Neste artigo, discutimos três cérebro as preparações para a gravação de grampo celular patch para estudar o circuito retinotectal de girinos de Xenopus laevis . Cada preparação, com suas próprias vantagens específicas, contribui para a rastreabilidade experimental da larva Xenopus como um modelo para estudar a função do circuito neural.
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Artigo de método
Preparações e protocolos para toda célula Patch Clamp gravação de neurônios Tectal Xenopus laevis
Neste artigo
Resumo
Resumo
O circuito de retinotectal de girino Xenopus , composto de células ganglionares da retina (RGCs) no olho que formam sinapses diretamente sobre os neurônios no tectum óptica, é um modelo popular para estudar circuitos neurais como auto-montagem. A capacidade de realizar toda a célula gravações de braçadeira do remendo de neurônios tectal e a gravar respostas RGC-evocada, ou na vivo ou utilizando uma preparação de todo o cérebro, tem gerado uma grande massa de dados de alta resolução sobre os mecanismos subjacentes normal e formação de circuito anormal e a função. Aqui descrevemos como executar a in vivo preparação, a preparação original de todo o cérebro, e mais recentemente desenvolveram a preparação de fatia horizontal do cérebro para a obtenção de gravações de grampo celular remendo de neurônios tectal. Cada preparação tem vantagens exclusivas experimentais. A preparação na vivo permite a gravação da resposta direta dos neurônios tectal a estímulos visuais projetadas sobre o olho. A preparação de todo o cérebro permite que os axônios RGC ser ativado em uma forma altamente controlada, e a preparação de fatia do cérebro horizontal permite a gravação de em todas as camadas do tectum.
Introdução
O circuito de retinotectal é o principal componente do sistema visual de anfíbios. É composto pelos RGCs nos olhos, que se projetam seus axônios para o tectum óptica onde formam conexões sinápticas com neurônios tectal pós-sináptica. O circuito de retinotectal de girino Xenopus é um modelo de desenvolvimento popular para estudar a função e formação de circuitos neurais. Existem muitos atributos do circuito de retinotectal dos girinos que a tornam um poderoso modelo experimental1,2,3. Um atributo importante e o foco deste artigo, é a capacidade de realizar gravações d....
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Protocolo
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Wyoming e institucional Cuidado Animal. Todos os procedimentos, incluindo gravações eletrofisiológicas, são realizados à temperatura ambiente, cerca de 23 ° C. Todos os métodos descritos aqui são otimizados para gravação tectal neurônios de girinos entre estágio desenvolvente 42 e 49 (encenado de acordo com Neiuwkoop e Faber15).
1. preparação na Vivo
- Anestesia o girino.
- Coloque o girino em um pequeno prato de Petri contendo solução de Steinberg com 0.01% MS-222 por aproximadamente 5 min.
Nota: M....
- Coloque o girino em um pequeno prato de Petri contendo solução de Steinberg com 0.01% MS-222 por aproximadamente 5 min.
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Resultados
Para gravar as respostas evocadas de luz um flash de todo campo de luz é projetado na retina enquanto a resposta resultante é gravada a partir de neurônios tectal individuais(Figura 4). Este protocolo particular é projetado para medir tanto a resposta do neurônio à luz activar ("no" resposta) e em seguida desligar 15 s mais tarde para medir a "resposta fora." Tectal neurônios normalmente exibem robusto e desativar respostas (modo de braçadeir.......
