1.6, 3.2 e 6.4 µ l) são mantidas por meio de câmaras de tamanhos distintos. Células de cultura sob uma condição estática para minimizar a tensão de cisalhamento, exceto para a troca do meio de cultura celular35,36.

3. quantitativa única célula de criação de perfil

  1. Na chapa de Coloracao Celular fluorescente
    Nota:     para analisar as alterações fenotípicas de auto renovação hPSCs, este protocolo selecionado três marcadores fenotípicos chaves para este protocolo: OCT4, 5-ethynyl-2'-desoxiuridina (EdU) e anexina V, para medir o status de pluripotência, proliferação e apoptose , respectivamente (Figura 2b). 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) é usado para identificar o núcleo de células. OCT4 é um dos fatores críticos da transcrição de pluripotência.
    1. Incube H9 hESCs em matrizes MACME no hPSC suplementado com 10 alquino de EdU µM a 37 ° C por 30 min.
    2. Após a lavagem com tampão de ligação anexina (10 mM HEPES (pH 7,4), 140 mM de NaCl, 2,5 mM CaCl2), mancha as células com um conjugado fluorescente laranja tintura-anexina V a 20 ° C por 15 min.
    3. Corrigir células em PBS com paraformaldeído 4% (v/v) a 20 ° C por 15 min e depois enxaguar células com PBS duas vezes.
    4. Permeabilize pilhas usando PBS com 0,3% (v/v) Triton X-100 a 20 ° C, durante 16 h.
      Nota: Paraformaldeído enfraquece o vínculo entre uma placa base de plástico e uma estrutura de microfluidic PDMS. Assim, o desprendimento da camada de matriz em passo 3.2.1 PDMS também pode ser realizado logo após esta etapa.
    5. Incube as células no buffer Tris base reação com uma azida de corante fluorescente-vermelho a 20 ° C por 30 min.
    6. Incube as células em tampão de bloqueio (PBS com soro de cabra normal de 5% (v/v), soro de burro normal de 5% (v/v), albumina de soro bovino de 3% (p/v), 0,1% (v/v) Tween-20 e 0,1% (p/v) N-dodecil-β-D-maltoside), a 4 ° C, durante 16 h.
    7. Incube em PBS com 0,5% (v/v) solução Triton X-100 e anticorpo humano OCT3/4 (IgG de rato) a 4 ° C, durante 16 h.
    8. Incube em tampão de bloqueio com anti-rato verde-fluorescente tingir-etiquetados burro IgG (H + L) a 37 ° C por 60 min.
    9. Incube em PBS com DAPI a 20 ° C por 30 min.
    10. Substitua PBS, PBS-DAPI.
    11. Preserve a matriz MACME a 4 ° C até a aquisição de imagens.
  2. Aquisição de imagem (Figura 4)
    1. Descole a estrutura de microfluidic PDMS da matriz MACME.
    2. Remover a PBS residual da matriz MACME, aplicam-se às células 90%(v/v) glicerol em PBS e coloque lamelas sobre as células manchadas.
    3. Coloque a placa de cabeça para baixo no palco de um microscópio de fluorescência invertido.
    4. Adquira imagens de 12 bits cor automaticamente usando todos os componentes motorizados (palco, filtros, obturador e foco sistemas) que eram controlados por um software de imagem de microscópio.
      Nota. Neste protocolo, os tempos de exposição são ajustados para chegar perto de valores de intensidade máxima (maior intensidade do pixel: 4096), mas sem saturação, para cada imagem, DAPI, OCT4, anexina V e EdU.
  3. Processamento de imagem guiada por computador e fluorescência sinal quantificação (Figura 5)
    Nota:     a seguinte análise de imagem de célula é realizada com base em um método descrito anteriormente,37.
