Summary
Det här protokollet beskriver en enkel och bekväm metod för att märka och visualisera levande kromosomer i mitotiska celler med Histone2B-GFP BacMam 2.0 etikett och en snurrande skiva konfokalmikroskopi system.
Abstract
Kromosomer måste vara tillförlitligt och enhetligt uppdelade i dottercellerna under mitotiska celldelningen. Trohet av kromosomala segregation styrs av flera mekanismer som inkluderar den spindel montering Checkpoint (SAC). SAC är en del av ett komplext feedbacksystem som ansvarar för förebyggande av en cell framsteg genom Mitos såvida inte alla kromosomala kinetochores har bifogats till spindel mikrotubuli. Kromosomala släpar och onormal kromosom segregation är en indikator på dysfunktionella cellcykeln kontroll kontrollpunkter och kan användas för att mäta genomisk stabilitet delande celler. Avreglering av SAC kan resultera i att omvandla en normal cell till en elakartad cell genom ansamling av fel under kromosomala segregation. Genomförandet av SAC och bildandet av den komplexa Kinetochor är hårt reglerad av interaktioner mellan kinaser och fosfatas såsom Protein fosfatas 2A (PP2A). Det här protokollet beskriver levande cell avbildning av släpar kromosomer i mus embryonala fibroblaster isolerade från möss som hade en knockout av den reglerande PP2A-B56γ-subenheten. Denna metod övervinner bristerna i andra cellcykeln kontroll avbildningstekniker såsom flödescytometri eller immuncytokemi som endast ger en ögonblicksbild av en cell cytokines status, i stället för en dynamisk spatiotemporal visualisering av kromosomer under Mitos.
Introduction
I följande protokoll beskriver vi en smidig metod för att visualisera kromosomala segregering och mitotiska progression under cellcykeln i mus embryonala fibroblaster använder Histon 2B-GFP, BacMam 2.0 märkning och levande cell imaging.
Cellcykeln kontroll kontrollpunkter övervaka kromosomsegregering och spelar en viktig roll i upprätthållandet av genetisk integritet av cell 1,2,3. Ansamling av mis segregerade kromosomer kan leda till aneuploidi, vilket är ett signum för mest solida tumörer 4. Påvisande av släpar kromosomer kan därför användas som en metod för att studera kromosominstabilitet.
Fluorescently märkt proteiner kan vara används för att visualisera levande kromosomsegregering och kromosomala släpar efter men generationen av mCherry-märkta eller H2B-GFP taggade protein kräver omfattande kunskap om gen leverans och molekylärbiologi 5. Här beskriver vi CellLight Histone2B-GFP BacMam 2.0 reagens, nedan kallad CL-HB regent, för enkelhetens skull. Denna reagens kan användas omedelbart och därmed eliminerar oro vektor kvalitet och integritet. Dessutom kräver denna reagens inte användning av potentiellt skadliga behandlingar eller lipider och dye-lastning kemikalier. Till skillnad från konventionella fluorescerande etiketter, CL-HB regent fläckar oberoende av funktion (dvs., membranpotential). CL-HB regent kan enkelt läggas till cellerna och inkuberas över natten i proteinuttryck. CL-HB regent replikerar inte i däggdjursceller och kan användas i biosäkerhet nivå (BSL) 1 laboratoriemiljö. Också, denna övergående transfection kan upptäckas efter natten inkubation för upp till 5 dagar, tillräckligt med tid för att genomföra mest dynamiska cellulära analyser.
Alternativt kunde kromosomavvikelser studeras av olika tekniker såsom flödescytometri, immunohistokemi eller fluorescens i situ hybridisering (FISH) 6. Flödescytometri kan användas för att studera aneuploidi, som kan mätas utifrån DNA-innehåll och fasen av celler i cellcykeln. Även om flödescytometri kan användas att mäta aneuploidi, ger den inte information om kromosomala felaktig segregation. FISK och immunohistokemi tekniker använda fluorescerande sonder för att binda till DNA eller kromosomer. Medan dessa tekniker ger en ögonblicksbild av status för en population av celler, tillåter de inte levande cell imaging därmed saknas någon information som erhållits genom spatiotemporal visualisering av cytokines i specifika celler följde över en tidsperiod.
