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Artigo de método

Immunophenotyping de ortotópico Homograft (Syngeneic) de murino KPC primário de Adenocarcinoma Ductal do pâncreas por citometria de fluxo

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DOI:

10.3791/57460

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9 de outubro de 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Crown Bioscience Inc., 2State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, Peking University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

O procedimento experimental sobre o immunophenotyping de stent de murino ortotópico PDAC visa perfilação a imuno-microambiente do tumor. Os tumores são orthotopically implantado através de cirurgia. Tumores de 200-600 mm3 no tamanho foram colhidos e dissociados para preparar suspensões de célula única, seguidas de análise multi imune marcador FACS usando diferentes anticorpos fluorescente-etiquetadas.

Resumo

Homograft (syngeneic) tumores são o carro-chefe de pesquisa pré-clínica do hoje imuno-Oncologia (i/o). O microambiente do tumor (TME), particularmente seus componentes-imunológico, é vital para o prognóstico e previsão de resultados dos tratamentos, especialmente aqueles de imunoterapia. TME imune-componentes são compostos de diferentes subconjuntos de tumor infiltrando as células imunes avaliável por multi cor FACS. Adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) está entre os mais mortíferos malignances falta de opções de tratamento bom, assim, uma necessidade urgente e insatisfeita médica. Uma razão importante para a sua não-capacidade de resposta às diversas terapias (quimioterapia-, alvo, I/O) tem sido seu TME abundante, composta por fibroblastos e leucócitos que protegem as células do tumor destas terapias. Orthotopically implantado PDAC acredita-se que mais precisão recapturar o TME de cânceres pancreáticos humanos do que os modelos convencionais de subcutânea (SC).

Tumores homograft (KPC) são transplantes de rato espontânea PDAC originários de KPC-ratos geneticamente modificados (K-rasG12D / +/P53- / -/Pdx1-Cre) (KPC-GEMM). O tecido do tumor primário é cortado em pequenos fragmentos (~ 2 mm3) e transplantado por via subcutânea (SC) para os destinatários syngeneic (C57BL/6, 7-9 semanas de idade). O stent foram então cirurgicamente orthotopically transplantado para o pâncreas de novos camundongos C57BL/6, juntamente com SC-implantação, que atingiram volumes de tumor de 300 – 1.000 mm3 por 17 dias. Somente os tumores de 400 – 600 mm3 foram colhidos por procedimento aprovado autópsia e limpo para remover os tecidos de tumor não adjacentes. Eles foram dissociados por protocolo usando um dissociador tecido em suspensões de célula única, seguidas por coloração com painéis designados de fluorescente etiquetado anticorpos para os vários marcadores de diferentes células do sistema imunológico (linfoide, mieloide e NK, DCs). As amostras coradas foram analisadas usando FACS multi cor para determinar o número de células do sistema imunológico de linhagens diferentes, bem como a sua percentagem relativa dentro de tumores. Os perfis imunes de ortotópico tumores foram então comparados dos tumores do SC. Os dados preliminares demonstraram TILs/TAMs infiltrante significativamente elevados em tumores sobre o pâncreas e infiltração de células B maior ortotópico em vez de tumores do SC.

Introdução

Adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) faz com que quase a metade um milhão mortalidade mundial anualmente, um dos top 5 câncer assassinos. Há poucas opções de tratamento eficazes e imunoterapias não aprovadas; Portanto, novos tratamentos são desesperadamente necessários. Cancros são cada vez mais sendo reconhecidos como doenças imunológicas, incluindo PDAC, além das doenças genéticas, como conhecido hoje. Fatores imunológicos e genéticos provavelmente iria determinar o prognóstico da doença, bem como tratamento os resultados. Tumores de iludir a vigilância imune hospedeiro e eventualmente avançam para causar a morte. Muitos destes processos imunes ocorrerem dentro o microambiente do tumor (TME)1,2,3,4 onde diferentes tipos de células do sistema imunológico interagem com células tumorais, com o outro e com outro tumor componentes do estroma, diretamente ou indiretamente através de citocinas que, finalmente, determinar o resultado de doença. Portanto, a caracterização dos componentes imunes tumor da TME ou tumor immunophenotyping, incluindo subtipos, numeração e localização de diferentes linhagens de células do sistema imunológico, é fundamental para compreensão imunidade anti-tumoral. No caso do PDAC, foi proposto que elevou o tumor infiltrando supressivos macrófagos (TAM) e células B conduziram a prevenção da infiltração de células T e/ou ativação e níveis elevados de fibrose5,6.

