Artigo de método

Síntese de nanotubos de carbono de paredes Multi modificados com nanopartículas de prata e avaliação das suas actividades antibacterianas e propriedades citotóxicas

DOI:

10.3791/57384

⸱

10 de maio de 2018

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1Center for Biomaterials, Biomedical Research Institute, Korea Institute of Science and Technology, 2School of Integrative Engineering, Chung-Ang University, 3Division of Synthetic Biology and Regenerative Medicine, Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Michigan State University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Neste estudo, nanomateriais antimicrobianos foram sintetizados por oxidação ácida de nanotubos de carbono multiwalled e subsequente deposição redutora de nanopartículas de prata. Antimicrobial atividade e citotoxicidade testes foram realizados com os nanomateriais como preparada.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neste estudo, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) foram tratados com uma solução aquosa de ácido sulfúrico para formar um grupo funcional à base de oxigénio. MWCNTs prata foram preparados pela deposição de prata de uma solução aquosa de AgNO3 sobre os MWCNTs oxidados redutora. Dada a cor original das CNTs, não foi possível aplicá-las para a concentração inibitória mínima ou ensaios de toxicidade mitocondrial para avaliar as toxicidade e antibacteriano Propriedades, desde que eles iria interferir com os ensaios. A zona de inibição e concentração bactericida mínima para as Ag-MWCNTs foram medidos e Live/mortos e azul Trypan ensaios foram usados para medir as toxicidade e antibacteriano Propriedades sem interferir com a cor da CNTs.

Introdução

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O objetivo deste estudo é tornar ambientalmente amigáveis nanomateriais antibacterianos que podem inibir o crescimento de bactérias que forma de biofilmes. Desses nanomateriais antibacterianos têm o potencial para superar problemas de resistência a antibiótico e toxicidade de produtos químicos comumente usados ou compostos químicos antibióticos. Um biofilme é uma hidratada extracelular polimérica substância (EPS) que é composta por polissacarídeos, proteínas, ácidos nucleicos e lipídios1,2. Biofilmes impedem a invasão de substâncias estranhas e ajudarem as bactérias a crescer vigorosamente3,4. Biofilmes causam odor e doenças infecciosas crônicas5,6. Methylobacterium spp., por exemplo, cresce, aderindo aos lugares onde a água está sempre presente, ou onde é difícil garantir a erradicação bacteriana em uma base contínua, tais como trocadores de calor ar-condicionado, quartos de banho e dispositivos médicos. Estes tipos de biofilmes causam odor e doenças infecciosas crônicas5,6.

Normalmente, produtos químicos ou antibióticos compostos químicos são utilizados para inibir o crescimento de bactérias que podem formar biofilmes. O surgimento de bactérias resistentes aos antibióticos e preocupações sobre a segurança na vivo de produtos químicos estão conduzindo a necessidade de desenvolver novos materiais para evitar a formação de biofilmes e para inibir o crescimento de bactérias.

Neste estudo, antimicrobianos nanomateriais são sintetizados que são livre de toxicidade e resistência aos antibióticos. A prata é uma substância antimicrobiana conhecida, e desenvolvimentos recentes em Nanociência e nanotecnologia conduziram a investigação sobre os efeitos antimicrobianos de nanopartículas de metal7,8. Estudos recentes têm relatado que o pequeno tamanho e alta proporção de superfície e o volume das nanopartículas resultam em aumento da atividade antibacteriana de10,9,11.

Os nanomateriais apresentados combinam nanopartículas de prata com propriedades antimicrobianas aumentada e nanotubos de carbono com uma proporção elevada, aumentando assim a área de superfície por unidade de volume. O composto de nanotubo de nanopartículas de prata fabricados-carbono apresenta propriedades antimicrobianas substanciais e mínima toxicidade às células humanas e animais. Os processos sintéticos em estudos anteriores usam perigosos agentes redutores tais como4NaBH, formamida, dimetilformamida e hidrazina. O processo é demorado, complicado e perigoso. O processo sintético relatado aqui usa etanol como agente redutor significativamente menos perigoso.