    1. Converta imagens coloridas em tons de cinza.
    2. Calcular um valor de limite único para cada imagem DAPI com o método de Otsu e classificar pixels acima do limiar, como primeiro plano e abaixo como pano de fundo. Certifique-se de que o valor de primeiro plano corresponde à intensidade fluorescente da DAPI.
      Nota: O processo de análise de imagem contém 5 passos; identificação de objetos primários na DAPI imagens, identificação de objetos secundários em OCT4, anexina V e imagens de EdU, respectivamente e a medida da intensidade de objeto. A Figura 3 fornece as imagens da interface de usuário gráfica (GUI) na configuração de processamento de imagem.
    3. Medir as intensidades fluorescentes de OCT4 e EdU em cada imagem.
    4. Identificar a região manchada com anexina V com o método de propagação e quantificar a intensidade fluorescente.
  4. 3.4. análise estatística para visualizar fenótipos celulares individuais de célula única de imagens
    1. Normalize as intensidades fluorescentes entradas de cada marcador fenotípico pela centralização e dimensionamento destas variáveis para dar-lhes peso igual.
    2. Realizar análise de mapa (SOM) auto-organização, usando um ambiente de software para computação estatística e gráficos conforme descrito por anteriores estudos38,39.
      1. Crie 25 nós SOM com distintivo quatro "codebook vetores" correspondente para as intensidades fluorescentes de quatro marcadores, DAPI, EdU, anexina V e OCT4.
      2. Atribuir células individuais em cada microambiente para um nó (mais parecido) "vencedora" e traçar como frequência de celular, segundo a qual os vetores de livro de códigos do nó vencedora são atualizados usando uma média ponderada, onde o peso é a taxa de aprendizagem (aqui, 0,05 como padrão).
        Nota: Omita dados das câmaras contendo menos de 1.000 células por conjuntos de dados que contém algumas células não apresentaram resultados estatisticamente relevantes do SOM.
    3. Realize sem supervisão de clustering hierárquico com os valores de nó de SOM usando o método média-enlace baseado na correlação de Pearson de um cluster de software40.
    4. Processar os dados do clusters no dendrograma e heatmap visualizações41.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Matrizes MACME: projeto e fabricação: Em combinação com a tecnologia de nanofibras, usamos microfluidic cultura de pilha e triagem técnicas empregadas anteriormente para identificar condições óptimas para hPSC auto-renovação ou diferenciação35,36 (Figura 1). Isto é bem adequado para o estabelecimento de ensaios robustos de cell-based do elevado-throughput porque as câmaras da cultura ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo demonstra o primeiro método de triagem para estabelecer um sistema robusto de cultura para a manutenção de hPSCs qualificado. Primeiro, descrevemos como preparar uma plataforma com diversos ECMs artificiais e célula densidades de semeadura usando um dispositivo microfluidic integrado com uma matriz de nanofibras, a matriz MACME. Segunda, quantitativa baseada em imagem única célula fenotipagem foi realizada50 para avaliar os resultados individuais de celulares e comportamentos altera...