A abordagem comum para TMEs imunes a investigar experimentalmente estaria usando modelos animais pré-clínicos de substituto tumor, tumor de rato principalmente relevante os modelos7, particularmente do mouse syngeneic (homograft) ou modelos de rato geneticamente modificados (GEMM) de câncer, na similaridade assumida de rato e humanos para tumores e imunidade8,9. Entende-se na realidade que existem diferenças inerentes entre as duas espécies de10,11.

Transplantado rato tumores têm vantagens operacionais significativas sobre tumores espontânea7, ou seja desenvolvimento de tumor sincronizado, em contraste com o desenvolvimento de tumor espontânea GEMM parental. Stent de tumores murino espontâneas é considerados tumores primários nunca tendo sido manipularam in vitroe espelhamento original rato tumor histo - molecular patologia7, bem como possíveis perfis imunes. Estes murino stent é muitas vezes consideradas ser "uma versão do mouse do paciente-derivado xenografts (PDXs)". Portanto eles provavelmente têm um melhor Traduzibilidade próprios que cela syngeneic convencional linha-derivado do mouse tumores12. Em particular, muitos stent é derivadas do GEMM específico onde mecanismos de doenças humanas específicas, por exemplo, as mutações de motorista oncogênica, são projetados, e estes stent, portanto, deve ter vantagens para sua relevância clínica. Em particular, a KPC GEMM desenvolver rato PDAC dentro de 15-20 semanas de idade, que recapitula morfologicamente a doença humana com predominantemente bem a moderadamente-diferenciadas de arquitetura glandular e altamente enriquecido o estroma. Este modelo também recapitula as características genéticas mais comuns de PDAC humana, nomeadamente Kras ativando mutação e perda-de-função P53, que ocorrem em 90% e 75% do PDAC humana, respectivamente de5,6.

Sites de transplante também sugeridos que desempenham um papel na Traduzibilidade próprios do modelo. Específicos do ambiente circundante de tecido, como um ambiente ortotópico correspondente, poderia ser um nicho para tumores específicos para ambientes de progresso, em oposição a uniforme subcutânea (SC) para tumores comumente transplantados. Seria de particular interesse se, e/ou, que diferença existe entre os dois locais de transplante, em termos de microambiente imunológico e a relevância para câncer humano, por exemplo. no caso do PDAC.

Um dos aspectos mais importantes da criação de perfil imune, ou immunophenotyping, é determinar o tumor infiltrando as células imunes de linhagens diferentes, os números, percentual relativo dentro tumores, bem como seus Estados de ativação e locais. Isso inclui o tumor-infiltratrating lymphoctyes (TILs, ambos T - e B-), tumor infiltrando macrófagos (TAMs), tumor infiltrando células assassinas naturais (NKs) e residente em tumor dendrítica células3,13,14 , 15 , 16 , 17e a Localização subcellular de certas células18,19,20, etc. Fluorescência citometria de fluxo ou classificação de celular ativado (FACS) é uma tecnologia de deteção de célula única que é comumente usada para medir os parâmetros específicos de uma célula. Multi cor medidas de citometria de fluxo vários marcadores em uma única célula3,4,21 e é o método mais comumente utilizado para determinar o número e a percentagem relativa de diferentes subconjuntos de células do sistema imunológico, incluindo aqueles dentro de tumores.

Este relatório descreve procedimentos para perfilação tumor infiltrando células do sistema imunológico: 1) implantação de ortotópico PDAC rato tumor stent, juntamente com a implantação de SC; 2) tumor tecido colheita e preparação única célula através de dissociação de tumor; 3) análise de citometria de fluxo de todas as células derivadas de tumores, como uma linha de base; 4) comparação dos perfis de linha de base de ambas as abordagens de transplante.