A zona de inibição e concentração bactericida mínima (MBC) para os Ag-MWCNTs foram medidos; Ao vivo/morto e azul Trypan ensaios foram usados para medir a toxicidade e propriedades antibacterianas. Concentração inibitória mínima (CIM) e ensaios de toxicidade mitocondrial (MTT) não foram realizados devido a cor incomum os de nanotubos de carbono que poderia ter interferido com os ensaios. Finalmente, determinou-se a concentração mínima para impedir o crescimento de Methylobacterium spp. sem afetar células de mamíferos.

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Protocolo

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1. MWCNT oxidação

  1. Medir 30-50 mg de MWCNT dentro de um frasco de 50 mL. Lentamente, adicionar 8 mL de um H2então4: solução de3 HNO (90% da concentração inicial, 3:1 vol/vol) com uma pipeta com pontas de pipetas de 1 mL.
    Atenção: Esta preparação deve ser conduzida em uma coifa de química.
    1. Permita a 30 min. para a reação exotérmica completar.
  2. Proceda à sonicação a solução a 60-80 ° C e 160 W para 1 h até MWCNT instala-se na parte inferior do frasco.
    Atenção: O nível da água no sonicador deve ser menor do que a parte superior do frasco para que a água não será introduzida dentro do frasco.
  3. Transferi a solução para um tubo de centrifugação.
    1. Com uma micropipeta, adicione 30 mL de água destilada gota a gota à solução MWCNT-COOH.
      Atenção: Uma forte reação exotérmica ocorre durante a adição de água destilada. Adicionar a água destilada lentamente e permitir tempo para refrigerar.
  4. Centrifugue a solução MWCNT-COOH a 12.000 x g e a temperatura ambiente por 15 min.
    Cuidado: Ao operar uma centrífuga, certifique-se de que centrífuga permanece equilibrada pela colocação de um tubo com o mesmo peso em frente do tubo de amostra.
  5. Remova o sobrenadante com uma pipeta e a ponta da pipeta de 1 mL. Adicione 5 mL de etanol com uma pipeta e a ponta da pipeta de 1 mL. Lave as paredes do frasco com etanol pipetado adicional. Centrifugue a solução a 12.000 x g e a temperatura ambiente por 15 min.
    1. Determine o pH de sobrenadante com papel de pH. Repeti a lavagem e a centrifugação até que o sobrenadante pH neutro.
  6. Remova todos os sobrenadante. Adicione 1 mL de água destilada para precipitar e dispersar MWCNT-COOH uniformemente em solução. Congela a-60 ° C sob vácuo até secar.

2. deposição de nanopartículas prata na MWCNTs

  1. Coloque 10 mg de MWCNT-COOH em um tubo cónico de 50 mL e diluir com 30 mL de água destilada. Proceda à sonicação solução a 60 ° C e 160 W por 1h.
  2. Coloque 6 mL de 0.1 N AgNO3 em um tubo cónico de 50 mL e diluir com 18 mL de água destilada. Proceda à sonicação solução a 60 ° C e 160 W por 1h.
    Atenção: Adicione AgNO3 proporcionalmente à massa total da MWCNTs tais que a massa total do Ag não exceda 20%.
  3. Adicione a solução de3 AgNO gota a gota à solução com uma pipeta e a ponta da pipeta de 1 mL MWCNTs enquanto sonicating a mistura a 60 ° C e 160 w. Continue sonicating por 1h depois da adição do AgNO3.
  4. Centrifugue a solução a 12.000 x g e a temperatura ambiente por 15 min e retirar o sobrenadante. Centrifugue a solução e remover o sobrenadante mais duas vezes.
  5. Adicionar 1 mL de água destilada para a mistura de Ag-MWCNTs e dispersar o precipitado uniformemente na solução. Adicionar 5 mL de etanol e permitir a reação proceder à temperatura ambiente durante 1 h.
  6. Centrifugue a solução a 12.000 x g e a temperatura ambiente por 15 min e retirar o sobrenadante.
  7. Determine o pH de sobrenadante com papel de pH. Repeti a lavagem e a centrifugação até pH sobrenadante é neutro.
  8. Adicionar 1 mL de água destilada para Ag-MWCNTs e dispersar uniformemente em solução. Congela a solução a-70 ° C sob vácuo por 24 h.

