Artigo de método

Avaliação de colágeno e elastina Microarchitectures dependente de pressão nas artérias de resistência humana, ao vivo por microscopia de fluorescência etiqueta livre

DOI:

10.3791/57451

⸱

9 de abril de 2018

 ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular and Renal Research, Institute of Molecular Medicine, University of Southern Denmark, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern Denmark, 3Department of Cardiac, Thoracic and Vascular Surgery, Odense University Hospital

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descrevemos teste mecânico simultânea e imagens 3D de parede arterial isolada, viver artérias de resistência humana e análises de imagem de Fiji e Ilastik para a quantificação de elastina e colágeno espacial organização e volume densidades. Discutimos a utilização desses dados em modelos matemáticos da mecânica da parede arterial.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A contribuição de patogenicidade de resistência artéria remodelação está documentada em hipertensão essencial, diabetes e síndrome metabólica. Investigações e desenvolvimento de modelos matemáticos microstructurally motivados para compreender as propriedades mecânicas das artérias de resistência humana na saúde e na doença têm o potencial para auxiliar a compreensão como doenças e tratamentos médicos afetam a microcirculação humana. Para desenvolver estes modelos matemáticos, é essencial para decifrar a relação entre as propriedades mecânicas e microarquitetura de parede microvascular. Neste trabalho, descrevemos um método ex vivo para testes mecânicos passiva e simultânea de imagem tridimensional livre de rótulo de microarquitetura de elastina e colágeno na parede arterial das artérias de resistência humana isolada. O protocolo de imagem pode ser aplicado para as artérias de resistência de qualquer espécie de interesse. Análises de imagem são descritas para quantificar alterações i) pressão induzida em ângulos ramificação lâmina elástica interna e retidão de colágeno adventícia usando Fiji e densidades de volume ii) colágeno e elastina determinadas utilizando o software Ilastik. De preferência todas as medidas de mecânicas e de imagem são executadas em artérias perfundidas, ao vivo, no entanto, uma abordagem alternativa usando pressão standard de vídeo-microscopia miografia em combinação com pós-fixação imagem de vasos re-pressurizados discutido. Este método alternativo fornece aos usuários com diferentes opções de abordagens de análise. A inclusão dos dados mecânicos e da imagem latente em modelos matemáticos da mecânica da parede arterial é discutida, e propõem-se desenvolvimento futuro e adições ao protocolo.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A contribuição patogénica e efeitos de resistência artéria remodelação estão documentados na hipertensão essencial, diabetes e síndrome metabólica1,2,3,4,5. Decifrar a relação entre as propriedades mecânicas e microarquitetura de parede microvascular é essencial para o desenvolvimento de modelos matemáticos desta associação. Tais modelos irão melhorar a compreensão do processo de remodelação e apoiarão o desenvolvimento de modelos de silico útil para testar estratégias farmacológicas direcionamento doença relacionada a remodelação da parede arterial.

Estudos prévios focada na compreensão de como a microarquitetura da parede arterial refere-se à mecânica da parede arterial, incorporando medidas mecânicas e a microarquitetura da matriz extracelular (ECM) são executadas quase que exclusivamente em grandes , artérias elásticas conduíte de ratos ou suína6,7,8,9,10,11. Imagens das microestruturas de parede geralmente é executada usando técnicas de ópticas não-lineares, aproveitando a autofluorescência de elastina e segunda geração harmônica por colágeno. Isso permite que a imagem spatiotemporal dos dois principais componentes da matriz extracelular, elastina e colágeno, sem a necessidade de coloração. Imagem latente da parede arterial em toda a sua espessura é um desafio em artérias grandes conduit devido à dispersão da luz na mídia grossa túnica. No entanto, para determinar como a microarquitetura dos componentes estruturais da parede arterial se relacionam com as propriedades mecânicas observadas, a informação tridimensional deve ser obtida durante o teste mecânico. Para as grandes artérias como a aorta humana, isso requer montagem biaxial, testes mecânicos e imagem de regiões de interesse em pedaços de2 1-2 cm da parede arterial7,9,10, 12. apenas uma parte da parede pode ser fotografada e testada mecanicamente.