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Protocolo

Todos os protocolos e aditamentos ou procedimentos que envolvem o cuidado e a utilização de animais serão revistos e aprovados pela coroa Bioscience institucional Animal Care e Use Comité (IACUC) antes da realização de estudos. O cuidado e a utilização de animais serão normalmente conduzidas em conformidade com as diretrizes internacionais AAALAC (Associação para a avaliação e acreditação of Laboratory Animal Care) conforme relatado no guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório, pesquisa nacional Conselho (2011). Todos os procedimentos experimentais animais estarão sob condições estéreis, nas instalações da SPF (específico isentos de organismos patogénicos) e conduzido em estrita conformidade com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório, de instituições de governo diferentes (por exemplo Os institutos nacionais de saúde). O protocolo terá de ser aprovado pelo Comité de ética de Animal experiências na instituição de instalação (por exemplo, Comissão dos assuntos institucionais IACUC).

1. preparação para o transplante de Tumor

  1. Alojamento dos animais
    1. Obter genéricos camundongos C57BL/6 de um fornecedor de reprodução comercial.
    2. Ratos de casa (5) em gaiolas ventiladas individuais nas seguintes condições: temperatura: 20-26 ° C; 30 – 70% de umidade; ciclo de iluminação: luz 12 h e 12 h de escuro.
    3. Uso milho espiga de cama é mudada semanalmente.
    4. Para dieta, fornece irradiação esterilizada grânulo seco comida durante o período de estudo inteiro.
    5. Para a água, fornece animais livre acesso à água potável estéril.
  2. Preparação de fragmento de tumor de doador
    1. Começar pelo monitoramento do peso corporal (PC), através de pesagem usando um contrapeso e tumor volume (TV), pela medição da maxila, dos ratos de tumor-rolamento doador.
    2. Quando TV atinge 500 – 1.200 mm3, abater o animal em uma capa de risco biológico conforme protocolo.
    3. Esterilize a pele ao redor do tumor, usando cotonetes Iodofor.
    4. Remover cirurgicamente o tumor (detalhes descritos na secção 3: colheita de necropsia e tumor) e coloque o tumor em uma placa de Petri contendo 20 mL de PBS (pre-chill a mídia ou o buffer de 4 ° C antes da eutanásia de animais).
    5. Se houver sangue contaminante, transferir o tumor em outra placa de Petri e lavar o tumor com PBS.
    6. Cortado ao meio, removendo qualquer excesso de pele, vasos, calcificação e/ou necrose, o tumor.
    7. Escolha apenas intactas partes do tumor e colocá-los em um tubo de centrífuga estéril 50 mL e adicionar 20 mL de PBS então transportar o tubo para uma sala separada de animais para estudos de farmacologia.

2. ortotópico e enxertia subcutânea (SC)