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Discussão
Todos os métodos descritos neste trabalho são otimizados para gravação tectal neurônios de girinos entre estágio desenvolvente 42 e 49 (encenado de acordo com Neiuwkoop e Faber15). Pela fase 42, os girinos são suficientemente grande e suficientemente desenvolvidos para que os pinos de insetos podem ser colocados em ambos os lados do cérebro para gravações na vivo e para a realização da dissecação do cérebro inteiro. Nas fases anteriores, quando os girinos são essencialmente bidimensionais.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Com a subvenção de NIH SBC COBRE 1P20GM121310-01.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Stemi Stereo 508 | Zeiss | 495009-0006-000 | Microscópio de dissecação |
| MS-222 "Tricane" | Finquel | ARF5G | Anfíbio anestésico geral |
| Cloreto de sódio (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Usado para preparar a solução de Stienberg e solução externa |
| Cloreto de potássio (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Usado para preparar a solução de Stienberg e solução externa |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-1KG | Usado para preparar a solução de Stienberg e solução externa |
| Tetra-hirato de nitrato de cálcio (Ca (NO < sub> 3 < / sub>) • 4H2O) | Sigma-Aldrich | 237124-500G | Usado para preparar a solução de Stienberg |
| Sulfato de magnésio (MgSO4) | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Usado para preparar a solução de Steinberg Cloreto de |
| cálcio (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | Usado para preparar solução de gravação externa |
| Cloreto de magnésio (MgCl2) | J.T. Baker | 2444-01 | Usado para preparar solução de gravação externa |
| químicos Mallinckrodt | anidros de D-glicose | 6066-04 | Usado para preparar solução de gravação externa |
| Cloridrato de tubocurarina pentahidratado | Sigma | T2379 | Antagonista do receptor de acetilcolina nicotínico |
| Pinos de insetos | Ferramentas de ciências finas | 26002-10 | Pinos de aço inoxidável de 0,1 mm de diâmetro |
| Kit de elastômero de silicone Sylgard 184 Dow | Corning | 761028 | Kit de monômero e agente de cura pré-pesado |
| Placa de Petri de Poliestireno Estéril - 60x15mm | Fisher Scientific | AS4052 | Pequenas placas de Petri |
| Agulha PrecisionGlide 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm) | BD | 305122 | Seringa |
| 1mL Ponta Deslizante Seringa Tuberculina | BD | 309659 | Seringas descartáveis e estéreis Vidro |
| pipeta de borossilicato | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | Puxado de acordo com as especificações desejadas usando a máquina de puxar pipetas |
| Extrator de micropipetas flamejante/marrom | Sutter Instruments | P-97 | Fabrica micropipetas para gravação de eletrofisiologia |
| Kimwipes Toalhetes | Kimtech Kimberly-Clark | 34120 | Delicado limpadores sem fiapos de tarefas |
| Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | Braçadeira de corrente e braçadeira de tensão headstage |
| MP-285 Manipulador Motorizado com Controlador de Mesa | Sutter Instrument | MP-285/T | Controle para headstage em equipamento de eletrofisiologia |
| LED acoplado a fibra (verde) | Thorlabs | M530F2 | Cabo de fibra óptica emparelhado com LED verde |
| Eletrodo Bipolar de Cluster (25µ m de diâmetro) | FHC | 30207 | Eletrodo estimulante bipolar |
| ISO-Flex Stimulator | A.M.P.I. (Israel) | Contato do fabricante | Isolador de estímulo flexível |
| Axon Instruments 700B Amplificador Multipatch | Molecular Devices | 2500-0157 | Amplificador para gravação de pinça de tensão e corrente |
| Digidata 1322A digitalizador | Molecular Devices | 2500-135 | Sistema de aquisição de dados para gravação de eletrofisiologia |
| Axio Examiner.A1 | Zeiss | 491404-0001-000 | Microscópio para eletrofisiologia |
| Mesa de Laboratório Micro-g | TMC | 63-533 | Mesa de ar para microscópio de eletrofisiologia |
| Computador de mesa pessoal Inspiron 620 com Windows 7 Computador Dell D06D001 de 64 bits | executando software de eletrofisiologia | ||
| c2400 Câmera CCD | Hamamatsu | 70826-5 | Câmera de dispositivo de carga acoplada para imagens de eletrofisiologia |
| 7 O'Clock Super Platinum Lâminas de | barbear de aço inoxidávelGillette | CMM01049 | Lâminas de barbear inoxidáveis revestidas de platina |
| Pipetas de transferência | Fisher Scientific | 13-711-7M | Pipetas de transferência de polietileno descartáveis |
Referências
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
- Pratt, K. G. Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole. Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).
- Liu....
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Reimpressões e permissões
