Artigo de método

Um modelo do rato de obstrução Intestinal parcial

DOI:

10.3791/57381

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5 de março de 2018

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1Department of Physiology and Cell Biology, University of Nevada, Reno School of Medicine, 2Department of Physiology, Wonkwang Digestive Disease Research Institute and Institute of Wonkwang Medical Science, School of Medicine, Wonkwang University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Obstruções intestinais são um bloqueio parcial ou total do intestino que pode causar dor abdominal, náuseas, vômitos e impedindo a passagem das fezes. Este procedimento para criar obsructions parcial intestinal em camundongos é confiável em estudar os mecanismos subjacentes do crescimento celular patológica e morte no intestino.

Resumo

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Obstruções intestinais, que impedem ou bloqueiam o movimento peristáltico, podem ser causadas por aderências abdominais e mais gastrointestinais (GI) doenças incluindo tumorosa crescimentos. No entanto, o celular que remodela os mecanismos envolvidos na e obstrução intestinal causada por, é mal compreendidas. Foram desenvolvidos vários modelos animais de obstruções intestinais, mas o modelo do mouse é o custo/tempo mais eficaz. Usa o modelo de rato da implantação cirúrgica de uma obstrução intestinal parcial (PO) que tem uma alta taxa de mortalidade, se não é realizada corretamente. Além disso, ratos recebendo cirurgia PO não conseguem desenvolver hipertrofia se um bloqueio adequado não é usado ou não está devidamente colocado. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para cirurgia de PO que produz confiáveis e reprodutíveis obstruções intestinais, com uma taxa de mortalidade muito baixa. Este protocolo utiliza um anel de silicone colocado cirurgicamente que rodeia o íleo que bloqueia parcialmente o movimento digestivo no intestino delgado. O bloqueio parcial faz o intestino se tornam dilatadas devido a parada do movimento digestivo. A dilatação do intestino induz a hipertrofia do músculo liso no lado oral do anel que desenvolve progressivamente mais de 2 semanas até que causa morte. O modelo de mouse PO cirúrgico oferece um modelo in vivo de tecido intestinal hipertrófica útil para estudar as alterações patológicas das células intestinais, incluindo células musculares lisas (SMC), células intersticiais de Cajal (ICC), PDGFRα+e neuronal células durante o desenvolvimento de obstrução intestinal.

Introdução

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Obstruções intestinais são um bloqueio parcial ou total no intestino pequeno ou grande que impede o alimento digerido, fluidos e gases movendo-se através do intestino1. Devido a obstrução, a obstrução induz as paredes intestinais para tornar-se espessada, estreitamento do lúmen2. Obstrução intestinal pode ocorrer como resultado de cirurgias abdominais ou pélvicas que causam a formação de tecido de aderência abdominal ou de distúrbios GI, tais como doenças inflamatórias intestinais (doença de Crohn), diverticulite, hérnias, Volvo, estenose, intussuscepção, constipação, fecaloma, pseudo-obstrução, cancros e tumores de4,3,5. Obstruções intestinais, nestes casos, muitas vezes, levam para a hipertrofia da túnica muscular do intestino6.

PO do lúmen induz a distensão intestinal e aumenta a espessura da camada de músculo liso ao redor da obstrução em resposta à necessidade de continuar o peristaltismo funcional7,8,9,10, 11,12,13. Modelos animais de PO intestinal foram desenvolvidos para estudar a hipertrofia do músculo liso em ratos7ratos10, cobaias11, cães12e gatos13 que consistentemente desenvolver hipertrofia similar dentro o camadas de músculo intestinal.

Um modelo do rato do PO intestinal é a maneira mais custo-eficaz de gerar e estudar obstruções intestinais na vivo. Obstruções de intestino delgado são realizadas em camundongos, usando um anel de silicone cirurgicamente colocado em torno do íleo. Os ratos PO mostraram um aumento inicial do número de células (hiperplasia) e um aumento na espessura da camada muscular (hipertrofia) após PO cirurgia8,15. SMC são o principais plástico as células que estão crescendo dentro de camadas de músculo liso em resposta a condições hipertrófica14, mas outras células tais como ICC e PDGFRα+ células que estão intimamente associados com o SMC, são também repovoada. Informamos anteriormente que os ratos PO desenvolveram hipertrofia no intestino delgado, no qual SMC são condrossarcoma em células PDGFRα+ que são altamente proliferativas7,15,16. Por outro lado, ICC são degenerou e perdeu dentro das camadas hipertrofiado músculo liso durante o desenvolvimento do obsruction intestinal7. Outro grande benefício do modelo PO é sua capacidade de induzir alterações no sistema nervoso entérico e propagando padrões motor neurogênicos. A grande propagação padrão motor neurogênica no intestino do rato é o migração motor complexo (MMC), que é neurogênica e não requer ICC ou ondas lentas elétrica17. O modelo de PO pode fornecer insights claras sobre como MMCs e nervos entéricos são remodelados pela obstrução parcial.