  1. Inoculação de SC
    1. Corte de tumores em 2 mm peças de diâmetro utilizando um bisturi, colocar 1 pedaço cada trocarte, para implantação de SC ou para posterior implantação ortotópico (veja abaixo).
    2. Anestesia o animal destinatário com 5% de isoflurano, que é mantido por um cone de nariz em 1%. O animal vai começar a relaxar, perder seu braço endireitante reflex e eventualmente tornar-se imóvel. A esta profundidade da anestesia pode facilmente ser despertados por estímulos dolorosos; permitir que a anestesia aprofundar até tais respostas à dor estão ausentes.
    3. Uma vez anestesiado, consertar os ratos em uma placa de experiência em posição lateral direita. Esterilize o mouse usando cotonetes Iodofor, particularmente as áreas circundantes dos tumores.
    4. Com um bisturi, faça uma incisão de pele de 0,5 a 1,0 cm no flanco esquerdo, só craniano até à anca.
    5. Túnel sob a pele no sentido do membro anterior, dois ou três centímetros, com fórceps rombudo.
    6. Assepticamente, transferir um cubo de tumor do meio e coloque no fundo do túnel subcutâneo.
    7. Visualmente, confirme que o tumor é no fundo do túnel (e não da incisão na pele).
    8. Feche a ferida com clipes de ferida.
    9. Monitore a animais post inoculação até recobra a consciência suficiente para manter o decúbito esternal. Animais de retorno de volta para sua gaiola somente após sua completa recuperação da anestesia. Completar o Log de anestesia e iniciar o gráfico de Saúde Animal. Pesar o destinatários animais diariamente por três dias
    10. Para um procedimento padrão, inocule os ratos de 5-10 por grupo para monitoramento de crescimento do tumor.
  2. Implantação ortotópico pancreático
    1. Anestesia e Analgesia
      1. Usar uma injeção de 2 mL cetamina e injeção de xilazina 0,42 mL (20 mg/mL) misturado com 5.91 água de injeção estéril ou solução salina em um volume de dose de 0,06 – 0.1 mL/20-25 g de massa corporal.
        Nota: De acordo com o bem-estar dos animal, analgesia é necessária ambos pré e pós operação. 0,05-0,1 mg /kg de buprenorfina, SC. A primeira dose é pré operação e depois uma dose 3 vezes cada operação de post 4 horas continuamente.
    2. Operação cirúrgica para implantação ortotópico
      1. ANESTHETIZE ratos através de injeção intramuscular (IM) por passo 2.2.1.
      2. Depois que os animais são totalmente anestesiados, consertar os ratos em uma placa de experiência em posição lateral direita.
      3. Manter os ratos na posição lateral direita. Desinfecte a pele ao redor do baço com iodo depois de-iodinate com 75% de álcool etílico.
      4. Encontrar o ponto médio do baço e fazer uma incisão vertical de 1 cm no abdômen para expor o baço.
      5. Tirar uma parte do tecido do pâncreas sob o baço delicadamente com uma pinça de ponta plana e um pedaço de tumor homograft do mouse do mouse semente no pâncreas de rato destinatário de sutura por sutura cirúrgica de 9-0.
      6. Feche o abdômen com uma sutura de seda 6-0 a costura dupla. Alcançar a homeostase por compressão.
      7. Após o implante de tumor acabamento, se ocorrer sangramento nem tumor vazamento de tecido, manter os animais em uma gaiola quente.
      8. Monitorar o animal até que recupere a consciência suficiente para manter a prostração esternal; devolver o animal para a sala de animais após a completa recuperação da anestesia. Monitorar o tumor rolamento ratos por palpação do abdômen, perto do baço e selecionar para fora os ratos com tumores ortotópico.
  3. Tumor-rolamento ratos saúde monitoramento
    1. Verifica o consumo de água e comida diariamente.
    2. Examine a aparência do mouse para uma pelagem ungroomed, pedaços, magreza, respiração anormal ou ascite.
    3. Palpe o abdómen para verificar se existem espontâneas tumores no fígado ou baço.
    4. Ratos, semanalmente, utilizando uma balança de pesar.
    5. Se qualquer um dos seguintes sinais clínicos são observados, os ratos são sacrificados para coleta de amostra e necropsia: perda de BW > 20%; prejudicada mobilidade (não é capaz de comer ou beber); incapaz de se mover normalmente devido à ascite significativa e alargada do abdome; esforço na respiração.

3. necrópsia e colheita de Tumor

  1. Inspecione visualmente e por palpação para a presença de tumores palpáveis antes do término.
  2. Rescisão, primeiro eutanásia em ratos conforme protocolo aprovado e abrir o abdômen e examinar visualmente o pâncreas para tumores.
  3. Corte o tumor por cirurgia mortal post e adicioná-lo ao frio PBS. Coloque todos os animais em uma câmara de eutanásia limpo, sem acusações, translúcido com tampa especial com uma porta para a entrega do dióxido de carbono a ser usado.
  4. Descarga de gás para a câmara a uma taxa de fluxo que produz inconsciência rápida com mínimo desconforto para o animal. A taxa de fluxo ideal para CO2 deve ser cerca de 2-2,5 L/min.
  5. Observe visualmente cada animal durante o procedimento de eutanásia para garantir a todos os animais recebem as concentrações de gases adequada e não recuperar a consciência durante o procedimento de euthanize.
  6. Manter o fluxo de gás pelo menos 1 min após a aparente morte clínica para minimizar a possibilidade de que um animal pode se recuperar (se apneicos mas não morto).
  7. Remova tecidos adjacentes não-tumoral. Tumor limpo pode ser fotografada rapidamente.
    Coloque os tecidos de tumor em RPMI-1640 e manter no gelo antes de dissociação.
    Nota: Carcaças de animais são ensacadas e armazenadas no congelador apropriado aguardar a remoção.

