Aqui, apresentamos um protocolo para purificar exosomes do plasma e soro com reduzida co purificação de proteínas do sangue não-exosomal. O protocolo otimizado inclui ultrafiltração, tratamento com proteases e cromatografia de exclusão. Reforçada purificação de exosomes análises benefícios a jusante, incluindo a quantificação mais precisa de vesículas e caracterização proteômica.
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Artigo de método
Digestão de proteínas, ultrafiltração e cromatografia de exclusão para otimizar o isolamento do Exosomes do Plasma de sangue humano e soro
Neste artigo
Resumo
Resumo
Exosomes, um tipo de nanovesicle liberado de todos os tipos de células, pode ser isolado de qualquer fluido corporal. O conteúdo de exosomes, incluindo proteínas e RNAs, é exclusivo para as células do qual eles são derivados e podem ser usados como indicadores de doença. Vários protocolos comuns de enriquecimento, incluindo ultracentrifugação, rendem exosomes carregado com contaminantes de proteína solúvel. Especificamente, nós encontramos que as proteínas mais abundantes no sangue muitas vezes co purificam com exosomes e podem confundir a jusante proteomic estudos, frustrar a identificação dos candidatos de biomarcador de baixa abundância. De preocupação adicional é a reprodutibilidade de quantificação de proteína exossomo devido inconsistente representação dos níveis de proteína não-exosomal. O protocolo detalhado aqui foi desenvolvido para remover as proteínas não-exosomal que purificam co juntamente com exosomes, adicionando o rigor do processo de purificação do exossomo. Cinco métodos foram comparados usando emparelhado plasma de sangue e soro de cinco doadores. Usando nanopartículas, acompanhamento, análise e ensaio de ácido da proteína de bicinchoninic micro a análise revelou que um protocolo combinado utilizando cromatografia de exclusão de ultrafiltração e tamanho rendeu o enriquecimento de vesículas ideal e remoção de proteína solúvel. Mancha ocidental foi utilizado para verificar que as proteínas do sangue abundante esperado, incluindo albumina e apolipoproteínas, foram esgotadas.
Introdução
Exosomes são nanovesicles (variando em tamanho de 30 nm a 150 nm) lançado por quase todas as células no corpo humano facilitar a comunicação célula a célula processa1,2. Curiosamente, a composição do exosomes muda dependendo das células de origem, bem como o estado de saúde do indivíduo3,4,5. Além disso, exosomes pode ser obtido em vários fluidos biológicos tais como: saliva, urina e de sangue2. Devido estas características, exosomes são considerados para ser uma boa fonte de biomarcadores da d....
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Protocolo
Este trabalho foi determinado a não ser sujeito humano pesquisa sobre revisão inicial da Colorado State University institucional Review Board (IRB), como todas as amostras humanas foram obtidas como amostras de identificados da biorepositórios Bioreclamation IVT e foram recolhidos no âmbito de protocolos IRB aprovado.
1. preparação da amostra bruta (Plasma ou soro) por vesículas maior granulação e restos celulares
Nota: Consideração de segurança: plasma, soro e outros fluidos biológicos são materiais de risco biológico e devem ser manuseados com cuidado especial, enquanto usava o equipamento de pro....
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Resultados
Os dados apresentados abaixo foram obtidos utilizando amostras de plasma e soro pareadas de cinco doadores de sangue saudáveis. Para determinar os efeitos de cada etapa de processamento, foram realizadas cinco variações do protocolo apresentado, e remoção de proteínas de recuperação e não-exossomo exossomo foram comparados. Os métodos julgados incluídos: 1) SEC 700 kDa + ultrafiltração 3 kDa; 2) ultrafiltração 100 kDa; 3) proteinase K + ultrafiltração 100 kDa; 4) SEC 700 kDa + ultrafiltra.......
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Discussão
Um método otimizado para aumentar a pureza e o rendimento de exosomes de sangue irá aumentar a capacidade de precisão meu vesículas extracelulares como fonte de biomarcadores para várias doenças. O padrão métodos atualmente usados para isolar exosomes, especificamente, ultracentrifugação e métodos de precipitação, tem várias desvantagens incluindo exossomo agregação e granulação de proteínas solúveis7,17, 18. Como alternativa, .......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada por fundos internos da CSU (para KMD), ATCC contrato #2016-0550-0002 (um subcontrato de NIAID HHSN272201600013C) e a Fundação Bill e Melinda Gates (OPP1039688) (para KMD/NKG). Agradecemos a experiência de pesquisa do NSF para programa de Verão de alunos de graduação (REU) Universidade Estadual do Colorado para suporte adicional.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Microcentrífuga de | Nanosight Malvern | NS300 | |
| Centrífuga | Thermo Legend Mico21 | ||
| Beckman Coulter | Allegra 6R | ||
| Benchmark | B2000-4 | ||
| Leitor de microplacas | BIOTEK | Epoch | |
| Pierce BCA Kit de ensaio de proteína | THERMO | 23227 | |
| Micro BCA Kit de ensaio de proteína | THERMO | 23235 | |
| Solução salina tamponada com fosfato | Corning | 21-040-CV | |
| 96 placa de poços | Corning | 15705-066 | |
| Unidade de Filtro Centrífugo Amicon Ultra-0.5 com membrana Ultracel-100 | EMD-Millipore | UFC510096 | |
| Unidades de Filtro Centrífugo Amicon Ultra-4 | EMD-Millipore | UFC800324 | |
| Capto Core 700 | GE Healthcare | 17548103 | |
| Poly-Prep Colunas de Cromatografia | BIORAD | 7311550 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | THERMO | NP0323BOX | |
| Membrana de Nitrocelulose, Rolo, 0.2 µ m | BIORAD | 1620112 | |
| Proteinase K, Tritirachium album | EMD-Millipore | 539480 | |
| SimplyBlue SafeStain | THERMO | LC6065 | |
| SIGMAFAST BCIP/NBT | Millipore-SIGMA | B5655 | |
| 4-Cloro-1-naftol | Millipore-SIGMA | C6788 | |
| Anticorpo Anti-CD63 (coelho anti-humano) com anticorpo secundário HRP anti-coelho de cabra | SYSTEM BIOSCIENCES | EXOAB-CD63A-1 | Anticorpos primários e secundários |
| ALB Anticorpo (F-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-271605 | Anticorpo primário |
| apoB (C1.4) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-13538 | Anticorpo |
| primário apoA-I Anticorpo (B-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-376818 | Anticorpo primário |
Referências
- Stoorvogel, W., Kleijmeer, M. J., Geuze, H. J., Raposo, G. The biogenesis and functions of exosomes. Traffic. 3 (5), 321-330 (2002).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
- Schorey, J. S., Ha....
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Reimpressões e permissões
