Artigo de método

Identificação de Receptor de dopamina D1-alfa dentro roedores núcleo Accumbens por uma inovador RNA In Situ tecnologia da deteção

DOI:

10.3791/57444

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27 de março de 2018

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1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

Neste artigo

Resumo

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Identificação de receptor de dopamina D1-alfa no núcleo accumbens é fundamental para esclarecer a disfunção do receptor D1 durante uma doença do sistema nervoso central. Realizamos um novela RNA em situ da hibridação do ensaio para visualizar moléculas de RNA única em uma área específica do cérebro.

Resumo

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No sistema nervoso central, os receptores do subtipo de D1-alfa (Drd1α) é o mais abundante receptor de dopamina (DA), que desempenha um papel vital na regulação de desenvolvimento e crescimento neuronal. No entanto, os mecanismos subjacentes a anormalidades do receptor de Drd1α mediando respostas comportamentais e modulando a função de memória de trabalho são ainda pouco claras. Usando um romance RNA em situ da hibridação do ensaio, o atual estudo identificou dopamina Drd1α receptor Tirosina Hidroxilase (TH) RNA expressão e do circuito DA relacionados na área de núcleo accumbens (NAc) e região de substantia nigra (SNR), respectivamente. Drd1α expressão no NAc mostra um "ponto discreto" padrão de coloração. Observaram-se diferenças de sexo claro na expressão de Drd1α. Em contraste, o TH mostra um padrão de coloração "cluster". Em relação a expressão TH, ratos fêmeas exibida uma maior expressão de sinal por célula em relação a animais machos. Os métodos aqui apresentados fornecem uma novela em situ técnica de hibridização para investigar alterações na disfunção do sistema de dopamina durante a progressão de doenças do sistema nervoso central.

Introdução

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Disfunção do sistema de dopamina striatal está envolvida na progressão dos sintomas clínicos observados em várias doenças neurocognitivos. Receptores de dopamina D1 estão presentes no córtex pré-frontal (PFC) e regiões striatal do cérebro e fortemente influenciam processos cognitivos1, incluindo o trabalho de memória, processamento temporal e comportamento locomotiva2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. estudos anterior elucidado que alterações de receptores de dopamina D1 foram associadas com a progressão da atenção défice-Hiperatividade Transtorno (TDAH)8, os sintomas neurocognitivos em esquizofrenia9, 10 e stress susceptibilidade11. Especificamente, na esquizofrenia, estudos de tomografia por emissão de pósitrons (PET) indicaram que a capacidade de ligação dos receptores de dopamina D1 nos córtices pré-frontal foi altamente relacionada com déficits cognitivos e a presença de sintomas negativos11. O crescimento dendrítica de neurônios excitatórios no córtex pré-frontal, regulado pelo receptor de dopamina D1 alivia o stress susceptibilidade. Além disso, o nocaute do receptor D1 em neurônios corticais pré-frontal medial (mPFC) poderá reforçar a derrota social induzida por estresse evitação social12.

Aqui, apresentamos uma nova técnica de hibridação in situ RNA Visualizar moléculas de RNA única numa cela com amostras de tecido fresco congelado. A presente técnica tem várias vantagens sobre os métodos que existem dentro da literatura atual. Primeiro, o procedimento atual preserva o contexto espacial e morfológico do tecido e foi realizado em amostras de tecido fresco congelado, para que outros procedimentos que exigem fresco, tecidos não-incorporado podem ser combinados com os métodos atuais. Procedimentos semelhantes em tecidos fixados em formalina e parafina ilustraram que resolução única transcrição pode ser conseguida usando um RNA em situ da hibridação técnica13. Detecção de RNA no nível de simples transcrição fornece sensibilidade superior à expressão de número de cópia baixa, bem como a oportunidade de comparar a expressão do gene no nível de células individuais que não podem ser alcançados por outros métodos de detecção do ácido nucleico, tais como técnicas de reação em cadeia (PCR) de polimerase. Além disso, o método atual mantém imagens com uma alta relação sinal-ruído através de sondas de RNA altamente específicas que são hibridizadas de transcritos de RNA único alvo e sequencialmente limite com uma cascata de moléculas de amplificação de sinal na identificação sistema. Finalmente, a tecnologia atual oferece a oportunidade de avaliar vários sistemas biológicos com suas sondas proprietárias de destino específico, ao invés de limitar a nossa investigação a apenas uma classe de marcadores relacionados ao sistema, como a detecção de proteínas por métodos de imuno-histoquímica.