3. zona de inibição teste

  1. Misture 18,12 g de ágar-ágar R2A e 1 L de água destilada num balão. Esterilize a mistura em uma autoclave a 121 ° C por 15 min.
  2. Permitir que o gel de arrefecer à temperatura ambiente. Coloque 10 mL de gel em placas de Petri antes da têmpera para preparar o meio sólido.
  3. Lugar de 100 µ l de bactérias em meio sólido. Espalhe as bactérias no meio sólido usando um difusor.
    Atenção: Este procedimento deve ser conduzido em uma coifa química iluminada com uma lâmpada de álcool.
  4. Incube os pratos a 30 ° C, durante 48 h.
  5. Misture 3,12 g de R2A caldo com 1 L de água destilada num balão. Esterilize a mistura em uma autoclave a 121 ° C por 15 min.
  6. Transferir as colônias crescidas para um meio líquido, usando um loop e agulha e incubá-los numa incubadora a 180 rpm e 30 ° C.
  7. Registre o valor de OD (densidade óptica) por espectrofotometria UV em 600 nm numa base horária para medir o crescimento bacteriano.
    Nota: Ágar R2A foi usado neste teste, em vez do padrão Ágar Mueller-Hinton, porque R2A é o ágar preferencial para crescimento de Methylobacterium spp.
  8. Lugar 10 mL do preparado ágar R2A em uma placa de Petri para preparar um ágar de fundo.
    1. Misture 3,12 g de caldo R2A e 8 g de ágar com 1 L de água destilada. Esterilize a mistura em uma autoclave a 121 ° C por 15 min. lugar de 10 mL deste gel no agar inferior.
  9. Carrega 50 µ l de solução de Ag-MWCNTs no disco de papel estéril com uma micropipeta.
    1. Secar e esterilizar amostra Ag-MWCNTs em uma câmara de vácuo sob UV luz por 30 min.
  10. Amostra de lugar Ag-MWCNTs no ágar.
  11. Incube a placa de ágar a 30 ° C, durante 48 h.
  12. Zona de medida de inibição de12.
    Nota: As instruções para o software usado estão incluídas nas referências.

4. teste antibacteriano

  1. Repita as etapas de 3.1 a 3.7 para preparar a cultura bacteriana.
  2. No máximo OD, inocule 100 µ l de bactérias em 3 mL de meio líquido fresco com uma ponta de micro pipeta pipeta e 100 µ l.
  3. Preparar cinco 50 amostras µ l da solução de controle em tubos cônicos de 15 mL. Adicione o seguinte para cada tubo: 1) metanol; 2) 1000 µ g/mL MWCNT-COOH; 3) 50 µ g/mL Ag-MWCNTs; 4) 40 µ g/mL Ag-MWMWCNTs; 5) 30 µ g/mL Ag-MWCNTs.
  4. Incube a 180 rpm e 30 ° C até que o controle é maximamente ativo conforme determinado por espectrofotometria UV conforme descrito acima.
  5. Medir o valor de OD de cada amostra e calcular a concentração de MIC. O valor de OD está diretamente relacionado ao número de células bacterianas em caldo de amostra.
  6. Espalhe as bactérias cultivadas em meio sólido com um espalhador.
  7. Incube o prato a 30 ° C, durante 48 h.
  8. Contagem de colônias bacterianas e os valores da CFU de medida para determinar a atividade antibacteriana12.
    Nota: As instruções para o software usado estão incluídas nas referências.

