Method Article

Fabricação de uma matriz de microambiente celular Artificial multiplexado

DOI:

10.3791/57377

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September 7th, 2018

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1Institute for Integrated Cell-Material Sciences (WPI-iCeMS), Kyoto University, 2Department of Life Science and Technology, School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology, 3Biomaterials Center for Regenerative Medical Engineering, Foundation for Advancement of International Science, 4Faculty of Science and Natural Resources, Universiti Malaysia Sabah, 5Institute for Chemical Research, Kyoto University, 6Ecole Normale Supérieure

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artigo descreve a metodologia detalhada para preparar uma matriz multiplexado Artificial celular microambiente (MACME) para manipulação de alta produtividade de física e química sugestões imitando na vivo o microambiente celular e para Identifica o ambiente celular ideal para as células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) com perfis de célula única.

Abstract

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Microambiente celular consiste em uma variedade de pistas, como fatores de crescimento, matrizes extracelulares e interações intercelulares. Estes tacos são bem orquestrados e são fundamentais na regulação de funções de células em um sistema vivo. Embora um número de pesquisadores tentaram investigar a correlação entre fatores ambientais e funções celulares desejadas, muito permanece desconhecido. Isto é principalmente devido a falta de uma metodologia adequada para imitar tais pistas ambientais em vitroe testar simultaneamente diferentes pistas ambientais nas células. Aqui, nós relatamos uma plataforma integrada de canais microfluídicos e uma matriz de nanofibras, seguido de análise de célula única de alto teor, para examinar células estaminais fenótipos alterados por fatores ambientais distintas. Para demonstrar a aplicação desta plataforma, este estudo centra-se sobre os fenótipos de self que renova as células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs). Aqui, apresentamos os procedimentos de preparação para uma matriz de nanofibras e a estrutura de microfluidic na fabricação de uma matriz de multiplexado Artificial celular microambiente (MACME). Além disso, as etapas gerais da único-célula de criação de perfil, pilha que mancha com vários marcadores fluorescentes, várias imagens de fluorescência e análises estatísticas, são descritas.

Introduction

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De1,(hPSCs) as células-tronco pluripotentes humanas2 auto renovar ilimitadamente e se diferenciar em várias linhagens de tecido, que poderiam revolucionar o desenvolvimento de drogas, terapias baseadas em células, engenharia de tecidos e medicina regenerativa 3 , 4 , 5 , 6. pratos de cultura geral e placas de microtitulação, no entanto, não são projetadas para permitir a manipulação de célula precisa de física e química a nível celular, com o intervalo de nano - para micrometros, que....

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Protocol

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1. fabricação de matriz MACME

Nota: Todos os materiais e equipamentos estão listados na tabela de materiais.

  1. Elaboração de máscaras para uma matriz de nanofibras e um molde para uma estrutura microfluídicos
    1. Crie imagens de tridimensionais (3D) de máscaras usadas para as matrizes de nanofibras e moldes para estruturas microfluidic usando pacotes de software 3D-computação gráfica (tabela 1).
      Nota: As imagens 3D são lidos e impressos por uma impressora 3D. O impresso de máscaras e molde têm as mesmas dimensões com imagens 3D, definidas usando o software de gráficos no p....

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Results

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Matrizes MACME: projeto e fabricação: Em combinação com a tecnologia de nanofibras, usamos microfluidic cultura de pilha e triagem técnicas empregadas anteriormente para identificar condições óptimas para hPSC auto-renovação ou diferenciação35,36 (Figura 1). Isto é bem adequado para o estabelecimento de ensaios robustos de cell-based do elevado-throughput porque as câmaras da cultura .......

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Discussion

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Este protocolo demonstra o primeiro método de triagem para estabelecer um sistema robusto de cultura para a manutenção de hPSCs qualificado. Primeiro, descrevemos como preparar uma plataforma com diversos ECMs artificiais e célula densidades de semeadura usando um dispositivo microfluidic integrado com uma matriz de nanofibras, a matriz MACME. Segunda, quantitativa baseada em imagem única célula fenotipagem foi realizada50 para avaliar os resultados individuais de celulares e comportamentos altera.......