Em nosso estudo, usamos esta novela RNA em situ da hibridação para avaliar a expressão de receptores Drd1α no núcleo accumbens (NAc) e Tirosina Hidroxilase (TH) na substância negra (SNR) de ratos de F344/N tanto masculinos como femininos. A inovador RNA em situ hibridação permitiu-nos investigar mecanismos influenciando DA fixação e DA liberação, simultaneamente, melhorar a nossa compreensão das complexidades do sistema striatal DA. Aqui, descrevemos o procedimento para o cérebro fresco congelado fatias e fornecer métodos de análise de dados para diferentes padrões de coloração: "ponto discreto" ou "clusters".

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Protocolo

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O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de uso (IACUC) na Universidade da Carolina do Sul e cuidado Animal (número de garantia federal: A3049-01).

1. preparação das seções do cérebro congelado fresco

  1. Usar a cepa de ratos de F344/N: três ratos de cada sexo, 13 meses de idade, peso cerca de 320 g de corpo.
  2. Ajuste a concentração de sevoflurano para 5% (overdose de sevoflurano). Continue o sevoflurano exposição após a respiração para por um minuto adicional.
  3. Decapitar o rato e remover o cérebro.
  4. Submergir o cérebro de rato em nitrogênio líquido por 15 s dentro de 5 min de colheita de tecidos.
  5. Equilibrar o cérebro a-20 ° C em um criostato por 1h.
  6. 30 µm de seções de corte e transferir para slides (ver Tabela de materiais).
  7. Escolha as seções da região núcleo accumbens, aproximadamente 2,76 mm a 2,28 mm anterior Bregma14.
  8. Continuamente uma fatia do cérebro do rato do bulbo olfactório através da região do núcleo accumbens de acordo com a estrutura cerebral estereotáxica do rato.
  9. Monte as amostras sobre as guias. Manter as secções a-20 ° C por 10 min secar.
  10. Mergulhe imediatamente slides no pre-refrigerados paraformaldeído 4% para 1 h a 4 ° C.
  11. Coloque os slides em um gradiente crescente de etanol à temperatura ambiente (RT): 50% EtOH por 5 min; 70% EtOH por 5 min; e 100% EtOH por 5 min.
  12. Repetir com fresco 100% EtOH.
  13. Coloque slides em papel absorvente e secar ao ar.
  14. Desenhar uma barreira em torno de cada seção com uma caneta de barreira (ver Tabela de materiais). Deixa a barreira secar completamente durante 1 min.

2. pré-tratamento de seções do cérebro

  1. Ligue o forno e regule a temperatura para 40 ° C.
  2. Adicione 3 gotas (90 µ l) de reagente 4 pré-tratamento (ver Tabela de materiais) em cada seção do cérebro (uma seção por slide).
  3. Incubar as seções durante 30 min à RT
  4. Mergulhe os slides em 1X PBS durante 1 min no RT. Repeat com frescos 1X PBS.
    Nota: Slides não devem ficar em PBS 1x por mais de 15 min.