Para artérias menores de qualquer espécie (por exemplo, subcutâneo15 artérias, rato artérias mesentéricas16,17,18, , pulmonar14 e pericárdica humano13 19 , 20, rato cremaster, mesentérica, cerebral, femoral e artérias carótidas21,22,23,24,25,26, imagem de 27) da espessura da parede inteira é possível e pode ser combinada com o teste mecânico. Isto permite a gravação simultânea de propriedades mecânicas e os arranjos estruturais dentro da parede. No entanto, uma modelagem matemática direta da relação entre as alterações observadas na estrutura tridimensional da ECM e alterado as propriedades mecânicas da parede arterial de resistência, o melhor de nosso conhecimento apenas relatou em cima recentemente, na resistência humana artérias13,15.

Neste trabalho, é descrito um método ex vivo para testes mecânicos passiva e simultânea de imagem tridimensional de microarquitetura de elastina e colágeno na parede arterial das artérias de resistência humana isolada. O protocolo de imagem pode ser aplicado para as artérias de resistência de qualquer espécie de interesse. Análises de imagem são descritas para a obtenção de medidas de ângulos de ramificação de lâmina elástica interna e de retidão de colágeno adventícia13 usando Fiji28. Densidades de volume de colágeno e elastina são determinadas usando o software de Ilastik29 , e finalmente, a inclusão dos dados mecânicos e da imagem latente em modelos matemáticos da mecânica da parede arterial é discutida.

O objetivo de descrever as imagem e imagem análises técnicas em combinação com a modelagem matemática é proporcionar a investigadores uma abordagem sistemática para descrever e compreender observadas mudanças de pressão induzida em ECM das artérias de resistência. O método descrito é focado em quantificar as alterações em ECM em um navio durante a pressurização, comparando a estrutura de ECM em 20, 40 e 100 mmHg. Essas pressões foram escolhidas para determinar a estrutura da parede arterial em sua mais compatível (20 mmHg), stiff (100 mmHg) e estado intermediário (40 mmHg), respectivamente. No entanto, qualquer processo na parede vascular das artérias ao vivo, incluindo alterações induzidas por componentes vasoativas, histerese e fluxo, pode ser quantificado, dependendo a hipótese de investigação em questão pelo investigador.

O uso da microscopia de fluorescência de excitação de dois fotões (TPEM) em combinação com um myograph de pressão para mudanças de pressão (ou outro) induziu a estudar em ECM das artérias ao vivo é enfatizado. Primeiro, porque isso permite a aquisição simultânea da estrutura global tridimensional da parede arterial (espessura de diâmetro e parede), juntamente com a aquisição de etiqueta livre tridimensional de alta qualidade, detalhadas imagens de colágeno e elastina microarchitectures como descrito13 , aproveitando a autofluorescência de elastina e colágeno segunda geração harmônica sinal (SHG)30. Em segundo lugar, TPEM permite uso de luz de baixa energia infravermelha excitação, minimizando Fotodano do tecido e assim, imagens repetidas em exatamente na mesma posição dentro da parede vascular é permitido, permitindo análises de medições repetidas do observado alterações.

O uso de uma abordagem alternativa, usando a imagem latente confocal de pressão fixada artérias é discutido para permitir que usuários sem acesso ao TPEM a oportunidade de usar o método descrito também. Informações sobre densidades de ECM estrutura e volume também podem ser obtidas de análises bidimensionais de tecidos seccionados em série, por exemplo, como descrito por31,32. No entanto, devido à falta de possibilidade para recuperar informações estruturais tridimensionais sobre as escalas de comprimento da artéria, bem como durante a mudança de condições usando este método, é que não recomendo usar essa abordagem para investigações de pressão e tratamento induzido por alterações tridimensionais em ECM.

O requisito mínimo para o investigador aplicar o método descrito neste documento é o acesso a uma instalação para canulação e pressurização das artérias em combinação com um microscópio de fluorescência confocal ou dois fotões de excitação. A configuração descrita no seguinte protocolo é um myograph de pressão Custom-Built com um transdutor de força longitudinal, construído para caber em um microscópio de fluorescência personalizado construído invertido dois fotões da excitação.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Coleção de biópsias do pericárdio parietal humano para uso neste trabalho foi realizada após consentimento informado por escrito, como descrito anteriormente,33. O estudo de tecidos humanos em conformidade com os princípios constantes da declaração de Helsinque34 e foi aprovado pelas comissões regionais The sobre ética em pesquisa saúde para sul da Dinamarca (S-20100044 e S-20140202) e a Agência Dinamarquesa de proteção de dados.