4. tumor tecido dissociação e única célula preparação

  1. Preparação do reagente
    Nota: O Kit de dissociação de Tumor contém 2 frascos de enzima D (pó liofilizado), 1 frasco de enzima R (pó liofilizado), 1 frasco de enzima A (pó liofilizado) e 1 mL de tampão A.
    1. Prepare-se D enzima reconstituir o pó liofilizado em cada frasco com 3 mL de RPMI-1640. Prepare alíquotas de um volume adequado para evitar o congelamento-descongelamento-ciclos repetidos.
    2. Prepare a enzima R, reconstituir o pó liofilizado no frasco com 2,7 mL de RPMI 1640. Prepare alíquotas de um volume adequado para evitar o congelamento-descongelamento-ciclos repetidos.
    3. Prepare-se enzima A reconstituir o pó liofilizado no frasco com 1 mL de tampão A fornecidos com o kit. Fazer não o vórtice. Prepare alíquotas de um volume adequado para evitar grátis-degelo-ciclos repetidos.
    4. Prepare a mistura de enzima adicionando 2,35 mL de RPMI-1640, 100 µ l de enzima D, 50 µ l de enzima R e 12,5 µ l da enzima A em cada gentleMACS C-tubo.
  2. Dissociação do tumor
    1. Para cada tumor preparar um tubo C com mistura de digestão do tumor, por favor consulte a secção 4.1 para a preparação e diluição de tampão de digestão.
    2. Uso 3 mL digestão de tampão para fragmentos de tumor < 0,8 g e garantir que o tumor é totalmente digerido.
    3. Etiqueta com o código de estudo, tumor, rato ID, grupo de tratamento e peso do tumor.
    4. Recolher o tumor do mouse, lave o tumor em PBS fria e limpa o tecido anexado do tumor (tais como os vasos sanguíneos, gordura, fáscia, etc.).
    5. Colocar o tumor em mídia de digestão em um poço de um prato bem 6 estéril.
    6. Segure o tumor no lugar com uma pinça/Pinças esterilizadas e corte com um bisturi. Fatie o tumor bem o suficiente para quebrar em pedaços menores (~ 1 mm3).
    7. Coloque os pedaços de tumor volta no tubo de C... e usar o buffer de digestão restantes para lavar a placa e depois transferir o líquido para o C-tubo que é colocado no gelo até a digestão.
    8. Ligue o dissociador com aquecedores.
    9. Coloque a dissociação de tumor C-tubos de cabeça para baixo em mangas das posições vagas e ajustar o status de posições do tubo de Free para selecionado. Escolha um programa de dissociação (37_c_m_TDK_1), seguido pela seleção da pasta necessária, onde a lista de programas é exibida.
    10. Após o término do programa, tire C-tubos a dissociador e spin brevemente (300 x g, 4 ° C) para a amostra de Pelotas.
    11. Re-suspender as amostras e coloque em um coador de célula acima de um tubo de 50 mL. Lave as células através do filtro de celular com 10 mL de tampão de lavagem para fornecer uma suspensão de célula única.
    12. Centrifugar os tubos a 300 x g por 5 min, desprezar o sobrenadante e ressuspender as células com 5 mL de tampão de lavagem, contagem de células viáveis usando trypan azul e/ou pelo contador de célula e ajustar a célula concentraton a 1 x 106 células por tubo ou por amostra. Incluem os anticorpos de controle isotipo correta para garantir a coloração é específica

