Preparações e protocolos para toda célula Patch Clamp gravação de neurônios Tectal Xenopus laevis

Zhenyu Liu; Katelynne B. Donnelly; Kara G. Pratt

doi:10.3791/57465

Artigo de método

Preparações e protocolos para toda célula Patch Clamp gravação de neurônios Tectal Xenopus laevis

DOI:

10.3791/57465

⸱

15 de março de 2018

Zhenyu Liu¹ , Katelynne B. Donnelly¹ , Kara G. Pratt¹

¹Department of Zoology and Physiology and Program in Neuroscience, University of Wyoming

Neste artigo

Resumo

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Neste artigo, discutimos três cérebro as preparações para a gravação de grampo celular patch para estudar o circuito retinotectal de girinos de Xenopus laevis . Cada preparação, com suas próprias vantagens específicas, contribui para a rastreabilidade experimental da larva Xenopus como um modelo para estudar a função do circuito neural.

Resumo

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O circuito de retinotectal de girino Xenopus , composto de células ganglionares da retina (RGCs) no olho que formam sinapses diretamente sobre os neurônios no tectum óptica, é um modelo popular para estudar circuitos neurais como auto-montagem. A capacidade de realizar toda a célula gravações de braçadeira do remendo de neurônios tectal e a gravar respostas RGC-evocada, ou na vivo ou utilizando uma preparação de todo o cérebro, tem gerado uma grande massa de dados de alta resolução sobre os mecanismos subjacentes normal e formação de circuito anormal e a função. Aqui descrevemos como executar a in vivo preparação, a preparação original de todo o cérebro, e mais recentemente desenvolveram a preparação de fatia horizontal do cérebro para a obtenção de gravações de grampo celular remendo de neurônios tectal. Cada preparação tem vantagens exclusivas experimentais. A preparação na vivo permite a gravação da resposta direta dos neurônios tectal a estímulos visuais projetadas sobre o olho. A preparação de todo o cérebro permite que os axônios RGC ser ativado em uma forma altamente controlada, e a preparação de fatia do cérebro horizontal permite a gravação de em todas as camadas do tectum.

Introdução

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O circuito de retinotectal é o principal componente do sistema visual de anfíbios. É composto pelos RGCs nos olhos, que se projetam seus axônios para o tectum óptica onde formam conexões sinápticas com neurônios tectal pós-sináptica. O circuito de retinotectal de girino Xenopus é um modelo de desenvolvimento popular para estudar a função e formação de circuitos neurais. Existem muitos atributos do circuito de retinotectal dos girinos que a tornam um poderoso modelo experimental¹^,²^,³. Um atributo importante e o foco deste artigo, é a capacidade de realizar gravações d....

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Protocolo

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Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Wyoming e institucional Cuidado Animal. Todos os procedimentos, incluindo gravações eletrofisiológicas, são realizados à temperatura ambiente, cerca de 23 ° C. Todos os métodos descritos aqui são otimizados para gravação tectal neurônios de girinos entre estágio desenvolvente 42 e 49 (encenado de acordo com Neiuwkoop e Faber¹⁵).

1. preparação na Vivo

Anestesia o girino.
1. Coloque o girino em um pequeno prato de Petri contendo solução de Steinberg com 0.01% MS-222 por aproximadamente 5 min.
  Nota: M....

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Resultados

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Para gravar as respostas evocadas de luz um flash de todo campo de luz é projetado na retina enquanto a resposta resultante é gravada a partir de neurônios tectal individuais(Figura 4). Este protocolo particular é projetado para medir tanto a resposta do neurônio à luz activar ("no" resposta) e em seguida desligar 15 s mais tarde para medir a "resposta fora." Tectal neurônios normalmente exibem robusto e desativar respostas (modo de braçadeir.......

