Summary
Denne protokollen beskriver en enkel og praktisk metode for å merke og visualisere live chromosomes mitotisk celler ved hjelp av Histone2B-GFP BacMam 2.0 etiketten og en roterende plate AC confocal mikroskopi system.
Abstract
Kromosomene må være pålitelig og jevnt segregert i datter celler under mitotisk celledeling. Gjengivelse av chromosomal segregering styres av flere mekanismer som inkluderer spindelen montering Checkpoint (SAC). SAC er del av en kompleks feedback-systemet som er ansvarlig for forebygging av en celle fremgang gjennom mitose med mindre alle chromosomal kinetochores har lagt for å vri piskehale som henger. Chromosomal henger og unormale kromosom raseskille er en indikator på dysfunksjonelle celle syklus kontroll sjekkpunkter og kan brukes til å måle genomisk stabiliteten på deler celler. Dereguleringen av SAC kan føre transformasjonen av en normal celle i en ondartet celle gjennom akkumulering av feil under chromosomal raseskille. Gjennomføringen av SAC og dannelsen av kinetochore kompleks er strengt regulert av interaksjoner mellom kinaser og fosfatase som Protein fosfatase 2A (PP2A). Denne protokollen beskriver levende celle avbilding av henger chromosomes mus embryonale fibroblaster isolert fra mus som hadde en knockout av PP2A-B56γ regulatoriske delenhet. Denne metoden overvinner svakhetene ved andre cellen syklus kontroll Bildeteknikker som flowcytometri eller immunocytochemistry som bare gir et øyeblikksbilde av celle cytokinesis status i stedet for en dynamisk spatiotemporal visualisering av kromosomer under mitose.
Introduction
I den følgende protokollen beskriver vi en praktisk metode for å visualisere chromosomal segregering og mitotisk progresjon i cellen syklus i mus embryonale fibroblaster Histone 2B-GFP, BacMam 2.0 merking og levende celle bildebehandling.
Cellen syklus kontroll sjekkpunkter overvåke kromosom segregering og spiller en viktig rolle i vedlikehold av genetisk integriteten til den celle 1,2,3. Akkumulering av mis segregerte kromosomer kan føre til aneuploidy, som er et kjennetegn på mest solide svulster 4. Påvisning av henger kromosomene kan derfor brukes som en metode for å studere chromosomal ustabilitet.
Fluorescently merket proteiner kan brukes å visualisere live kromosom segregering og chromosomal henger men generering av mCherry-merket eller H2B-GFP merket protein krever betydelig kunnskap om gen levering og molekylærbiologi 5. Her beskriver vi bruk av CellLight Histone2B-GFP BacMam 2.0 reagens, heretter kalt CL-HB regent, for enkelhets skyld. Denne reagensen kan brukes umiddelbart og således eliminerer bekymringer om vektor kvalitet og integritet. I tillegg krever denne reagensen ikke bruk av potensielt skadelige behandlinger eller lipider og fargestoff lasting kjemikalier. I motsetning til konvensjonelle fluorescerende etiketter, CL-HB regent flekker uavhengig funksjon (dvs., membran potensial). CL-HB regent kan bare legges til cellene og ruges overnatting i protein uttrykk. CL-HB regent replikerer ikke i pattedyrceller og kan brukes i biosikkerhet (BSL) 1 laboratorium innstillinger. Også kan denne forbigående transfection bli oppdaget etter overnatting inkubasjonstiden for opp til 5 dager, nok tid til å utføre mest dynamiske mobilnettet analyser.
Alternativt kunne kromosomavvik bli studert av ulike teknikker som flowcytometri, immunohistochemistry eller fluorescens i situ hybridisering (fisk) 6. Flowcytometri kan brukes til å studere aneuploidy, som kan måles basert på DNA innhold og fasen av celler i cellen syklus. Selv om flowcytometri kan brukes til å måle aneuploidy, gir det ikke informasjon på chromosomal mis raseskille. FISK og immunohistochemistry bruke fluorescerende sonder binde til DNA eller kromosomer. Disse teknikkene gir et øyeblikksbilde av statusen for en populasjon av celler, tillater de ikke levende celle imaging dermed mangler informasjon innhentet gjennom spatiotemporal visualisering av cytokinesis i bestemte celler fulgte over en tidsperiode.