5. projeto do painel imune e aquisição de dados de fluxo

  1. Projeto do painel
    1. Por favor, consulte a tabela 1.
  2. Immunostaining
    1. Células de amostra FC-bloco: re-suspender as células em 200 µ l de buffer com 1 µ g/mL Fc-bloco, seguido de incubação sobre refrigeração de gelo ou a 4 ° C por 15 min no escuro a coloração.
    2. Mancha de células usando os painéis de anticorpos/fluorescência desejado (por exemplo. T-Cell painel, painel do macrófago, etc.): Adicione a mistura de anticorpo diluída em tampão de bloqueio de Fc para cada amostra, a mancha pelo menos 30 min no gelo no escuro.
    3. Adicionar 1 mL de PBS frio gelo a cada tubo e ressuspender as células suavemente, seguido por centrifugação a 300 x g durante 5 min. descartar o sobrenadante resultante.
      1. Repita o procedimento para lavar as células duas vezes.
    4. Mancha para marcadores intracelulares, se necessário, seguintes passos 6-10, caso contrário pule para o passo 10.
    5. Ressuspender o centrifugado pelo vórtice do pulso e adicionar 200 µ l de solução de trabalho de fixação/permeabilização preparada para cada amostra. Vórtice de pulso novamente e então incubar a 4 ° C durante a noite (preferencial) ou 30 min à temperatura ambiente no escuro.
    6. Gire para baixo as células e remover o sobrenadante.
    7. Lave duas vezes pela adição de 1 mL de tampão de permeabilização (feita a partir de 10x Buffer de permeabilização, diluída com água destilada H2O) 1x seguido de centrifugação e decantação do sobrenadante.
    8. Adicione o anticorpo marcador intracelular em tampão de permeabilização 1x e incubar a temperatura ambiente por 30 min no escuro.
    9. Lave as células duas vezes com 1 mL de tampão de permeabilização 1x. Centrifugar e decantar o líquido sobrenadante.
    10. Ressuspender as células em 150 µ l de tampão de coloração e analisar em um citômetro. Devido ao processo de fixação e permeabilização, o FSC (dispersão de luz para a frente) / distribuição de SSC (dispersão sidelight) da população celular será diferente de células vivas. Portanto, o portão e tensões precisará ser modificado.
  3. Controles FMO (fluorescência menos um controle)
    Nota: Análise de fluxo de multi-color é particularmente importante para a análise das células do sistema imunológico tumor infiltrando. Portanto, há uma necessidade de encontrar uma maneira de identificar e células no contexto de dados se espalhou devido as várias fluorochromes em um determinado painel da porta. Controle FMO (menos uma fluorescência) é uma abordagem importante para essa finalidade.
    1. Para este fim, incluem mouses adicionais em cada grupo para controles FMO (pelo menos 2 por Rx) e processo individual para cada tecido. Após a dissociação, tecidos de piscina. Por exemplo, em um estudo com 4 grupos de Rx, 8 tumores adicionais devem ser processados individualmente e então agrupados em uma amostra para FMO.
  4. Configuração de instrumento de fluxo
    1. Fazer contas de compensação, enquanto a máquina está a aquecer (pelo menos 20 min).
    2. Use grânulos do CS & T para verificar o desempenho.
    3. Configurações de tensão e compensação: usar grânulos UltraComp, vórtice o Comp grânulos cuidadosamente antes de usar.
    4. Rotule um tubo de amostra2 12 x 75mm separado para cada anticorpo conjugado fluorocromo.
    5. Adicione 100 µ l de buffer para cada tubo de coloração. Adicione 1 gota cheia (cerca de 60 µ l) dos grânulos para cada tubo.
    6. Acrescente os anticorpos e realizar o procedimento de coloração exatamente como o processo de amostra afirmado na seção 4.
    7. Adicione 0,5 mL de tampão cada, completamente re-suspender pelotas grânulo através do vórtice de coloração.
    8. Definir a tensão de PGTO de citômetro de fluxo por tecido-alvo para a determinada experiência.
    9. Execute através do citômetro de fluxo para aquisição de dados, por retenção na população de grânulo singlete por leituras de FSC e SSC.
    10. Definir taxa de fluxo em torno de 200 – 300 eventos/s.
    11. Definir a compensação adequada para uma determinado fluoresceína [FITC]-anticorpo conjugado, uso um FL1 vs FL2 ponto enredo.
    12. Coloque um portão do quadrante grânulos negativos estão no quadrante inferior esquerdo e os grânulos positivos estão na parte superior ou inferior direito quadrante. Ajuste os valores de compensação até a intensidade de fluorescência mediana (IFM) de cada população (como mostrado na janela de estatísticas do quadrante) é aproximadamente igual (ou seja, para FL2-% FL1, FL2 IFM de ambas as contas devem ser semelhante).
    13. Repita as etapas 5.4.11 e 5.4.12 para todos os tubos.
    14. Proceda para adquirir o real manchada de amostras. Execute o assistente de compensação e salvar as configurações com o formato "data experimentar suas iniciais".