1. recolher tecido e artéria de resistência isolada (humanos)

  1. Colete amostras de tecido de interesse imediatamente após a excisão durante uma cirurgia. Transferência do tecido a 4 ° C HEPES buffer sal solução fisiológica (HBS) imediatamente após a coleta e armazená-lo em HBS.
    Nota: Tecidos humanos são apenas recolhidos após a aprovação pelos comités éticos e institucionais, bem como consentimento informado por escrito dos pacientes. Composição de HBS em mM: 144 de NaCl, KCl 4.7, CaCl2 2.5, MgSO4 1.2, KH2PO4 1.2, 14,9 HEPES, glicose 5.5. Ajustar o pH 7,4 com NaOH e filtrar o filtro embora 0,2 µm de solução.
  2. Deixe o tecido coletado no estéril HBS a 4 ° C durante a noite a desbotar anestésicos.
    Nota: Qualquer efeito de armazenamento durante a noite no navio integridade e funcionalidade deve ser verificado pelo laboratório de pesquisa individual.
  3. Isole cuidadosamente artérias de resistência de tamanho (± 200 µm de diâmetro lúmen) usando um par de pinças de ponta afiada e tesoura micro-dissecção.
  4. Armazene as artérias a 4 ° C em HBS gelada enquanto escorva da câmara de pressão/imagem.

2. Monte a artéria isolada no Myograph de pressão

  1. Monte as cânulas de vidro com diâmetros de ponta de ~ 80 µm em suportes de cânulas. Posicione as pontas aproximadamente 150 µm acima do fundo do vidro de câmara.
    Nota: cânulas de ponta dobrada de 45° podem permitir um posicionamento preciso do navio acima do fundo do vidro.
  2. Encha a entrada e a tubulação de saída com HBS com 1% de BSA e se conectar ao sistema de pressão.
    Nota: BSA é incluído para preservar a função da célula endotelial.
  3. Monte a artéria isolada usando duas suturas de nó duplo por cânula.
    Nota: Nós podem ser preparados antecipadamente e armazenados na dupla fita adesiva até que seja necessário.
  4. Encha a câmara com HBS e coloque dois nó duplo em cada cânula de vidro.
    Nota: Quando utilizar artérias exibindo Tom miogênico, HBS deve ser substituído por cálcio que livre HBS suplementado com 3 µM EGTA e nitroprussiato de sódio 3 µM.
  5. Mantenha a artéria suavemente em uma extremidade usando dois pares de pinças de ponta afiada. Abra o lúmen da artéria e delicadamente, deslize-o para a cânula. Corrigi na cânula usando dois nós.
  6. Aplique uma pressão de 5 mmHg para lavar delicadamente o lúmen com HBS / 1% BSA.
  7. Canule a outra extremidade da artéria e fixá-lo na cânula de usando dois nó duplo.
  8. Transferir o myograph para a fase de microscópio e pressurizar a artéria a 5 mmHg (pressão de entrada = pressão de saída), em seguida aqueça a 37 ° C por 30 min.
  9. Opcional: Calibre o transdutor de força longitudinal, de acordo com as instruções do fabricante (g = 9,81 1 mN).
    Nota: É essencial para calibrar o transdutor de força depois de aquecimento como é sensível à temperatura.

3. realizar o experimento: Imagem latente de diâmetro Arterial, espessura de parede e colágeno e elastina microarquitetura usando TPEM