Detta protokoll användes för att studera släpar kromosomer eller kromosomala mis segregation i nocodazole behandlade mus embryonala fibroblaster (MEFs) isolerade från PP2A-B56γ-möss. Utöver ovan tillämpning ger detta protokoll ett enkelt verktyg för att märka och visualisera kromosomala segregering i olika celltyper som kan användas för att studera cellcykeln förordning eller kromosomal instabilitet i tumörceller. Det kan dessutom också användas att studera kromosomal instabilitet som orsakas av olika läkemedelsbehandlingar eller studera effekterna av genen knocka resulterar i kromosomala mis segregation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla de experiment som genomförs i dessa studier utfördes i enlighet med protokoll som godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén vid den Food and Drug Administration (FDA) forskningsanläggningen.
1. isolering och kultur av mus embryonala fibroblaster (MEFs)
- Isolera mus embryonala fibroblaster (MEFs) från en PP2A-B56γ-mus stam och vildtyp littermates genom standard protokoll 7,8,9.
- ExpandMEFs för 3 passager, frysa och lagra tills krävs för experiment 8.
2. odla Mefs i 2-väl kamrar skyddsglaset för Live Imaging
- Bereda 500 mL MEF tillväxt medier som innehåller Dulbecco modifierade Eagle Medium (DMEM/F12) med 10% fetalt bovint Serum (FBS), 1 X Penicillin/Streptomycin antibiotika, L-glutamin (200 mM) och 1 X icke-essentiella aminosyror (NEAA) i en 500 mL-media-flaska.
- Tina injektionsflaskor med frysta MEFs från vildtyp och PP2A-B56γ-möss på passage 3 i förväg värmde vattenbad vid 37 ° C.
- Överför tinade MEFs 15 mL rör och tillsätt långsamt droppvis 20 mL DMEM/F12 media 15 mL rören med 10 mL pipett.
- Överföra MEFs tillsammans med 20 mL av DMEM/F12 tillväxtmassmedia i T75 kolvar och expandera dem tills cellerna är 70% konfluenta. Konfluens uppskattas genom en omvänd Mikroskop på 4 x eller 10 x förstoring.
- Aspirera odlingsmedium med ett glas betesmark Pipettera bifogas ett vakuumsystem i huven, tillsätt 3 mL av 0,25% trypsin/EDTA och inkubera vid 37 ° C i 5 min. Tillsätt 3 mL odlingsmedium DMEM/F12 att stoppa reaktionen.
- Centrifugera cellerna vid låg hastighet (300 x g) under 5 minuter i rumstemperatur. Noggrant avlägsna supernatanten och slamma cellpelleten i 1 mL DMEM/F12 odlingsmedium pre värmas vid 37 ° C i ett vattenbad.
- Räkna celler som använder metoden trypan blå uteslutning eller annan lämplig cell räknar metod 8.
- Utsäde ungefär 20,000 MEFs per brunn i en 2-väl kamrar skyddsglaset. Tillsätt 200 µL per brunn DMEM/F12 odlingsmedium och cellerna att bifoga genom inkubering över natten vid 37 ° C och 5% CO2.
3. synkronisering
- Synkronisera MEFs i G0/G1-fasen av ruva celler DMEM/F12 tillväxt medier som innehåller 0,1% FBS för 24 h, att få ett maximalt antal celler i G0/G1-fasen.
Obs: Även om serum svält användes som en metod för preferenser, olika andra metoder kan användas beroende på mitotiska stadium där celler behövs för att bli arresterade 10.
4. märkning
- Förbereda 1,5 mg/mL stamlösning av nocodazole i DMSO. Nocodazole gripanden celler på G2/M fas genom att hämma mikrotubulära bildandet 10.
- Tre dagar efter synkronisering, tillsätt 200 µL av odlingsmedium (med 10% FCS), 200 ng/mL nocodazole och CL-HB regent (Histon 2B-GFP BacMam 2.0).
- Beräkna CL-HB regent partiklar Per Cell (PPC) läggas till celler som följer:
Där antalet celler är det beräknade totala antalet celler vid tidpunkten för märkning, PPC är antalet partiklar Per Cell, och 1 × 108 är antalet partiklar per mL reagens. Exempelvis till etikett 20.000 celler med en PPC 30
Obs: CL-HB regent fungerar bra med de flesta celltyper mellan 10 och 50 PPC. Dock fungerat 30 PPC bäst för denna studie. - Inkubera MEFs i 18 timmar vid 37 ° C och 5% CO2.
Obs: För aktuella experimentet, visualisering av kromosomer i mitotiska celler flyr spindel montering checkpoint inträffade 18 h efter cellcykelarrest med nocodazole.