Aqui, propomos um protocolo murino para intestinal cirurgia de PO, usando um anel de silicone. Ratos recebendo cirurgia PO confiantemente produzem hipertrofia na túnica muscular do intestino delgado. Dentro hipertrófica muscular, SMC, ICC, PDGFRα+e células neuronais são drasticamente remodeladas.

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Protocolo

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O seguinte protocolo foi aprovado pelo cuidado institucional do Animal e usar Comité (IACUC) na Universidade de Nevada-Reno (UNR) Animal recursos e cumpre com todas as orientações éticas institucionais relativas à utilização de animais de pesquisa.

1. os animais.

  1. Obter camundongos C57BL/6 de maduro (4-6 semanas de idade) pesando entre 20-30 g casa da colônia de ratos de laboratório em uma instalação centralizada animal em urn Animal Resources.

2. parcial obstrução cirurgia

Nota: Cirurgias são realizadas em uma sala dedicada para procedimentos cirúrgicos. Todos os instrumentos cirúrgicos são autoclavados antes da cirurgia. Luvas e batas cirúrgicas estéreis devem ser usadas por todo o pessoal na sala cirúrgica em todos os momentos.

  1. Preparação para o mouse cirúrgica
    1. Verificar o sistema de entrega anestésico para garantir o fornecimento de oxigênio e isoflurano é adequado para o procedimento. Ligue o fornecimento de oxigênio. Ligar o medidor de vazão de gás e ajustá-lo a 500-1000 mL/min. lugar do animal na câmara de indução e selar o topo.
    2. Ligue o vaporizador de isoflurano para 5% e, em seguida, monitorar o animal até que se torne reclinada. Mude o sistema de entrega de anestésico para o cone de nariz.
    3. Lave a câmara de indução de qualquer gás residual com oxigênio e, em seguida, desligue a linha de câmara de indução, mantendo a linha do cone de nariz aberto.
    4. Remover o animal da câmara e cuidadosamente coloque pomada oftálmica nos olhos do animal.
    5. Coloque o cone de nariz em uma almofada quente pré-aquecido quando gás continua a fluir.
    6. Altere o fluxo de oxigênio de 100-200 mL/min, com 2-3% de isoflurano. Se o animal começa a se mover, gentlyrestrain o animal com o cone de nariz em até totalmente anestesiados novamente.
    7. Monitorar a respiração e a resposta à estimulação durante o procedimento e ajustar a porcentagem de isoflurano (2-5%) conforme necessário. Nível de anesthetization animal é monitorado pela falta de reflexo de pitada de dedo do pé antes que a cirurgia é realizada.
    8. Injete remédios contra a dor (buprenorfina, 1 µ g/g de peso corporal) intraperitonealmente longe do local da incisão.
    9. Aplique loção de remoção de cabelo sobre o abdome, usando um cotonete limpo. Deixe-o sentar-se loção para 3-5 min no mouse, em seguida retire os cabelos com compressas de gaze e algodão. Repita este passo até que todo o cabelo foi removido do abdômen do mouse.
    10. Limpe a pele com álcool 70%, usando cotonetes de algodão e gaze. Aplica uma solução swabsticks ou povidone-iodo para limpar o abdômen.
  2. Cirurgia de obstrução parcial
    1. Cubra o local cirúrgico usando papel estéril de 25 x 50 cm com um 2.5 x 2.5 cm de abertura no meio para a área de cirurgia. Prenda a cortina para o animal colocando tiras estéril nos limites da abertura e da pele.
    2. Faça uma incisão abdominal de ~3.0 cm longitudinalmente usando um bisturi de lâmina n º 15, garantindo que apenas a pele é incisada e evitando o corte da camada de musculoperitoneal neste momento.
    3. Usando pinças e tesouras cirúrgicas, separe com cuidado a pele da camada de musculoperitoneal sem causar qualquer incisão para a camada de musculoperitoneal. Depois que as camadas foram suficientemente separadas (aproximadamente 1 cm x 4 cm), identificar o linea alba na camada musculoperitoneal e corte ~ 2 cm ao longo da linea alba para expor a cavidade intraperitoneal usando microfórceps e a tesoura.
    4. Cuidadosamente, localizar e identificar o ceco. Lenta e suavemente remova o ceco da cavidade intraperitoneal com microfórceps, trazendo o cólon proximal e íleo com o ceco lá fora para a cortina estéril. Imediatamente, umedeça o tecido intestinal com gaze embebido salina estéril 0,9% e manter o tecido exposto umedecido em todos os momentos, enquanto eles estão fora da cavidade abdominal.
    5. Localizar e identificar o mesentério entre o íleo e o cólon proximal. Fazer uma incisão (~ 1 cm) paralelo a e logo abaixo, o íleo, no mesentério e evitar cortar qualquer vasculatura.
    6. Pegue um anel de silicone autoclavado (6 mm de comprimento, diâmetro exterior de 4 mm, diâmetro interior de 3,5 mm). Corte longitudinalmente para abrir o tubo e abra o anel com microfórceps.
    7. Insira uma extremidade do anel aberto através da incisão no tecido mesentério. Devolver o anel que forma um anel completo, trazendo uma extremidade em contato com o outro, com o íleo, rodeado pelo anel.
    8. Certifique-se de que o anel de silicone rodeia completamente o íleo, feche o anel com sutura e coloque cuidadosamente o intestino volta na cavidade intraperitoneal.
  3. Encerramento de cirurgia
    1. Realizar uma simples sutura contínua sobre a camada de musculoperitoneal ao longo da linea alba para fechar o musculoperitoneal ferida com uma sutura absorvível. Após a sutura é completa, limpa qualquer sangramento com solução salina 0,9% embebido gaze.
    2. Para fechar completamente a ferida, com uma sutura de nylon separados, realize uma sutura contínua simples na pele.
    3. Depois ambas as suturas foram concluídas, limpe a ferida com novo swabstick ou iodo-povidona.
    4. Intraperitonealmente injete antibióticos (gentamicina, 150 μL por rato com base em 20-30 g de massa corporal).
    5. Após a conclusão do procedimento, desligue o vaporizador de isoflurano e permitir que o animal de respirar só flui oxigênio até começar ganhando consciência.
    6. Uma vez que o animal está acordado, coloca o animal em uma área de recuperação separada com apoio térmico até totalmente recuperado.