5. ensaio da viabilidade

  1. Depois de remover as células de cultura da incubadora, o médio de sucção e lavar três vezes com uma lavagem gota a gota de 5 mL de PBS.
  2. Adicione 1 mL de tripsina-EDTA em PBS para a célula lavada e sucção após 1 min.
    1. Bata a placa para remover células presas.
  3. Adicionar 5 mL de DMEM (médio modificado águia de Dulbecco) e em seguida, retire as pilhas. Centrifugar as amostras a 200 x g por 3 min e retirar o sobrenadante.
    1. Adicione 1 mL de DPBS e misture.
    2. Contar as células de 10 µ l da solução com uma máquina automatizada de contagem de células.
      Nota: Instruções para a máquina de contagem de células utilizadas constam as referências13.
  4. Coloque 1 × 105 de AML12 células por poço em uma placa de seis contendo solução DMEM. O meio contém antibiótico estéril de 1% e 10% (v/v) de soro fetal bovino.
  5. Incube a placa para 8-12 h a 37 ° C, em um ambiente de ar 95% 5% CO2.
  6. Aspire o sobrenadante de poços com um aspirador.
    1. Adicione a cada amostra composta de controle, NMS-DMSO (Dimetilsulfóxido) e 30-40 µ g/mL Ag-MWCNT a 1 mL de DMEM.
    2. Incube a 37 ° C, em um ambiente de ar 95% 5% CO2para 8 h.
  7. Remova o sobrenadante e lavar as amostras com 5 mL de PBS.
  8. Adicione 1 mL do preparado ao vivo/morto kit (20 µ l de 2 mM, EthD-1 com 5 µ l de 4mm calceína AM em DMSO em 10 mL de PBS) gota a gota para a célula.
  9. Incube a room temperature por 30-45 min ou a 37 ° C por 10 min. fluorescência medida com microscopia de fluorescência padrão 100 X ou 300 X.

6. ensaio de azul de Trypan

  1. Prepare as amostras de acordo com passos 5.1 através de 5.6.2 acima.
  2. Remova o sobrenadante.
  3. Lave a placa com 1 mL de 1 x DPBS e decantar.
  4. Adicione 1 mL de tripsina a placa e incubar durante 3 min separar as células de cultura. Use o meio de cultura celular para lavar prato e recolher as células. Coloque as células coletadas em um tubo de 15 mL.
  5. Centrifugar o tubo a 200 x g e 4 ° C por 3 min.
  6. Descarte o sobrenadante. Adicione 1 mL de meio fresco de centrifugado e re-dispersar as células.
  7. Adicionar 10 µ l de trypan azul com 10 µ l de células dispersas e contar as células com uma máquina automatizada de contagem de células.
    Nota: Instruções para a máquina de contagem de células utilizadas estão incluídas nas referências.

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Resultados

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Imagens de microscopia eletrônica (TEM) transmissão confirmam a formação de Ag-MWCNTs (figura 1A e 1B). Sua síntese bem sucedida foi confirmado pela mudança na carga de superfície. Calculou-se o tamanho das partículas depositadas sobre os MWCNTs Ag (Figura 1). O tamanho médio da partícula foi aproximadamente 3.83 nm. O padrão XRD dos MWCNTs-Ag-sintetizados como é mostrado na Figura 1

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Discussão

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Aqui, nós relatamos um método simples para a preparação de MWCNTs com nanopartículas de Ag depositadas. Esse nanomaterial contendo prata demonstra substancial atividade antibacteriana e mínimo potencial de absorção descontrolada de nanopartículas de prata no corpo. Demonstramos que 30 µ g/mL de Ag-MWCNTs sintetizados é um nível eficaz de atividade antibacteriana contra Methylobacterium spp. com insignificante citotoxidade de células de fígado de mamíferos. Embora as melhorias adicionais e avaliações de biossegur...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo foi suportado por bolsas de investigação de Universidade Chung-Ang (2016) e pelo programa de desenvolvimento de tecnologia de Nano-materiais através do nacional Research Foundation de Korea(NRF) financiado pelo Ministério da ciência e TIC (n º 2017M3A7B8061942).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,1 nitrato de prataN SIGMA-ALDRICH1090811000
nanotubo de carbono,Tokyo Chemical Industry Co., LTD308068-56-6
R2A ágarMBcellMB-R1129
R2A caldoMBcellMB-R2230
Methylobacterium spp.KCTC12618da Coleção da Coreia para Culturas de Tipo Daejeon Korea 12618, Daejon, Korea
Kit de imagem de células VIVAS/MORTASThermoFisher SCIENTIFICR37601
AML12da Universidade de Chungnam, Dajeon, Coréia
humano PBMCATCCPCS-800-011
TEMJEOLJEM-2100F
XRDRigaku D/MAX 2500Fonte de fótons K (40kV, 100mA)
JuLI BrNanoEnTekJULI-BRSC 

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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