5. visualisering av släpar kromosomer
- Visualisera mus embryonala fibroblaster (MEFs) använder en snurrande disk confocal Mikroskop system utrustade med en klimatkammare och en oljeimmersion, 63 x objektiv.
- Använda excitation våglängd av 488 nm och utsläpp våglängd 450 nm för god Jordbrukarsed kanal bild förvärv.
- Använd en snurrande disk confocal Mikroskop system med möjlighet att motoriserade skanning stadier, Z-Piezo infogas, scenen-top inkubation och direkta fluorescens återhämtning efter foto blekning för denna teknik.
- En dag innan imaging, vrid på miljökammare makt och värma upp hela kammaren vid 37 ° C under natten.
- Aktivera power ON för mikroskopstativet, kamera, spinning diskenhet, illuminator, argon laser, dator och motoriserade scenen.
- Låt systemet varma upp för 3 min; Starta argon laser genom att vrida på startnyckeln. Växla omkopplaren för argon laser från ”standby” till ”laser kör”.
- Starta data framtagande och bearbetning programvara.
- Initiera i CO2 controller för scenen övre inkubatorn och ange koncentrationen av CO2 på 5%. Detta måste göras innan påbörjandet av imaging.
- Ta bort kamrar täckglaset från inkubator och plats på scenen för visualisering. Visualisera celler via en olja nedsänkning 63 x objektiv (NA1.4).
- Visa genom okulär linserna, fokusera bilden och identifierar en cell i kärn kuvert uppdelning (NEBD) steg.
- Initiera lämplig laser (488 nm argon laser att visualisera Histone2B-GFP).
- Öppna kontrollfönstret för förvärv och ange exponeringstid för god Jordbrukarsed kanalen. Identifiera en cell som är i NEBD.
- Manuellt avgöra målet cellens övre och undre fokalplanet och ange xyz optisk snittning inställningar.
- Observera den för 20 min; om cellen inte slutligt genom celldelning, stoppa bild förvärv efter 20 min och gå vidare till nästa cell i NEBD.
- Ca 1 h per cell behövs till bilden släpar kromosomer under Mitos i PP2A-B56γ-celler som rymt från SAC. För att erhålla data för en film, ta bilder var 3 minut.
Obs: vildtypceller arrestera och framsteg inte förbi NEBD när de behandlas med nocodazole. - Spara bilder i zvi filformat för vidare analys.
6. bild bearbetning och analys
Obs: Utföra tredimensionell bildbehandling och analys med hjälp av alla tillgängliga programvara såsom Axiovision version 4.8.2 eller Imaris version 8,2. För denna studie ImageJ användes programvara.
- Öppna bildsekvens. Om bilderna är redan i en stack format, Fortsätt till nästa steg. Om inte, kombinera alla relevanta bilder till en stack med ' bild > staplar > bilder till Stack' i menyraden.
- Utför eventuella justeringar som krävs till ljusstyrka/kontrast och nivåer.
- Lägg till en tidsstämpel till filmen:
- Gå till ' bild > staplar > etikett...' i menyraden.
- Välj lämpligt format, tid startvärdet och tidsintervallet mellan varje bild.
- Markera rutan 'Förhandsgranskning' och justera läge-och formatinställningar. Tryck på 'OK' för att tillämpa tidsstämpeln.
- Lägga till en skalstapeln filmen:
- Ange bilden skalning ' Analyze > Ange skala ”i menyraden.
- Ange ett antal pixlar där avståndet är känt i fältet 'Avståndet i pixlar', och i fältet 'Känd distans' ange avståndet. Ställ in rätt längd för avstånd, t.ex., i µm. Tryck 'OK' för att tillämpa den på stacken.
- Gå till ' Analyze > Verktyg > skala baren..' att lägga till skalstapeln. Ange storleken på baren som 'Bredd i µm' och justera de återstående formateringsalternativ som är lämpligt. Markera rutan 'Märka alla skivor' för att lägga till skalstapeln hela bunten.
- Förhandsgranska filmen genom att klicka på knappen triangulära spela på nedre vänstra kanten av bildfönstret. Justera frame rate med ' bild > staplar > Animering > Animation alternativ i menyraden.
- Exportera filmfilen genom att välja ' fil > Spara som > AVI...' och välj bildhastighet och komprimering.