  1. Digitalizar rapidamente a artéria canulada pressurizada a 5 mmHg, usando um objectivo de X 20 (abertura numérica (NA) ≥ 0,8) e luz de excitação de baixa potência para avaliar a espessura de diâmetro e parede de navio em 5 mmHg.
    Nota: Para microscópios invertidos, use um objectivo de imersão de água; para microscópios na posição vertical, use uma água mergulhando o objectivo. Se o objetivo não tem um colar de correção para corrigir para a espessura da lamínula, certifique-se de combinar as lamínulas usadas com o objetivo de usado. As configurações de software e descrições podem variar dependendo do usuário-interfase e microscópio e do software utilizado.
    1. Configure o caminho óptico.
      1. Ativar Mai Tai dois fotões laser e defini-la como luz de excitação 820 nm.
        PRECAUÇÃO: Evite qualquer exposição a luz laser visível, bem como invisível.
      2. Colete de emissão simultaneamente em dois canais. Dividir a emissão de luz entre a photomultipliers usando um 460 nm passe longo espelho dicroico e cobrar emissão usando 30-60 nm ampla selectores centrados em 520 nm (elastina) e 410 nm (colágeno), respectivamente.
    2. Habilite a verificação contínua com 10 µs laser Habitai tempo/pixel e 512 × 512 pixels para o campo de visão de 100%.
    3. Manualmente digitalizar através da artéria para determinar a profundidade onde o diâmetro máximo é observado.
    4. Escolher um pedaço retangular cobrindo o maior diâmetro da artéria e digitalizar um único quadro com pixel tamanho ≤ 300 nm/pixel (Figura 2). Usar como potência de luz de baixa excitação e tempo de interrupção pixel possível evitar photodamaging a artéria ao vivo.
      Nota: É aconselhável obter um Retangular, por exemplo., imagem de pixel 100 × 1024, ao invés de imagem quadrática nessa posição para economizar tempo e limitar a exposição de fóton de tecido (Figura 2).
    5. Salve a imagem para análise posterior.
  2. Determine a espessura de diâmetro e parede de lúmen no diâmetro máximo da artéria.
    1. Carrega a imagem em Fiji.
    2. Definir a escala clicando Main menu | Analisar | definir escala e digite µm/pixel e pixel ratio (é altamente recomendável para manter a proporção de pixel 1:1).
    3. Escolha a ferramenta de linha de Fiji e traçar uma linha entre as duas lâminas elásticas internas de cada lado do lúmen arterial e clique em ctrl + M. Comprimento de relatórios de Fiji como padrão na tabela de resultados.
    4. Da mesma forma, desenhar mais linhas para medir a espessura de cada parede e clique em ctrl + M para medir a marcação a seguir.
    5. Salve as medições.
  3. Imagem microarquitetura de colágeno e elastina em 5 mmHg pela verificação de toda espessura da parede arterial, obtenção de pilhas de imagem 3D com boa qualidade para 1-3 regiões de interesse ao longo do comprimento da artéria.
    1. Obter pilhas de imagem através de toda a parede da artéria usando um 60 X objetivo, at ≥ 1, tamanho do pixel otimizado e z-espaçamento.
      1. Calcular as condições óptimas de imagem (tamanho do pixel e espaçamento de z-passo) em conformidade com o caminho óptico, meio de imersão e índices de refração usando a calculadora científica Volume imagem Nyquist (https://svi.nl/NyquistCalculator) da amostra.