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Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos o Prof N. Nakatsuji no iCeMS, Universidade de Quioto, para fornecer células ES humanas. Também agradecemos a Prof A. Maruyama no Tokyo Institute of Technology pelo seu apoio na utilização do microscópio de força atômica. O financiamento foi generosamente fornecido pela sociedade do Japão para a promoção da ciência (JSPS; 22350104, 23681028, 25886006 e 24656502); financiamento também foi fornecido pela nova energia e organização de desenvolvimento de tecnologia Industrial (NEDO) e a Fundação de Ciências da vida Terumo. O iCeMS-WPI é suportado pelo mundo Premier International Research Centre iniciativa (WPI), o Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia (MEXT), Japão. Uma parte deste trabalho foi apoiada pelo Hub de nanotecnologia de Universidade de Quioto e as instalações de processamento de Nano AIST no projeto"nanotecnologia plataforma" patrocinado pelo MEXT, Japão.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Poliestireno (PS)Sigma#182435Mw médio: 290.000, Mn médio: 130.000
Polimetilglutarimida (PMGI)MicroChemG113113
gelatina (GT)SigmaG2625Da pele suína, kit de
elastômero de silicone tipo A Sylgard 184Doe Corning Toray#1064291O agente de cura PDMS e a base de elastômero de silicone são componentes deste kit.
OpenSCADEste é um software de computação gráfica 3D gratuito (http://www.openscad.org/) usado para projetar o molde do dispositivo microfluídico.
AutoCAD 2014AutodeskEste é um software de computação gráfica 3D (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) usado para o design da máscara usada na preparação de nanofibras.
Impressora 3D, AGILISTA-3000Keyence
Resina curável por UV, AR-M2KeyenceIsso é usado para impressão 3D pela Agilista.
Ácido acéticoSigma#338826≥ 99,99%
acetato de etilaSigma# 270989anidro, 99,8%
tetrahidrofurano (THF)Sigma# 401757
MSP-30Tdispositivo de vácuode pulverização catódica de magnetron
Nunc OmniTrayThermo Fisher Scientific# 242811Esta é uma placa de base de poliestireno na qual a matriz de nanofibras é criada. Este tamanho de placa é normalmente 127,7 x 85,5 mm. 
Máquina de descarga corona tipo pistolaShinko Electric & InstrumentaçãoCFG-500Este dispositivo prático é usado para gerar corona para ativação da superfície inferior da camada PDMS na etapa 1.5 "Montagem das matrizes MACME" no protocolo.
Seringa de 5 mLTerumoSS-05SZ
Agulha romba de aço inoxidável (calibre 23)Nipro#2166O diâmetro externo e o comprimento são de 0,6 e 32 mm, respectivamente.
Fonte de alimentação de alta tensãoTechDempaz
1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, cloridratoDojindoW001
N-HidroxisuccinimidaSigma#56480
Matrigel hESC-Qualified MatrixCorning#354277Esta proteína é referida como matriz de gel de membrana basal no protocolo.
CellAdhere Vitronectina, Humano, SoluçãoSTEMCELL Technologies#07004
TeSR-E8STEMCELL Technologies#05940Meio de cultura sem alimentador, sem xeno para manutenção de células ES e iPS humanas
Y-27632Wako Pure Chemical Industries#253-00513
Enzima TrypLE Express (1X), vermelho de fenolThermo Fisher Scientific#12605028Esta é uma protease recombinante semelhante à tripsina para dissociação de células de mamíferos aderentes.
Kit de imagem Click-iT EdU com Alexa Fluor 647 AzidesThermo Fisher ScientificC10086A marcação fluorescente de células proliferantes na coloração fluorescente na placa foi realizada ao longo do manual do produto deste kit.
Anexina V, Alexa Fluor 594 conjugadoThermo Fisher ScientificA13203
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)Thermo Fisher ScientificD1306
Oct-3/4 Anticorpo (C-10)Santa Cruz Biotechnologysc-5279
Donkey Anti-Mouse IgG H& L (DyLight 488)abcamab96875Este é um anticorpo secundário usado na coloração de células fluorescentes na placa.
ECLIPSE Ti-ENikonEste é um microscópio de fluorescência invertida equipado com uma lente objetiva CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. (Nikon), câmera CCD (ORCA-R2, Hamamatsu), lâmpada de mercúrio (Intensilight, Nikon), estágio automatizado XYZ (estágio motorizado Ti-S-ER com codificadores, Nikon) e cubos de filtro para quatro canais de fluorescência (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon)
NIS-Elements Advanced ResearchNikonEste é um software de imagem de microscópio usado para aquisição automática de imagens.
CellProfiler, versão 2.1.0Este é um software aberto gratuito para análise de imagens celulares (http://cellprofiler.org/).
A análise RSOM é realizada pelo pacote kohonen deste software. Isso está disponível gratuitamente (https://www.r-project.org/).
Cluster 3.0Este é o software de clustering de código aberto (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). O agrupamento hierárquico não supervisionado é realizado com este software.
Java TreeViewEste software de código aberto (http://jtreeview.sourceforge.net/) é usado para visualizar dados de agrupamento como um mapa de calor e um dendrograma.
Célula-tronco embrionária humana H9WiCell Banco de células-troncoWA09
máquina

References

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