Imagem latente da viver-pilha fornece uma riqueza de informações sobre células únicas ou populações inteiras que é inatingível por célula fixa imagem sozinho. Aqui, viver-pilha protocolos de imagens para avaliar as decisões de destino célula após o tratamento com a droga antimitótica paclitaxel são descritos.
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Artigo de método
A longo prazo viver-pilha de imagem para avaliar o destino da célula em resposta ao Paclitaxel
Neste artigo
Resumo
Resumo
Imagem latente da viver-pilha é uma técnica poderosa que pode ser usada para visualizar diretamente fenômenos biológicos em células únicas durante longos períodos de tempo. Na última década, tecnologias novas e inovadoras melhoraram grandemente a praticidade da imagem latente da viver-pilha. As células podem agora ser mantidas em foco e continuamente imagem durante vários dias, enquanto mantida sob a 37 °C e 5% CO2 condições de cultura celular. Além disso, vários campos de visão que representam diferentes condições experimentais podem ser adquiridos em simultâneo, proporcionando elevado-throughput dados experimentais. Imagem latente da viver-pilha fornece uma vantagem significativa sobre imagem fixa-celular, permitindo a visualização direta e quantificação temporal de eventos celulares dinâmicos. Imagem latente da viver-pilha também pode identificar a variação no comportamento de células únicas que seria caso contrário ter sido perdido usando ensaios baseados na população. Aqui, descrevemos a viver-pilha protocolos de imagens para avaliar as decisões de destino célula após o tratamento com a droga antimitótica paclitaxel. Vamos demonstrar métodos para visualizar se mitotically prenderam células morrem diretamente da mitose ou slip volta em interfase. Também descreveremos como o sistema de indicadores (FUCCI) fluorescente ciclo celular baseado em do pode ser usado para avaliar a fração de células de interfase nascida do resvalamento mitótico que são capazes de re-introdução do ciclo celular. Finalmente, descrevemos um método de viver-pilha de imagens para identificar eventos de ruptura do envelope nuclear.
Introdução
Drogas antimitóticas têm sido muito utilizadas nos regimes quimioterápicos de vários tipos de tumores sólidos e frequentemente apresentam grande eficácia1,2,3. Mecanicamente, estas drogas perturbar a normal progressão mitótica e promover a prisão mitótica proliferam rapidamente as células cancerosas. No entanto, destino de célula em resposta a prisão mitótica é bastante variável: enquanto uma fração das células sofre morte celular diretamente da mitose, outros saída da mitose e retornar para o interphase como células tetraploide (um processo denominado slippage mitótico)
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Protocolo
Este protocolo se concentra no uso não-transformadas e cromossomicamente estável da retina pigmentados epiteliais (RPE-1) linhagem celular para experiências de imagens ao vivo-celular. No entanto, este protocolo pode ser adaptado a qualquer linha de células aderentes, desde que as condições de cultura celular são ajustadas, se necessário. Todos os procedimentos devem aderir às normas e diretrizes éticas e biossegurança institucional.
1. preparar células para a imagem latente da viver-pilha
- Usar passagem recém descongelado e cedo RPE-1 células expressando humana histona que H2B fundido a uma proteína fluorescente (por ....
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Resultados
Usando o protocolo descrito acima, as células de RPE-1 expressando H2B-GFP foram tratadas com um controle antimitótico ou veículo (DMSO) e analisadas pela imagem latente da viver-pilha. A análise revelou que 100% das células mitóticas de RPE-1 controle iniciado anáfase uma média de 22 min depois de entrar em mitose (figura 1A, D 1). Por outro lado, as células de RPE-1 tratadas com paclitaxel exibiram uma profunda apreensão mitótica dura vária.......