3. o RNA In Situ da hibridação fluorescente Multiplex ensaio

  1. Aquecer a sonda alvo por 10 min a 40 ° C em banho-maria e em seguida, refresque a RT
  2. Coloque o reagente de RNA (por exemplo, o Amp FL 1-4) em RT
  3. Remover o excesso de líquido das laminas com papel absorvente e coloque de volta na prateleira corrediça (ver Tabela de materiais).
  4. Adicione 3 gotas (90 µ l) da sonda Drd1α (C1) sobre a fatia de amostra. Incubar durante 2 h a 40 ° C.
  5. Mergulhe slides em 1x tampão de lavagem por 2 minutos em RT. Repeat com frescos 1x tampão de lavagem.
  6. Retire o excesso de líquido os slides com papel absorvente e coloque de volta sobre o porta-lâminas (ver Tabela de materiais).
  7. Adicione 3 gotas (90 µ l) de Amp 1-FL sobre a fatia de amostra. Incubar durante 30 min a 40 ° C.
  8. Mergulhe slides em tampão de 1 lavagem por 2 min em RT. Repeat com buffer de 1wash fresco.
  9. Retire o excesso de líquido os slides com papel absorvente e coloque de volta sobre o porta-lâminas (ver Tabela de materiais).
  10. Adicione 3 gotas (90 µ l) de Amp 2-FL sobre a fatia de amostra. Incube por 15 min a 40 ° C.
  11. Mergulhe slides em 1x tampão de lavagem por 2 minutos em RT. Repeat com frescos 1x tampão de lavagem.
  12. Retire o excesso de líquido os slides com papel absorvente e coloque de volta sobre o porta-lâminas (ver Tabela de materiais).
  13. Adicione 3 gotas (90 µ l) de Amp 3-FL sobre a fatia de amostra. Incubar durante 30 min a 40 ° C.
  14. Mergulhe os slides em 1x tampão de lavagem por 2 min em RT. Repeat com frescos 1x tampão de lavagem.
  15. Retire o excesso de líquido os slides com papel absorvente e coloque de volta sobre o porta-lâminas (ver Tabela de materiais).
  16. Adicione 3 gotas (90 µ l) de Amp 4-FL-Alt A sobre a fatia de amostra. Incube por 15 min a 40 ° C.
  17. Mergulhe slides em 1x tampão de lavagem por 2 minutos em RT. Repeat com frescos 1x tampão de lavagem.
  18. Remover o excesso de líquido de slides e imediatamente coloque 2 gotas de reagente de montagem (ver Tabela de materiais) para cada seção.
  19. Coloque uma lamela de 22 mm de 22 mm (ver Tabela de materiais) sobre cada seção do cérebro.
  20. Armazenar slides no escuro a 2-8 ° C até secar.
  21. Ligue o microscópio confocal e alternar para um objectivo X 60.
  22. Obter imagens de Z-pilha com um microscópio confocal. Veja o vídeo suplementar para um procedimento de detalhe da imagem latente confocal.
  23. Adquirir imagens de Drd1α rotulado de células na região de núcleo accumbens (excitação: 488 nm; Emissão: 515/30 nm).
    Nota: Não deixe o cérebro seções secam entre as etapas de incubação.

4. análise de dados

  1. Semi-quantitativamente analisar o padrão de coloração: "pontos discretos".
    1. Para identificar a célula individual da imagem, realize DAPI coloração como um marcador nuclear. No entanto, é ainda difícil de analisar determinadas partes do tecido cerebral, uma vez que tem vários tipos de células com forma irregular de núcleos e/ou células. Aqui, dois pesquisadores experientes atribuir separadamente cada célula de imagens para definir a região da célula.
    2. Visualmente, marca cada célula dentro as imagens confocal representativas baseado no número de pontos por célula, usando os critérios específicos (figura 1B).
    3. Determinar o número total de células em cada categoria e dividir pelo número total de células x100 para criar gráficos de frequência relativa que exibem a frequência percentual de células dentro de cada categoria para todas as seções do tecido (Figura 2A) e para os machos e fêmeas separadamente (Figura 2E).
    4. A soma das células dentro de todas as categorias anteriores, dividir pelo número total de células x100 para determinar a frequência cumulativa das células para todas as seções do tecido (Figura 2B) e para os machos e fêmeas separadamente (Figura 2F).
  2. Analise estatisticamente os "pontos discretos" coloração padrão (opcional).
    1. Examinar o número de pontos por celular para fornecer uma variável categórica ordinal na natureza (ou seja, o número de células que caem em cada categoria de classificação da menor expressão celular (1), a mais alta expressão da célula (9)) para mais análises estatísticas.
    2. Após análise das estatísticas descritivas, use três abordagens principais: uma estatística de Mantel-Haenszel, um teste de Mann-Whitney U e um teste de Kruskal-Wallis. Embora a abordagem estatística exata será dependente a questão experimental de design e pesquisa de interesse, uma árvore de decisão estatística (Figura 4) pode ajudar na tomada de decisões em relação a abordagem analítica.
  3. Quantificar a intensidade de sinal na região de interesse (ROI) para coloração padrão: "clusters".
    1. Calcule a intensidade do sinal de cada imagem usando a seguinte equação:
      Intensidade do sinal = intensidade Total de imagem ROI - (fundo de média intensidade × imagem Total área)
    2. Conte o número total de células dentro de imagem ROI para calcular a expressão aproximada de sinal por célula. Grupo as diferenças na intensidade de sinal/imagem, bem como o número de células/imagem podem ser de interesse para considerar os mecanismos que podem contribuir para diferenças de grupo vistas na expressão de sinal/célula (Figura 3B-3D).
  4. Analise estatisticamente os "clusters" coloração padrão (opcional).
    1. Examine a expressão do sinal/celular para fornecer uma variável contínua para posterior análise estatística. Uso de duas abordagens, incluindo um teste t de amostras independentes e análise de variância (ANOVA), com base no número de fatores between-temas incluídas no projeto. Uma árvore de decisão estatística (Figura 4) pode ajudar na tomada de decisões em relação a abordagem estatística mais adequada.