Denne protokollen ble brukt til å studere henger kromosomer eller chromosomal mis segregering i nocodazole behandlet mus embryonale fibroblaster (MEFs) isolert fra PP2A-B56γ-mus. I tillegg til program over gir denne protokollen et enkelt verktøy for å merke og visualisere chromosomal segregering i ulike celletyper som kan brukes til å studere celle syklus regulering eller chromosomal ustabilitet i kreftceller. Dessuten, kan det også brukes til å studere chromosomal instability forårsaket av ulike medikamentelle behandlinger eller studere virkningene av genet banke ut resultere i chromosomal mis raseskille.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentene utført i disse studiene ble utført i henhold til protokoller godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen på Food and Drug Administration (FDA) forskning anlegget.
1. isolering og kultur av mus embryonale fibroblaster (MEFs)
- Isolere mus embryonale fibroblaster (MEFs) fra en PP2A-B56γ-mus belastning og vill type littermates av standardprotokoll 7,8,9.
- ExpandMEFs for 3 passasjer, fryse og lagre inntil eksperimenter 8.
2. dyrking Mefs i 2-og kamret Cover Glass for Live bildebehandling
- Forberede 500 mL MEF vekst medier med 10% Dulbecco endret Eagle Medium (DMEM/F12) Fetal Bovine Serum (FBS), 1 X Penicillin/Streptomycin antibiotika, L-glutamin (200 mM) og 1 X ikke-essensielle aminosyrer (NEAA) i en 500-mL media flaske.
- Tine ampuller av frosne MEFs fra naturen og PP2A-B56γ-mus på passering 3 i forvarmes vannbad på 37 ° C.
- Overføre tinte MEFs til 15-mL rør og langsomt legger dropwise 20 mL DMEM/F12 media til 15-mL rør med en 10-mL pipette.
- Overføre MEFs sammen med 20 mL DMEM/F12 vekst medier i MT75 flasker og utvide dem til cellene er 70% confluent. Confluency er beregnet ved hjelp av en omvendt mikroskopet på 4 x eller 10 x forstørrelse.
- Leveringstanken vekstmediet bruker et glass beite Pipetter knyttet til et system i panseret, legge til 3 mL 0,25% trypsin/EDTA og ruge ved 37 ° C i 5 min. legge 3 mL DMEM/F12 vekst medium for å stoppe reaksjonen.
- Sentrifuge cellene på lav hastighet (300 x g) i 5 minutter ved romtemperatur. Nøye fjerne nedbryting og å suspendere celle pellet i 1 mL av DMEM/F12 oppblomstringen medium pre varmet på 37 ° C i et vannbad.
- Nummerere celler ved hjelp av metoden trypan blå utelukkelse eller andre aktuelle cellen telling metoden 8.
- Frø ca 20.000 MEFs/godt i en 2-og kamret cover glass. Legg til 200 µL/vel DMEM/F12 oppblomstringen medium, og at cellene å feste med rugende dem over natten på 37 ° C og 5% CO2.
3. synkronisering
- Synkronisere MEFs i G0/G1 fase av rugende celler i DMEM/F12 vekst medier som inneholder 0,1% FBS 24 h, ha et maksimalt antall celler G0/G1 fase.
Merk: Selv om serum sult ble brukt som preferanse, ulike andre metoder kan brukes avhengig av mitotisk scenen der celler er nødvendig for å bli arrestert 10.
4. merking
- Forberede 1.5 mg/mL lager løsning av nocodazole i DMSO. Nocodazole arrestasjoner celler på G2/M fase ved å hemme microtubule formasjon 10.
- Tre dager legge synkronisering, legge til 200 µL av vekst medium (med 10% FCS), 200 ng/mL nocodazole og CL-HB regent (Histone 2B-GFP BacMam 2.0).
- Beregne CL-HB regent partikler Per celle (PPC) legges til cellene som følger:
Der antall celler er estimert antall celler ved merking, PPC er antall partikler Per celle, og 1 × 108 er antall partikler per mL av reagens. For eksempel til etiketten 20.000 celler med en PPC 30
Merk: CL-HB regent fungerer godt med de fleste celletyper mellom 10 og 50 PPC. Imidlertid fungerte 30 PPC best for denne studien. - Inkuber MEFs 18 h 37 ° C og 5% CO2.
Merk: For gjeldende eksperimentet visualisering av kromosomer i mitotisk celler rømmer spindelen montering sjekkpunkt oppstod 18t etter celle syklus arrestasjon med nocodazole.
5. visualisering av henger kromosomer
- Visualisere mus embryonale fibroblaster (MEFs) bruker en spinning disk AC confocal mikroskop system utstyrt med en miljømessig kammer og en oljeneddyp, 63 x linsen.