        Nota: Por favor, prestem atenção à diferença entre o tamanho do pixel ideal e z-espaçamento contra o Conselho na seção 3.4. acima sobre o uso de um tamanho de pixel máximo .
    2. Use as mesmas configurações da excitação e emissão de acima (3.1.1.).
    3. Digitalizar rapidamente a parede do vaso, conforme descrito acima para determinar a espessura da pilha-z.
    4. Definir o início de z-pilha e profundidade final, espaçamento de z-passo e densidade de pixel (calculado em 3.3.1.1.) e executar o z-scan. Salve cada canal separadamente.
      Nota: Imagens devem ser suficientemente pequeno , por exemplo, 30 x 30 µm ou 50 × 50 µm dependendo do tamanho do navio para evitar qualquer influência de curvatura nas análises subsequentes de imagem.
  4. Determine o diâmetro arterial, espessura de parede e microarquitetura de elastina e colágeno em pressões restantes do protocolo.
    1. Repito 3.1-3.2 em pressões de 10 e 20 mmHg, repita 3.3 na pressão 20 mmHg.
    2. Repita 3.1 e 3.2 em 40 mmHg de pressão.
    3. 3.1-3.2 às pressões, 60, 80 e 100 mmHg de repetir e repetir 3.3 em 100 mmHg.
      Nota: 3.1-3.3 pode ser repetido para todas as pressões e combinações de pressões (por exemplo, uma série/combinação de pressões crescentes, bem como decrescentes), dependendo da hipótese a ser testada. Eosina em concentração 0,3 - 1 µM podem ser adicionados para aumentar a elastina autofluorescência em caso de fotobranqueamento. Fotobranqueamento pode ser evitado através da aplicação como excitação baixa potência leve quanto possível.
    4. Substitua o tampão na câmara myograph 37 ° C HBS após cada etapa de pressão. Permitir que a artéria se adaptar por 5 min antes da imagem latente após cada alteração na pressão.
  5. Armazenar pilhas de canais separadamente para análises de imagem.
  6. Testar a viabilidade da artéria.
    1. Aplicar 10 µM U46619 na câmara de myograph seguido pela adição de 10 bradicinina µM quando observa-se uma constrição estável.
    2. Gravar o diâmetro e a parede de espessura conforme descrito acima na seção 3.1, mediante a aplicação de cada um dos compostos.
    3. Adicione 3 µM nitroprussiato de sódio, quando a artéria não está totalmente dilatada após a adição da bradicinina e registro de diâmetro e parede de espessura.
      Nota: Dependendo das propriedades farmacológicas da artéria de interesse (cama vascular e espécie) outro vasoconstritor e vasodilatador (endotélio-dependente) compostos podem ser usados.
  7. Opcional: Consertar a artéria pressurizada ou continuar com a imagem de colágeno e elastina para densidades de volume (passo 7).
    1. Adicione 4% de formaldeído em 1 x fosfato salino (PBS) a 37 ° C por 1h.
    2. Lavar a artéria fixa três vezes em PBS 1x e deslize suavemente a artéria fora as cânulas, tocar apenas as partes da artéria fora os maçaricos. Não remover os maçaricos, usá-los para a realização da artéria, ao transferir para um tubo de armazenamento.
    3. Loja em 1 x PBS / 0.05% de azida de sódio a 4 ° C até imagens para outros fins ou densidades de volume de elastina e colágeno.
      Nota: As artérias fixas podem ser armazenadas pelo menos 3 meses no 1 x PBS / 0.05% de azida de sódio a 4 ° C.