- Tryck på 'OK' för att välja Spara plats och ett filnamn. Tryck 'Spara' för att spara sedan filmfilen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MEFs från vildtyp och PP2A-B56γ-möss var seedad i en 2-väl kammaren täckglaset och tillåtet att fästa. Dag 2, MEFs synkroniserades med 0,1% FBS för 24 h. Dag 3, MEFs i media med 200 ng/mL nocodazole och 30 PPC CL-HB regentwere inkuberas i 18 h på 37° C och 5% CO2. På dag 4, var cellerna avbildas med en snurrande disk confocal Mikroskop system (figur 1). Levande cellen imaging användes för att visualisera ödet för enskilda celler som de utvecklats från NEBD genom Mitos (figur 2). Nocodazole är känt för att arrestera vildtypceller G2M skede genom att störa mikrotubuli bildas. Det observerades att inlägget nocodazole behandling vildtyp celler greps vid metafas övre panelen (figur 2). Vi observerade att avsaknaden av PP2A-B56γ försvagas cellcykeln kontroll, som tillät PP2A-B56γ-MEFs att övervinna cellcykelarrest inducerad av nocodazole 9. Dessutom upptäcktes onormal kromosomala segregering i 62% (13 av 21) av mitotiska PP2A-B56γ-MEFs behandlas med nocodazole (visas med gula pilar i undre panelen i diagram 2). Fem av de PP2A-B56γ-MEFs greps på NEBD och 3 gick igenom Mitos utan observerbara defekter. Däremot alla 21 vildtypceller som var avbildade gå inte igenom Mitos och befanns arresteras av metafas (övre panel figur 2).
Figur 1 . Grundläggande flödesschema för levande cell imaging. MEFs från vildtyp och PP2A-B56γ-möss var seedad i en 2-väl kamrar täckglaset över natten. Dag 2, celler synkroniserades med 0,1% FBS för 24 h. dag 3, celler behandlades med 200 ng/mL nocodazole i tillväxt medier och 30 PPC Histon 2B-GFP, BacMam 2.0 reagens för 18 h. dag 4 cellerna var avbildas med hjälp av spinning disk confocal Mikroskop system. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Kromosomavvikelser identifieras i PP2A-B56γ-MEFs. Tid förflutit mikroskopi levande bilder tagna vid olika tidpunkter i Mitos (0-51 min) av nocodazole behandlas vildtyp och PP2A-B56γ-MEFs. Vildtypceller befanns arresteras på metafas (övre panel), medan PP2A-B56γ-MEFs kunde gå genom Mitos (nedre panelen). Kromosomala släpar eller felaktig segregation kan ses i PP2A-B56γ-MEFs visas av gula pilar i den nedre panelen. Skalstapeln = 5 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cellcykeln kontroll kontrollpunkter som säkerställer korrekt kromosomsegregering förhindra aneuploidi och cell omvandling 1,2,3. I föreliggande studie, fann vi att inaktivering av PP2A-B56γ resulterade i en försvagad spindel montering checkpoint. Levande cellen imaging tillät oss att iaktta kromosomala mis segregation under Mitos i PP2A-B56γ MEFs behandlas med nocodazole 9.
Detta protokoll använder tredjeparts Histone2B-GFP etikett genereras av BacMam 2.0-teknik till etikett kromosomer för levande cell avbildning. En av de kritiska steg i märkning beräkning av rätt mängd partiklar per celler (PPC) för att uppnå tillräckligt märkning. Det konstaterades genom titrering som 10-50 PPC fungerar bäst. Denna reagens kan vara giftiga i cellerna; Det är därför nödvändigt att titrera PPC används för att uppnå balans mellan märkning och toxicitet i märkta celler. Också, detta är en övergående transfection och kan upptäckas endast upp till 5 dagar, därför kan det inte vara lämpligt för studier som skulle motivera längre observationsperioder.
Traditionella taggning av protein eller DNA kan kräva komplicerade protokoll, men här använder vi ett reagens som kräver endast en övernattning inkubation med önskad celler. Dessutom bor cell imaging utfördes med hjälp av snurrande skiva konfokalmikroskopi vilket till skillnad från confocal laserscanning mikroskopi är snabbare och minskar fototoxicitet och blekning effekter i levande celler 11. Detta protokoll kan lätt, bekväm metod att märka mitotiska celler och visualisera kromosomala segregation jämfört med andra tekniker såsom fisk, immunohistokemi och flödescytometri. Detta protokoll kan också fånga av släpar kromosomer bilder under Mitos att tillhandahålla ytterligare information som erhölls med traditionella immuncytokemi, fisk eller flöde flödescytometri, vilket gör det möjligt att fånga fenotyperna sådana som släpar kromosom i både tid och rum. Detta protokoll tillåter bekväm, snabb och enkel märkning av kromosomer i mängd olika cellinjer och primära celler, stamceller, nervceller förevigade T-celler 12,13,14.