6. fluxo de dados análise e apresentação

  1. Analise dados por Flowjo e/ou Kaluza.

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Resultados

Ortotópico implantação do PDAC resultou no crescimento do tumor rápida semelhante à observada para implantação de SC. Depois que os fragmentos de tumor de doadores foram implantados em ratos destinatários, tanto por via subcutânea e orthotopically de acordo com os protocolos descrito nos passos 2.1 e 2.2, os tumores de homograft KPC implantados demonstraram semelhante rápido crescimento, como mostrado em figura 1A . Tumores de homograft KPC colhidas nos ponto...

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Discussão

Embora estudos utilizando tumores de SC são mais facilmente conduzidos, modelos de tumores orthotopically implantado podem potencialmente ter mais relevantes para os estudos de farmacologia pré-clínica (particularmente as investigações I/O) fornecer Traduzibilidade próprios reforçado. Este relatório visa ajudar o leitores/público interessado para ser capaz de Visualizar diretamente os procedimentos técnicos que podem ser usados em suas respectivas pesquisas. Nossos protocolos de demonstram essa ortotópico implantação do ...

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Divulgações

Todos os autores são empregados em tempo integral da coroa Bioscience, Inc.

Agradecimentos

Os autores gostaria de agradecer o Dr. Jody Barbeau - leitura crítica e edição do manuscrito e graças a Ralph Manuel para a concepção de obras de arte. Os autores também gostaria de agradecer a equipe de coroa Bioscience biomarcador de imuno-Oncologia Oncologia e a equipe de Oncologia In Vivo , por seus grandes esforços técnicos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Máquina de anestesia\SAS3119\
Trocarte 20\\2 mm
Placa de Petri\\20 mm
100x antibiótico\\\
Cotonetes de iodóforo\\Compra diária de farmácia
Cotonetes de álcool\\Compra
diária de farmáciaNitrogênio líquidoAr químico\\
Capa de biossegurançaAIRTECHBSC-1300IIA2\
FACS máquina LSRFortessa X-20BDLSR Fortessa\
anticorposBD\\
Trevigen MD ou BD Matriz de membrana basal Alta concentraçãoBD354248\
FACS buffersBD554656
553142563794Filtros
BD-Falcon35235070 µ m
tubo de sangue de rotinaBD-Vacutainer3659742 mL
KaluzaBeckmanvs 1.5
placas de 6 poçosCorning3516\
Foxp3 Fix / Perm kitebioscience00-5523-00\
UltraComp eBeadsebioscience01-2222-42\
Centrifugeeppendorf5810R,5920R\
Software FlowJoFlowJo LLC\vs 10.0
PBSHycloneSH30256.0150 mL
RPMI 1640HycloneSH30809.01\
Bisturis descartáveis e estéreisJin zhongJ1210011 #
cabo de facaJin zhongJ11010\
tesouras e pinças para os olhosJin zhongY00030Tesoura para os olhos 10 cm
tesouras e pinças para os olhosJin zhongJD1060Pinças para os olhos 10 cm com dentes
Tanque portátil de nitrogênio líquidoJinfengYDS-175-216\
Balança eletrônicaMetter ToledoAL2040-100 g
Miltenyi C-tubesMiltenyi130-096-334\
Miltenyi Gentle MACS com blocos aquecedoresMiltenyi120-018-306\
Kit de Dissociação de TumorMiltenyi130-096-730\
Contador de célulasNexcelomCellometerCellometer Auto T4
tubo de criopreservaçãoNunc3754181,8 mL
Cultrex Alta Concentração de Proteína (HC20+) BMEPathClear3442-005-01\
seringasShanghai MIWA indústria médica\1-5 mL
Studylog softwareStudylog\software
Studylog-Balance e suporte USBOHAUSSE601FBalance e suporte USB
Studylog-Data linha de paquímetros vernierSylvac926.6721Linha de dados de paquímetros vernier
CaliperSylvac910.1502.10Sylvac S-Cal pro
Tubos de centrífuga esterilizadosThermo33965350 mL
Tubos de centrífuga esterilizadosThermo33965115 mL
Balde de geloThermoKLCS-2884 ° C
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Referências

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