4. cálculo de Stress relações de tensão e rigidez intrínseca da parede

  1. Por favor, siga as fórmulas e as etapas de cálculo para o cálculo de tensões, tensões e rigidez de parede conforme descrito por Bloksgaard, M. et al . 13 e referências neste documento.

5. imagem análise - ângulos de ramificação IEL (lâmina elástica interna)

  1. Pilha de abrir imagem em Fiji. Vá para arquivo | abrir imagem para escolher a pilha de imagem.
    Nota: Projeções de intensidade Max de 2-7 consecutivas z-seções cobrindo o IEL (1-2 µm de espessura) são utilizadas para determinar os IEL elastina fibra ramificação ângulos utilizando a ferramenta ângulo em Fiji28,35. Consulte a Figura 4A para ilustração.
  2. Vá para imagem | pilhas | projeto z... para escolher as imagens e "Max projeção de intensidade".
  3. Salve a projeção de máxima intensidade como TIFF.
  4. Escolher como muitos pontos de ramificação fibra IEL possível usando a ferramenta"ângulo" e trabalhar sistematicamente através das imagens. Clique em ctrl + M para medir cada ângulo.
  5. Salve a planilha de resultados de Fiji.

6. imagem análise - colágeno adventícia ondulação

  1. Pilha de abrir imagem em Fiji. Vá para arquivo | abrir imagem para escolher a pilha de imagem.
    Nota: Max projeções de intensidade de 2-7 consecutivas z-seções cobrindo o lado de colágeno fora a lâmina elástica externa (enguia, 1-4 µm de espessura) são utilizados para a determinação de ondulação de colágeno usando o plugin de Fiji NeuronJ36 , conforme descrito por Rezakhaniha, R . et al. 37 (Figura 4B).
  2. Defina a escala. Vá para analisar | definir escala para inserir as dimensões de pixel.
  3. Vá para imagem | pilhas | projeto z... para escolher imagens para trabalhar com e "Max projeção de intensidade".
  4. Alterar o tipo de imagem para 8 bitt TIFF clicando imagem | tipo | 8 bitt e a projeção de intensidade máxima de salvar como TIFF.
  5. Medir a retidão de fibra de colágeno usando o Plugin de J do neurônio de Fiji.
    1. Abra o plugin NeuronJ clicando Fiji | Plugins | Neurônio J.
    2. Abra o TIFF de 8 bits em NeuronJ, clicando em imagem de carga | Selecione o arquivo.
    3. Clique em Adicionar traçadose selecione fibras para analisar clicando no começo e a extremidade de cada fibra.
    4. Clique em traçados de medida, escolha Exibir rastreamento (Lf) e medições de vértice na caixa de diálogo.
  6. Calcular L0/Lf no excel (ou similar) e salvar os resultados.
    1. Copie e cole a saída de traçados e vértices de Fiji neurônio J para excel (ou similar) e calcular L0 usando o teorema de Pitágoras das medições de vértice. Primeiro e o último ponto na linha indicam as posições das extremidades da hipotenusa em um sistema de coordenadas 2D.
      Nota: Um L0/Lf [comprimento de-to-end de pacote de fibra de colágeno através de uma linha reta (L0) / cheio comprimento (Lf)] próximo de 1 indica uma fibra de colágeno quase em linha reta.

7. imagem latente de colágeno e elastina Volume densidades

  1. Lave a artéria (fixa) 1 x em PBS e manchá-la por 15 min em 1 eosina µM em 1X PBS no escuro. Para fixas artérias, execute esta etapa à temperatura ambiente.
    Nota: Eosina realça a fluorescência de elastina. Eosina manchará outras estruturas como o colágeno e o citoplasma da célula, se a amostra for deixada na solução de coloração por tempo prolongado. Se a coloração de outras estruturas é muito intensa, diminuir a concentração de eosina a 0,3 µM ou repetir a lavagem.
  2. Lave a artéria 3 x em 1X PBS
    1. Para artérias fixas: montar a artéria para a imagem latente.
      Atenção: Imagem latente dos navios não pressurizado não permite recuperação de qualquer informação quantitativa geométrica. Quando quantidades absolutas são necessárias, estes devem ser obtidas nas artérias ao vivo, pressurizadas. Rácios de volume podem ser obtidos nas artérias não pressurizado com este método.
      1. Coloque dois pedaços de adesivo duplo fita 1-1,5 cm de distância em um objeto de vidro. Fita adesiva dupla é aproximadamente de 100 µm de espessura. Aplica uma ou mais camadas de fita para coincidir com o diâmetro da artéria a ser montado.
      2. Coloque 10-20 µ l de PBS em vidro no meio da Praça e a artéria no drop-PBS.
        Nota: A entrega deve ser tão pequeno e esguio como possível, para evitar empurrando a artéria fora de posição quando o deslizamento da tampa de montagem.
      3. Colocar a lamela e prima na dupla fita adesiva.
      4. Encha o reservatório entre a lamela e objeto de vidro com 1X PBS. Recarregá-lo a cada hora para evitar a secagem da amostra.
  3. Obter imagem-pilhas de colágeno e elastina densidades de volume usando um objectivo X 20 com nd > 1 para cobrir o máximo de parede arterial quanto possível enquanto continua a ter uma boa resolução óptica (Figura 2D, 2G e 2h).
    Nota: Use um objectivo de imersão de água para geração de imagens das artérias fixas sob uma lamela e use uma água mergulhando o objectivo para a imagem latente das artérias vitais. Se o objetivo não tem um colar de correção para corrigir para a espessura da lamínula, certifique-se de corresponder a lamela ao objectivo. De preferência use o z-espaçamento e tamanho do pixel ideal. Calcule estas usando a calculadora de Nyquist (etapa 3.3.1.1.). Como alternativa, use um tamanho de pixel mínimo de 300 nm e z-espaçamento de 1 µm. Recomenda-se obter três imagens ao longo do comprimento da artéria para permitir ao usuário determinar a variabilidade intraensaio.
  4. Elastina imagem usando 820 nm excitação luz e coletar de emissão usando uma bandpass de largura 30-60 nm filtro centrado em 520 nm.
  5. Colágeno de imagem usando luz de excitação 990 nm para evitar qualquer excitação de elastina e outras proteínas autofluorescent e recolher emissão usando filtrar bandpass largura de 10-30 nm centrado em 495 nm.
  6. Salvar imagem pilhas de cada canal separadamente como arquivos TIFF