3. pós-operação observação.

  1. Após a conclusão da cirurgia, mova os animais para uma incubadora em uma sala de recuperação onde a temperatura e umidade são regulamentadas. Monitore os animais no pós-operatório a cada 15 minutos para a primeira hora depois a cada 30 min para a segunda hora, enquanto os animais estão na incubadora.
  2. Tão logo a observação prescrita for concluída, mova os animais para sua própria gaiola individual e monitorá-los diariamente para indicações clínicas de dor18e para garantir que a ferida cirúrgica está curando corretamente sem quaisquer sinais de complicações ( deiscência) presente.

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Resultados

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Obstrução parcial (PO) foi cirurgicamente induzida em ratos um mês de idade, colocando um anel de silicone ao redor do íleo perto do esfíncter ileocecal. Este anel criado um bloqueio parcial no íleo. Operações Sham (então) também foram realizadas sem um anel na idade/sexo correspondem ratos e estes ratos não apresentaram qualquer sintomas semelhantes aos encontrados em camundongos PO. Os ratos rapidamente recuperaram da cirurgia PO dentro de algumas horas. Eles não mostraram mudanças comp...

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Discussão

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Temos demonstrado que ratos recebendo a cirurgia intestinal do PO consistentemente e reproducibly desenvolveram hipertrofia intestinal de músculo liso, que imita a obstrução intestinal humana. Cirurgias de obstrução intestinal foram desenvolvidas para animais diferentes, incluindo ratos7ratos10, cobaias,11,13, de12 e gatos cachorro. O modelo do rato de obstrução intestinal tem tempo, custo, tamanho e fe...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Os autores gostaria de agradecer Benjamin J Weigler, DVM, pH.d. e Walt Mandeville, D.V.M. (recursos animais & Campus frequentando veterinário, Universidade de Nevada, Reno) para seus serviços excelentes animais fornecidos para os ratos, bem como seus conselhos sobre procedimentos cirúrgicos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Campo cirúrgicomédico e veterinárioSMS4040" X100 jardas
Underpad, econ, pro plusSuprimentos médicos e veterináriosMSC28122417x24"
Tesoura de írisBraintree scientific, IncSC-i-130
Tesoura de írisVantageV95-304
Dumont pinças eletrônicas e joalheirasDumont98-180-3
Sutura absorvível trançadaCovidien polysorbSL-5687G5-0, poliglactina
Nylon monofilamento não absorvívelAD cirúrgicoS-N618R136-0, nylon
Lâmina cirúrgicaDynarexNo.15
Porta-agulhasJacobson microvascular36-1342TC8,5 polegadas
Cabo de bisturiFlinn scientificAB1049
Tesoura microcirúrgicaWPI503305
Pomada oftálmica de petrolatoPuralube VET3,5 g
Fluriso (isoflurano)VetoneV1 502017250 ml
Fechamento de pele reforçado com tira de3MR1547
Luvas cirúrgicasMedlineMSG2270
Máscara facial de laço de orelhaA zona de segurançaRS700
Avant gaze esponjas não tecidasCaringPRM25444
Copo cirúrgicoAdmiral  craft OYC-2725-A422.5 oz
SwabstickChloraPrep2601032% w/v Clorexidina  Gluconato (CHG) e álcool isopropílico 70% v/v (IPA)
Aplicador com ponta de algodãoPuritan806-WC
BuprenorfinaZoo pharmBZ80693171 mg/ml
Sulfato de gentamicinaVetone G-6336-04100 mg/ml
Gel de ação rápida removedor de cremeVeet8111002
SeringaAHSAH01T25161 ml com agulha
Anel de silícioVWR60985-720mm de comprimento, 4 mm de diâmetro externo, 3,5 mm de diâmetro interno
Camundongos C57BL/6The Jackson Laboratory4-6 semanas de idade
Material esterilização 6

Referências

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