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Acknowledgements

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Agradecemos o Prof N. Nakatsuji no iCeMS, Universidade de Quioto, para fornecer células ES humanas. Também agradecemos a Prof A. Maruyama no Tokyo Institute of Technology pelo seu apoio na utilização do microscópio de força atômica. O financiamento foi generosamente fornecido pela sociedade do Japão para a promoção da ciência (JSPS; 22350104, 23681028, 25886006 e 24656502); financiamento também foi fornecido pela nova energia e organização de desenvolvimento de tecnologia Industrial (NEDO) e a Fundação de Ciências da vida Terumo. O iCeMS-WPI é suportado pelo mundo Premier International Research Centre iniciativa (WPI), o Ministério da educação, cultura, esportes, ciên....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Poliestireno (PS)Sigma#182435Mw médio: 290.000, Mn médio: 130.000
Polimetilglutarimida (PMGI)MicroChemG113113
gelatina (GT)SigmaG2625Da pele suína, kit de
elastômero de silicone tipo A Sylgard 184Doe Corning Toray#1064291O agente de cura PDMS e a base de elastômero de silicone são componentes deste kit.
OpenSCADEste é um software de computação gráfica 3D gratuito (http://www.openscad.org/) usado para projetar o molde do dispositivo microfluídico.
AutoCAD 2014AutodeskEste é um software de computação gráfica 3D (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) usado para o design da máscara usada na preparação de nanofibras.
Impressora 3D, AGILISTA-3000Keyence
Resina curável por UV, AR-M2KeyenceIsso é usado para impressão 3D pela Agilista.
Ácido acéticoSigma#338826≥ 99,99%
acetato de etilaSigma# 270989anidro, 99,8%
tetrahidrofurano (THF)Sigma# 401757
MSP-30Tdispositivo de vácuode pulverização catódica de magnetron
Nunc OmniTrayThermo Fisher Scientific# 242811Esta é uma placa de base de poliestireno na qual a matriz de nanofibras é criada. Este tamanho de placa é normalmente 127,7 x 85,5 mm. 
Máquina de descarga corona tipo pistolaShinko Electric & InstrumentaçãoCFG-500Este dispositivo prático é usado para gerar corona para ativação da superfície inferior da camada PDMS na etapa 1.5 "Montagem das matrizes MACME" no protocolo.
Seringa de 5 mLTerumoSS-05SZ
Agulha romba de aço inoxidável (calibre 23)Nipro#2166O diâmetro externo e o comprimento são de 0,6 e 32 mm, respectivamente.
Fonte de alimentação de alta tensãoTechDempaz
1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, cloridratoDojindoW001
N-HidroxisuccinimidaSigma#56480
Matrigel hESC-Qualified MatrixCorning#354277Esta proteína é referida como matriz de gel de membrana basal no protocolo.
CellAdhere Vitronectina, Humano, SoluçãoSTEMCELL Technologies#07004
TeSR-E8STEMCELL Technologies#05940Meio de cultura sem alimentador, sem xeno para manutenção de células ES e iPS humanas
Y-27632Wako Pure Chemical Industries#253-00513
Enzima TrypLE Express (1X), vermelho de fenolThermo Fisher Scientific#12605028Esta é uma protease recombinante semelhante à tripsina para dissociação de células de mamíferos aderentes.
Kit de imagem Click-iT EdU com Alexa Fluor 647 AzidesThermo Fisher ScientificC10086A marcação fluorescente de células proliferantes na coloração fluorescente na placa foi realizada ao longo do manual do produto deste kit.
Anexina V, Alexa Fluor 594 conjugadoThermo Fisher ScientificA13203
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)Thermo Fisher ScientificD1306
Oct-3/4 Anticorpo (C-10)Santa Cruz Biotechnologysc-5279
Donkey Anti-Mouse IgG H& L (DyLight 488)abcamab96875Este é um anticorpo secundário usado na coloração de células fluorescentes na placa.
ECLIPSE Ti-ENikonEste é um microscópio de fluorescência invertida equipado com uma lente objetiva CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. (Nikon), câmera CCD (ORCA-R2, Hamamatsu), lâmpada de mercúrio (Intensilight, Nikon), estágio automatizado XYZ (estágio motorizado Ti-S-ER com codificadores, Nikon) e cubos de filtro para quatro canais de fluorescência (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon)
NIS-Elements Advanced ResearchNikonEste é um software de imagem de microscópio usado para aquisição automática de imagens.
CellProfiler, versão 2.1.0Este é um software aberto gratuito para análise de imagens celulares (http://cellprofiler.org/).
A análise RSOM é realizada pelo pacote kohonen deste software. Isso está disponível gratuitamente (https://www.r-project.org/).
Cluster 3.0Este é o software de clustering de código aberto (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). O agrupamento hierárquico não supervisionado é realizado com este software.
Java TreeViewEste software de código aberto (http://jtreeview.sourceforge.net/) é usado para visualizar dados de agrupamento como um mapa de calor e um dendrograma.
Célula-tronco embrionária humana H9WiCell Banco de células-troncoWA09
máquina

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Ameen, C., et al.

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Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment ArrayNanofiber Array FabricationMicrofluidic Structure AssemblyElectrospinning ProcessStem Cell PhenotypingSingle Cell ProfilingFluorescence ImagingSOM AnalysishPSC Self RenewalPDMS Molding

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