8. imagem análise para a extração de elastina e colágeno densidades de Volume usando Ilastik

  1. Converter pilhas de imagem TIFF para HDF5 usando Fiji28,35 clicando em escolher arquivo | Salvar como... HDF5.
  2. Crie duas pastas de arquivo de dados no disco rígido do computador para elastina, para pilhas de imagem de colágeno, respectivamente. Copie pilhas imagem relevantes para a pasta relevante.
  3. Crie dois novos projetos de Ilastik no software Ilastik, uma de elastina, um para colágeno, respectivamente.
    1. Abrir Ilastik | Criar novo projeto | classificação de pixel | novo projeto | Adicionar dados e selecione imagem pasta criada no passo 8.2.
      Nota: Siga o assistente de Ilastik.
  4. Importe uma pilha de imagem 3D para treinar o software.
    1. Selecione o applet entrada dados | área principal de trabalho | Guia de dados cru | Adicionar novo... | Adicionar imagem (ns) separado e escolher os dados de imagem desejada
  5. Escolha as características relevantes no software.
    1. Miniaplicativo de seleção de recursos aberto | Selecione o recurso que abre uma nova caixa de diálogo. Ver Figura 5A para obter detalhes.
  6. Adicione pelo menos dois rótulos usando o botão Adicionar etiqueta sob o applet de treinamento.
    Nota: Cada rótulo irá corresponder a um tipo de objeto que precisa ser separado. Neste trabalho, três rótulos são usados para elastina: elastina em si, pontos brilhantes (a ser excluído) e plano de fundo (a ser excluído).
  7. Desenhe etiquetas no topo da pilha de imagem raw usando o pincel estilizado ferramenta de anotação.
    1. Selecione o rótulo adequado: clique a ferramenta pincel e começar a desenhar.
  8. Solicitar Ilastik para analisar a pilha de imagem e procure características semelhantes clicando em Habilitar o Live Update.
  9. Verifique cuidadosamente o mapa de previsão (Figura 5).
    Nota: O processo de imagem raw para um mapa de previsão completa é mostrado na Figura 5. Ilastik usa o mapa de previsão para a imagem do segmento de pilha de acordo com qual rótulo um pixel é mais provável que seja associada (Figura 5).
  10. Aplica um limite.
    1. Selecione miniaplicativo limiarização, escolher um método apropriado, entrada de rótulo, liso, limiar e tamanho parâmetros de filtro e finalmente, clique em aplicar.
      Nota: Este separa as peças com designação semelhante da imagem em objetos discretos. Tecido altamente conectado, como a elastina e colágeno não precisa ser segregadas, portanto, um limite de 0,4 é aplicado (o padrão é 0,5). Figura 5E e 5F ilustram o resultado da aplicação de um limite.
  11. Repita a formação de Ilastik até que o resultado é satisfatório (apenas elastina, respectivamente de colágeno é reconhecida para as respectivas análises).
    1. Frequentemente alterne entre a formação e segmentação (e às vezes também o Thresholding) miniaplicativos durante este processo. Um exemplo do efeito da re-formação Ilastik é mostrado na Figura 6.
  12. Lote de analisar dados de imagem semelhantes: selecione seleção de entrada de previsão em lotes e adicionar arquivos relevantes.
    Nota: O Ilastik de saída é uma coleção de pilhas de imagem 3D de pseudo - 1 bit (máscaras de imagem) com 0 (zero) que indicam a ausência de elastina (ou colágeno) e 1 (um) que indicam a presença deste contrato (a profundidade de bits real é 8-bit).
  13. Verificar os resultados para cada pilha de imagem comparando visualmente as máscaras de imagem e os arquivos de imagem raw.
  14. Otimizar a máscara Ilastik (etapas 8.4-8,9) e re-analisar quaisquer pilhas de imagem com resultados insatisfatórios.
  15. Calcular as densidades de volume de elastina e colágeno da Ilastik máscaras de imagem usando MATLAB
    1. Abrir o MATLAB.
    2. Seleccione a pasta com máscaras de imagem ilastik em MATLAB "pasta atual" janela.
    3. Copie o script MATLAB complementar 1 arquivo para o editor do MATLAB e salve o código como volumeCalculator.m na pasta MATLAB no disco rígido do computador.
    4. Digite o tamanho do pixel e altura pixel nas linhas de script
      pixelSize = 0.1230000 * 0.1230000; micron % * mícron
      pixelHeight = 0,9; micron %
    5. Salve o script.
    6. Vá para a janela de comando do MATLAB e digitar "volumeCalculator (' caminho-de-dados ')" para carregar o script.
    7. Clique em entrar. Cada máscara de imagem agora é resumida e multiplicada pelo volume (conhecido) pixel/voxel (dimensões físicas de um pixel multiplicado pela resolução do eixo z). A saída do MATLAB é o volume total de elastina e colágeno em cada pilha de imagem.
  16. Salve os resultados.