Olika typer av cellterapi utvecklas med förhoppningar att behandla varierad sjukdom villkor 15. En av utmaningarna med utvecklingen av dessa cellterapi innebär säkerhetsrisker på grund av möjligheten av genetisk instabilitet och uppkomst. Det här protokollet beskriver en bekväm och enkel metod för att etiketten kromosomer i olika celltyper. Det kunde i framtiden användas för att utveckla ett test för att studera och mäta genetisk instabilitet och kvaliteten på cellterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Vi vill tacka Dr Guo-Chiuan Hung och Dr Bharatkumar Joshi för värdefulla synpunkter som förbättrat manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320082 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| MEM Non-Essential amino acids solution (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered saline | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMSO | EMD Millipore | MX 1458-6 | |
| Cryogenic vial storage boxes | Fisherbrand | 10-500-28 | |
| Cryogenic vials | Corning/costar | 431416 | |
| T75 flasks | Cellstar | 658175 | |
| 2 well chambered cover glass | Nunc | 155380PK | |
| Cellometer Vision Cell Profiler | Nexcelom Bioscience LLC | Cellometer Vision Trio | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher Scientific Inc. | C10594 | |
| Zeiss Cell Observer Spinning Disk Confocal Microscope system | Carl Zeiss Microscopy | Zeiss Cell Observer SD | |
| Water Bath | Thermoscientific | 280 series | |
| Incubator | Sanyo commercial solutions | MCO-18AIC (UV) | |
| Class II Biological safety cabinet | The Baker Company | SterilGard | |
| Axiovision software | Zeiss | Ver.4.8.2 | |
| ImageJ software | National Institute of Health | Ver. 1.51r |
References
- Funk, L. C., Zasadil, L. M., Weaver, B. A. Living in CIN: Mitotic Infidelity and Its Consequences for Tumor Promotion and Suppression. Dev Cell. 39, 638-652 (2016).
- Etemad, B., Kops, G. J. Attachment issues: kinetochore transformations and spindle checkpoint silencing. Curr Opin Cell Biol. 39, 101-108 (2016).
- Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S.
- Jallepalli, P. V., Lengauer, C. Chromosome segregation and cancer: cutting through the mystery. Nat Rev Cancer. (2), 109-117 (2001).
- Zhu, L., et al. Mitotic protein CSPP1 interacts with CENP-H protein to coordinate accurate chromosome oscillation in mitosis. J Biol Chem. 290 (45), 27053-27066 (2015).
- Pikor, L., Thu, K., Vucic, E., Lam, W. The detection and implication of genome instability in cancer. Cancer Metastasis Rev. 32 (3-4), 341-352 (2013).
- Varadkar, P., Despres, D., Kraman, M., Lozier, J., Phadke, A., Nagaraju, K., McCright, B. The protein phosphatase 2A B56γ regulatory subunit is required for heart development. Dev Dyn. 243 (6), 778-790 (2014).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (64), e3854 (2012).
- Varadkar, P., Abbasi, F., Takeda, K., Dyson, J. J., McCright, B. PP2A-B56γ is required for an efficient spindle assembly checkpoint. Cell Cycle. 18 (12), 1210-1219 (2017).
- Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nat Protoc. 8 (3), 602-626 (2013).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. J Biomol Tech. 26 (2), 54-65 (2015).
- Versaevel, M., Braquenier, J. B., Riaz, M., Grevesse, T., Lantoine, J., Gabriele, S. Super-resolution microscopy reveals LINC complex recruitment at nuclear indentation sites. Sci Rep. 8 (4), 7362 (2014).
- Wild, T., Larsen, M. S., Narita, T., Schou, J., Nilsson, J., Choudhary, C. The Spindle Assembly Checkpoint Is Not Essential for Viability of Human Cells with Genetically Lowered APC/C Activity. Cell Rep. 1 (8), 1829-1840 (2016).
- Iuso, D., et al. Exogenous Expression of Human Protamine 1 (hPrm1) Remodels Fibroblast Nuclei into Spermatid-like Structures. Cell Rep. 1 (9), 1765-1771 (2015).
- Ratcliffe, E., Glen, K. E., Naing, M. W., Williams, D. J. Current status and perspectives on stem cell-based therapies undergoing clinical trials for regenerative medicine: case studies. Br Med Bull. 108, 73-94 (2013).