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Discussão

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Todos os métodos descritos neste trabalho são otimizados para gravação tectal neurônios de girinos entre estágio desenvolvente 42 e 49 (encenado de acordo com Neiuwkoop e Faber¹⁵). Pela fase 42, os girinos são suficientemente grande e suficientemente desenvolvidos para que os pinos de insetos podem ser colocados em ambos os lados do cérebro para gravações na vivo e para a realização da dissecação do cérebro inteiro. Nas fases anteriores, quando os girinos são essencialmente bidimensionais.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Com a subvenção de NIH SBC COBRE 1P20GM121310-01.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Stemi Stereo 508	Zeiss	495009-0006-000	Microscópio de dissecação
MS-222 "Tricane"	Finquel	ARF5G	Anfíbio anestésico geral
Cloreto de sódio (NaCl)	Fisher Scientific	S271-3	Usado para preparar a solução de Stienberg e solução externa
Cloreto de potássio (KCl)	Fisher Scientific	P217-500	Usado para preparar a solução de Stienberg e solução externa
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-1KG	Usado para preparar a solução de Stienberg e solução externa
Tetra-hirato de nitrato de cálcio (Ca (NO < sub> 3 < / sub>) • 4H₂O)	Sigma-Aldrich	237124-500G	Usado para preparar a solução de Stienberg
Sulfato de magnésio (MgSO₄)	Mallinckrodt Chemicals	6066-04	Usado para preparar a solução de Steinberg Cloreto de
cálcio (CaCl₂)	Sigma-Aldrich	C5080-500G	Usado para preparar solução de gravação externa
Cloreto de magnésio (MgCl₂)	J.T. Baker	2444-01	Usado para preparar solução de gravação externa
químicos Mallinckrodt	anidros de D-glicose	6066-04	Usado para preparar solução de gravação externa
Cloridrato de tubocurarina pentahidratado	Sigma	T2379	Antagonista do receptor de acetilcolina nicotínico
Pinos de insetos	Ferramentas de ciências finas	26002-10	Pinos de aço inoxidável de 0,1 mm de diâmetro
Kit de elastômero de silicone Sylgard 184 Dow	Corning	761028	Kit de monômero e agente de cura pré-pesado
Placa de Petri de Poliestireno Estéril - 60x15mm	Fisher Scientific	AS4052	Pequenas placas de Petri
Agulha PrecisionGlide 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm)	BD	305122	Seringa
1mL Ponta Deslizante Seringa Tuberculina	BD	309659	Seringas descartáveis e estéreis Vidro
pipeta de borossilicato	Sutter Instrument	BF150-86-10HP	Puxado de acordo com as especificações desejadas usando a máquina de puxar pipetas
Extrator de micropipetas flamejante/marrom	Sutter Instruments	P-97	Fabrica micropipetas para gravação de eletrofisiologia
Kimwipes Toalhetes	Kimtech Kimberly-Clark	34120	Delicado limpadores sem fiapos de tarefas
Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B	Molecular Devices	1-CV-7B	Braçadeira de corrente e braçadeira de tensão headstage
MP-285 Manipulador Motorizado com Controlador de Mesa	Sutter Instrument	MP-285/T	Controle para headstage em equipamento de eletrofisiologia
LED acoplado a fibra (verde)	Thorlabs	M530F2	Cabo de fibra óptica emparelhado com LED verde
Eletrodo Bipolar de Cluster (25µ m de diâmetro)	FHC	30207	Eletrodo estimulante bipolar
ISO-Flex Stimulator	A.M.P.I. (Israel)	Contato do fabricante	Isolador de estímulo flexível
Axon Instruments 700B Amplificador Multipatch	Molecular Devices	2500-0157	Amplificador para gravação de pinça de tensão e corrente
Digidata 1322A digitalizador	Molecular Devices	2500-135	Sistema de aquisição de dados para gravação de eletrofisiologia
Axio Examiner.A1	Zeiss	491404-0001-000	Microscópio para eletrofisiologia
Mesa de Laboratório Micro-g	TMC	63-533	Mesa de ar para microscópio de eletrofisiologia
Computador de mesa pessoal Inspiron 620 com Windows 7 Computador Dell D06D001 de 64 bits			executando software de eletrofisiologia
c2400 Câmera CCD	Hamamatsu	70826-5	Câmera de dispositivo de carga acoplada para imagens de eletrofisiologia
7 O'Clock Super Platinum Lâminas de	barbear de aço inoxidávelGillette	CMM01049	Lâminas de barbear inoxidáveis revestidas de platina
Pipetas de transferência	Fisher Scientific	13-711-7M	Pipetas de transferência de polietileno descartáveis

Produtos de

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
Pratt, K. G. Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole. Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).
Liu....

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