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Resultados

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O myograph de pressão custom-built para a imagem latente usado neste trabalho é mostrado na Figura 1. Especial atenção para a concepção do myograph foi pago para i) a câmara com um pequeno volume (2ml) e ii) a possibilidade de posicionamento as cânulas perto de e em paralelo com o fundo de vidro (figura 1B). O fundo da câmara se encaixa um 50 × 24 mm #1.5 vidro lamela (substituíveis). O controlador de pressão foi construído a par...

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Discussão

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Este trabalho representa a nossa sugestão para uma padronizada combinada imaging e pressão miografia abordagem, valiosa para a avaliação simultânea das propriedades mecânicas de resistência das artérias e alterações relacionadas à pressão na estrutura da arterial parede ao longo de uma faixa de pressão de 0 a 100 mmHg. A abordagem apresentada foi desenvolvida utilizando equipamento construído personalizado, no entanto, pode ser usado qualquer myograph de pressão que caiba em um microscópio de fluorescência de excitação d...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Os autores agradecer o dinamarquês Molecular Biomedical Imaging Center da faculdade de ciências naturais, Universidade do Sul da Dinamarca, o uso de laboratórios e microscópios. Kristoffer Rosenstand e Ulla Melchior são reconhecidos pela excelente assistência técnica, com a pressão miografia e da imagem latente.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ferramentas de Ciência Fina15401-12
Ferramentas de Ciência Fina11251-23
NikonSMZ800N
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dinamarca.761028para fins
Vitrex Medical A/S, Herlev, Dinamarca1.63, 2.13, 210mm
Smiths medical Intl, Reino Unido
EthiconEthilon 11-0
Número de patente DK personalizado 201200167, Universidade do Sul da Dinamarca, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dinamarca.B3259
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dinamarca.A7030
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dinamarca.C5670
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dinamarca.G7021
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dinamarca.E3889
Merck Millipore, Hellerup, Dinamarca1.00496.9010Tamponamento fosfato (pH 6.9) Solução de formaldeído a 4% 
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dinamarca.H3784
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dinamarca.P9666
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dinamarca.P5655
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dinamarca.M2643
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dinamarca.S2002
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dinamarca.S5886
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dinamarca.S5761
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dinamarca.1.06462
Gibco, ThermoFisher Scientific10010015
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dinamarca.PHR1423
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dinamarca.Z370525
  Tocris Bioscience, Bristol, Reino Unido538944
NikonCustom built
Spectra Physics, Mountain View, CA
NikonCFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27
NikonCFI Plan Fluor 20XMI (multi-imersão) NA 0.75
Hamamatsu, Ballerup, DinamarcaH7422P-40
A AHF analysentechnik AG (Tü bingen, Alemanha).ChromaET 460 nm dichroic
AHF analysentechnik AG (Tü bingen, Alemanha).Semrock FF01-520/35-25 Filtro
AHF analysentechnik AG (Tü bingen, Alemanha).Chroma ET402/15X 
Scotch TM
deve corresponder à objetiva usada no microscópio (# 1 ou # 1,5), alternativamente, defina o colar de ajuste para combinar com a lamínula
de dissecaçãoMettler toledo BrightLine A espessura da lamínula

Referências

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