- Bruk eksitasjon bølgelengde 488 nm og utslipp bølgelengde 450 nm for GFP kanal bildeopptak.
- Bruke en spinnende disk AC confocal mikroskop system med evnen til motorisert skanning stadier, Z-Piezo inn, scenen-top inkubasjon og direkte fluorescens utvinning etter Foto bleking for denne teknikken.
- En dag før bildebehandling, slå miljømessige kammer makt på og varme opp kammeret ved 37 ° C over natten.
- Slå strømmen på for mikroskopstativet, kamera, spinning diskenhet, illuminator, argon laser, datamaskin og motorisert scenen.
- La systemet varme for 3 min; starte argon laser ved å slå på tenningsnøkkelen. Bytte veksleknappen bytte for argon laser fra "standby" til "laser kjøre".
- Starte den og bearbeidingen av programvaren.
- Starte CO2 kontrolleren for scenen topp inkubator og satt konsentrasjonen av CO2 til 5%. Dette må gjøres før begynnelsen av tenkelig.
- Fjerne kamret cover glass fra inkubator og sted på scenen for visualisering. Visualisere celler via en olje nedsenking 63 x linsen (NA1.4).
- Se gjennom okulær linser, fokus bildet og identifisere en celle i kjernefysiske konvolutten nedbryting (NEBD) scenen.
- Starte riktig laser (488 nm argon laser å visualisere Histone2B-GFP).
- Åpne oppkjøpet kontrollvinduet og eksponeringstid for GFP kanalen. Identifisere en celle som er i NEBD.
- Manuelt avgjøre målcellens toppen og bunnen fokalplanet, og angi xyz optisk snitting innstillinger.
- Observere for 20 min; Hvis cellen ikke fortsetter gjennom celledeling, stoppe bildeopptak etter 20 min og gå videre til neste celle i NEBD.
- Ca 1 h per celle er nødvendig å bildet henger kromosomene under mitose i PP2A-B56γ-celler som rømte fra SAC. For å få data for en film, ta bilder hver 3 minutter.
Merk: Wild type celler arrestere og videre ikke forbi NEBD når behandlet med nocodazole. - Lagre bilder i zvi format for videre analyse.
6. image bearbeiding og analyse
Merk: Utføre tredimensjonal bildebehandling og analyse ved hjelp av tilgjengelig programvare som Axiovision versjon 4.8.2 eller Imaris versjon 8.2. For denne studien ImageJ ble programvare brukt.
- Åpne bildesekvens. Hvis bildene er allerede i en stabel format, går du til neste trinn. Hvis ikke, kombinere alle relevante bilder i en stabel med ' bilde > Stakker > bilder til stakken ' i menylinjen.
- Utføre justeringene som kreves til lysstyrke/kontrast og nivåer.
- Legge til en tidsangivelse i filmen:
- Gå til ' Image > Stakker > etiketten...' i menylinjen.
- Velg riktig format, tid startverdien og tidsintervallet mellom hvert bilde.
- Sjekk "Preview" boksen og justere innstillingene plassering og format. Trykk 'OK' bruke tidsangivelsen.
- Legge til en skala bar i filmen:
- Angi bildet skalering "analyser > angi skalaen ' i menylinjen.
- Angi et antall piksler der avstanden er kjent i feltet 'Avstanden i piksler', og i feltet 'Kjent avstand' angir avstanden. Angi den riktige måleenhet for avstand, f.eksi µm. Trykk 'OK' bruke skalaen på stakken.
- Gå til "analyser > Verktøy > skala Språklinje... ' til baren skala. Angi størrelsen på baren som 'Bredde i µm', og justere de resterende formateringsalternativer som passer. Merk av 'Merke alle skiver' for å legge til baren skala på hele stakken.
- Forhåndsvise filmen ved å klikke på trekantet play-knappen nederst til venstre kant av bildevinduet. Juster rammen rate med ' bilde > Stakker > Animasjon > animasjonsalternativer i menylinjen.
- Eksportere filmen ved å velge "Fil > Lagre som > AVI..." og velg bildefrekvens og komprimering.