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Resultados

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O atual estudo observou um "pontos discretos" padrão para a expressão de RNA nos receptores de dopamina D1-alfa (Drd1α) de coloração do CCN em ratos F344/N (figura 1A). Sinais de fluorescência individuais foram identificados facilmente e podem ser vistos como único "pontos", cada um deles representa um único transcrito de RNA dentro da célula. Para imagens de NAc que exibem os "pontos discretos" padrão de coloração, avaliamos a gama dinâmica de expressão usan...

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Discussão

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Neste protocolo, descrevemos uma nova técnica de hibridação in situ por fatias de cérebro fresco congelado avaliar a expressão de receptores Drd1α no núcleo accumbens (NAc) e Tirosina Hidroxilase (TH) na região de substantia nigra (SNR). Nós também fornecemos métodos de análise de dados para diferentes padrões de coloração: "ponto discreto" ou "clusters".

Os passos críticos para um ensaio de sucesso fluorescência multiplex do RNA em situ da hibridação são incluídos. Uma vez q...

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Divulgações

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Não há nenhum conflito de interesses para declarar.

Agradecimentos

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As obras presentes foram apoiadas pelo Instituto Nacional de bolsas de saúde (NIH), HD043680, MH106392, DA013137 e NS100624. Fundo parcial foi fornecido por uma concessão de treinamento de NIH T32 na ciência biomédica-comportamental.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Sistema de Forno HybEZDiagnóstico Avançado de Células Sonda RNAscope 310010
- Rn-Drd1aAdvanced Cell Diagnostics 317031Canal de cor 1,
Sonda RNAscope Verde - Rn-Th-C2Advanced Cell Diagnostics 314651-C2Canal de cor 2,
Laranja RNAscope Kit de Reagentes Multiplex FluorescentesDiagnóstico Celular Avançado 320850
ImmEdge Caneta de Barreira HidrofóbicaVector LaboratoryH-4000
SuperFrost Plus SlidesFisher Scientific12-550-154% 
4% de paraformaldeídoSigma-Aldrich158127-500G
SevofluraneMerritt Veterinary Supply347075
Tissue-Tek rack de 24 slides verticalFisher ScientificNC9837976
Tissue-Tek prato de coloraçãoFisher ScientificNC0731403
Precision Banhos de Uso GeralThermoFisher ScientificTSGP28
Pré-tratamento 4Diagnóstico Celular Avançado 320850peças de kits
ProLong Gold reagente anti-desbotamentoLife TechnologiesP36930
Amp 1-FLAdvanced Cell Diagnostics 320850peças de kits
Amp 2-FLAdvanced Cell Diagnostics 320850peças de kits
Amp 3-FLAdvanced Cell Diagnostics 320850peças de kits
Amp 4-FL-Alt AAdvanced Cell Diagnostics 320850peças de kits
Pacote de software EZ-C1Instrumentsversão 3.81b
Software SAS/STATSAS Institute, Inc.,versão 9.4
Nikon

Referências

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