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Discussão
O aspecto mais importante da imagem latente da viver-pilha a longo prazo é garantir a saúde das células sendo fotografada. É essencial que as células sejam expostas a mínimas externos estressores ambientais, tais como condições precárias em relação a temperatura, umidade e/ou os níveis de CO2 . Também é importante limitar Fotodano de iluminação fluorescente de excitação, como stress de imagem é conhecido por afetar o comportamento de célula50. Limitar o Fotodano pode ser conseguido de v.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
AFB, MAV e NJG gostaria de agradecer Ryan Quinton para comentários sobre o manuscrito e Adrian sálica para a construção de TDRFP-NLS. AFB e MAV são financiados pelo 5T32GM008541 NIGMS Biomolecular farmacologia formação Grant. NJG é um membro da ISA e Ashraf Dahod laboratórios de pesquisa de câncer da mama e é apoiado por subsídios de NIH GM117150 e CA-154531, a Karin Grunebaum Foundation, programa de prêmios da família Smith, o programa de estudiosos de Searle e a pesquisa de Melanoma Aliança.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| sem vermelho de fenol, meio DMEM:F12 | Hyclone | SH3027202 | |
| 10% de soro fetal bovino (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| 100 UI/ml de penicilina e 100 mg/ml de estreptomicina. | Gibco | 15070063 | |
| PBS | Gibco | 10010049 | |
| 0,25% Tripsina / EDTA | Gemini | 50-753-3104 | |
| Prato de imagem com fundo de vidro de 12 poços | Cellvis | P12-1.5H-N | |
| Paclitaxel | TSZ Chem | RS036 | |
| Dimetil Sulfóxido (DMSO) | Sigma | NC0215085 | |
| Ambiental Câmara | In Vivo Scientific | ||
| 5% CO2 | Airgas | Z03NI7432000201 | |
| 15 mL Tubos cônicos | Fisherbrand | 05-539-12 | |
| Placas de cultura de tecidos de poliestireno de 10 cm | Falcon | 08772E | |
| 10 mL Pipeta sorológica descartável | Fisherbrand | 4488 | |
| 5804R Centrífuga de 15 amperes | Eppendorf | 97007-370 | |
| 1000 microlitros Pipeta | Gilson | Pipetman Classic | |
| 20 microlitros Pipeta | Gilson | Pipetman Classic | |
| p1000 Pontas de pipeta | Sharp | p1126 | |
| p20 Pontas de pipeta | Sharp | P1121 | |
| RPE-1 Células | ATCC | CRL-4000 | |
| Incubadora Galaxy 170S | Eppendorf | CO17011005 | |
| Pipeta Boy | Integra | 156401 | |
| Hemacitômetro | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Nikon Ti-E-PFS Microscópio Invertido para Imagem de Células Vivas | Micro Video Instruments, Inc. | ||
| Sistema de Palco XY Anterior e Iluminador LED de Luz Branca | Micro Video Instruments, Inc. | de 500-H117P1N4 | |
| Prior com Encoders | Micro Video Instruments, Inc. | 500-H31XYZE | |
| Andor Câmera Digital | Micro Video Instruments, Inc. | D10NLC | |
| Nikon NIS Elements Software AR | Micro Video Instruments, Inc. | ||
| Iluminador LED SOLA para Fluorescência | Micro Video Instruments, Inc. | Câmara Ambiental SOLA-E | |
| InVivo com Controle de Fluxo de CO2 | Micro Video Instruments, Inc. | Ti-IVS-100 | |
| Ti-ND6-PFS Focagem Perfeita Porta-objetivas Motorizado | Micro Video Instruments, Inc. | ||
| Condensador do Sistema Ti-C Turret | Micro Video Instruments, Inc. | ||
| Unidade de Lente Ti-C LWD LWD para Sistema Condensador Torre | Micro Video Instruments, Inc. | ||
| Módulo Te-C LWD Ph1 Micro | Video Instruments, Inc. | ||
| CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16mm | Micro Video Instruments, Inc. | ||
| CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM Objective | Micro Video Instruments, Inc. |
Referências
- van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 76 (6), 1101-1112 (2015).
- Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death Dis. 3
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Reimpressões e permissões