- Trykk 'OK' for å lagre plasseringen og filnavnet. Trykk "Lagre" for å lagre filmfilen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MEFs fra vill type og PP2A-B56γ-mus var sådd i en 2-vel kammer cover glass og lov til å feste. På dag 2, MEFs ble synkronisert med 0,1% FBS 24 h. Dag 3, MEFs i media med 200 ng/mL nocodazole og 30 PPC CL-HB regentwere ruges i 18 h på 37° C og 5% CO2. På dag 4, ble cellene fotografert med en roterende disk AC confocal mikroskop system (figur 1). Live celle imaging ble brukt til å visualisere skjebnen til enkeltceller som de utviklet seg fra NEBD gjennom mitose (figur 2). Nocodazole er kjent for å arrestere vill type cellene i G2M fase ved å forstyrre microtubule formasjon. Det ble observert at innlegget nocodazole behandling wild type celler ble arrestert på metaphase øvre panel (figur 2). Vi observerte at mangel på PP2A-B56γ svekket kontrollen celle syklus, som tillot PP2A-B56γ-MEFs å overvinne celle syklus arrestasjon av nocodazole 9. I tillegg var unormale chromosomal segregering oppdaget i 62% (13 av 21) av mitotisk PP2A-B56γ-MEFs behandlet med nocodazole (vist med gule piler i nedre panel i figur 2). Fem av PP2A-B56γ-MEFs arrestert på NEBD og 3 gikk gjennom mitose uten observerbare defekter. Derimot alle 21 vill type celler som ble fotografert Fortsett ikke gjennom mitose og ble funnet å bli arrestert av metaphase (øvre panel figur 2).
Figur 1 . Grunnleggende flytskjema for levende celle bildebehandling. MEFs fra vill type og PP2A-B56γ-mus var frø inne en 2-og kamret cover glass over natten. Dag 2, celler ble synkronisert med 0,1% FBS for 24 h. dag 3 celler ble behandlet med 200 ng/mL nocodazole i vekst medier og 30 PPC Histone 2B-GFP, BacMam 2.0 reagens for 18 h. dag 4 cellene ble fotografert med spinning disk AC confocal mikroskop system. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Kromosomavvik oppdages i PP2A-B56γ-MEFs. Tid forfalle mikroskopi levende bilder tatt på ulike tidspunkt i mitose (0-51 min) nocodazole behandlet villtype og PP2A-B56γ-MEFs. Wild type cellene ble funnet å være arrestert på metaphase (øvre panel), mens PP2A-B56γ-MEFs kunne gå gjennom mitose (nedre panel). Chromosomal henger eller mis segregering kan sees i PP2A-B56γ-MEFs vist av gule piler i nedre panel. Skala bar = 5 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cellen syklus kontroll sjekkpunkter som sikrer nøyaktig kromosom segregering hindre aneuploidy og celle transformasjon 1,2,3. I studien, fant vi at inaktivering av PP2A-B56γ resulterte i en redusert spindelen montering checkpoint. Levende celle imaging tillatt oss å observere chromosomal mis segregering under mitose i PP2A-B56γ MEFs behandlet med nocodazole 9.
Denne protokollen bruker Histone2B-GFP etiketten generert av BacMam 2.0-teknologi til etiketten kromosomene for levende celle bildebehandling. En av de viktige trinnene i merking beregner riktig mengde partikler per celler (PPC) å oppnå nok merking. Det ble funnet gjennom titrering som 10-50 PPC fungerer best. Denne reagensen kan være giftig for celler. Derfor er det nødvendig å sjarmere PPC brukes til å oppnå balanse mellom merking og toksisitet for de merkede cellene. Også dette er en forbigående transfection og kan oppdages bare opp til 5 dager, derfor det kan ikke være passende for studier som skulle tilsi lengre observasjon perioder.
Tradisjonelle merking av protein- eller DNA kan kreve komplisert protokoller, men her bruker vi en reagens som krever bare en overnatting inkubasjon med ønsket celler. I tillegg live celle imaging ble utført spinning plate AC confocal mikroskopi som i motsetning til AC confocal mikroskopi for laserskanning er raskere og reduserer Phototoksisitet og bleking effekter i levende celler 11. Denne protokollen tillater enkel metode for å merke mitotisk celler og visualisere chromosomal segregering sammenlignet med andre teknikker som fisk, immunohistochemistry og flow cytometri. Protokollen lar erobringen av henger kromosomene bilder gjennom mitose gir tilleggsinformasjon som får tradisjonelle immunocytochemistry, fisk eller flyt cytometri, og dermed gjør det mulig å fange av fenotyper slik som henger kromosom i både rom og tid. Denne protokollen gir praktisk, rask og enkel merking av kromosomer i rekke cellelinjer, primære celler, stilk celler, neurons og udødeliggjort T-celler 12,13,14.
Ulike typer cellen terapi produkter utvikles med håp om å behandle variert sykdom betingelser 15. En av utfordringer i utviklingen av disse cell behandling innebærer sikkerhet bekymringer på grunn av muligheten for genetisk ustabilitet og tumorigenesis. Denne protokollen beskriver en praktisk og enkel metode til etiketten kromosomer i forskjellige celletyper. I fremtiden kan det brukes til å utvikle en analysen for å studere og måle genetisk ustabilitet og kvaliteten på cellen terapi produkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Dr. Guo-Chiuan Hung og Dr. Bharatkumar Joshi for verdifulle kommentarer som forbedret manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320082 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| MEM Non-Essential amino acids solution (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered saline | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMSO | EMD Millipore | MX 1458-6 | |
| Cryogenic vial storage boxes | Fisherbrand | 10-500-28 | |
| Cryogenic vials | Corning/costar | 431416 | |
| T75 flasks | Cellstar | 658175 | |
| 2 well chambered cover glass | Nunc | 155380PK | |
| Cellometer Vision Cell Profiler | Nexcelom Bioscience LLC | Cellometer Vision Trio | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher Scientific Inc. | C10594 | |
| Zeiss Cell Observer Spinning Disk Confocal Microscope system | Carl Zeiss Microscopy | Zeiss Cell Observer SD | |
| Water Bath | Thermoscientific | 280 series | |
| Incubator | Sanyo commercial solutions | MCO-18AIC (UV) | |
| Class II Biological safety cabinet | The Baker Company | SterilGard | |
| Axiovision software | Zeiss | Ver.4.8.2 | |
| ImageJ software | National Institute of Health | Ver. 1.51r |
References
- Funk, L. C., Zasadil, L. M., Weaver, B. A. Living in CIN: Mitotic Infidelity and Its Consequences for Tumor Promotion and Suppression. Dev Cell. 39, 638-652 (2016).
- Etemad, B., Kops, G. J. Attachment issues: kinetochore transformations and spindle checkpoint silencing. Curr Opin Cell Biol. 39, 101-108 (2016).
- Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S.
- Jallepalli, P. V., Lengauer, C. Chromosome segregation and cancer: cutting through the mystery. Nat Rev Cancer. (2), 109-117 (2001).
- Zhu, L., et al. Mitotic protein CSPP1 interacts with CENP-H protein to coordinate accurate chromosome oscillation in mitosis. J Biol Chem. 290 (45), 27053-27066 (2015).
- Pikor, L., Thu, K., Vucic, E., Lam, W. The detection and implication of genome instability in cancer. Cancer Metastasis Rev. 32 (3-4), 341-352 (2013).
- Varadkar, P., Despres, D., Kraman, M., Lozier, J., Phadke, A., Nagaraju, K., McCright, B. The protein phosphatase 2A B56γ regulatory subunit is required for heart development. Dev Dyn. 243 (6), 778-790 (2014).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (64), e3854 (2012).
- Varadkar, P., Abbasi, F., Takeda, K., Dyson, J. J., McCright, B. PP2A-B56γ is required for an efficient spindle assembly checkpoint. Cell Cycle. 18 (12), 1210-1219 (2017).
- Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nat Protoc. 8 (3), 602-626 (2013).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. J Biomol Tech. 26 (2), 54-65 (2015).
- Versaevel, M., Braquenier, J. B., Riaz, M., Grevesse, T., Lantoine, J., Gabriele, S. Super-resolution microscopy reveals LINC complex recruitment at nuclear indentation sites. Sci Rep. 8 (4), 7362 (2014).
- Wild, T., Larsen, M. S., Narita, T., Schou, J., Nilsson, J., Choudhary, C. The Spindle Assembly Checkpoint Is Not Essential for Viability of Human Cells with Genetically Lowered APC/C Activity. Cell Rep. 1 (8), 1829-1840 (2016).
- Iuso, D., et al. Exogenous Expression of Human Protamine 1 (hPrm1) Remodels Fibroblast Nuclei into Spermatid-like Structures. Cell Rep. 1 (9), 1765-1771 (2015).
- Ratcliffe, E., Glen, K. E., Naing, M. W., Williams, D. J. Current status and perspectives on stem cell-based therapies undergoing clinical trials for regenerative medicine: case studies. Br Med Bull. 108, 73-94 (2013).
