Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

مقتطفات البت في حوزتي خصوصية في الأنسجة الماوس باستخدام TOF الكتلي: التلاعب بدرجة الحموضة تسبب التغييرات النوعية

Published: May 25, 2018 doi: 10.3791/57469
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Microbiology and Molecular Cell Biology, Nihon Pharmaceutical University, 2Department of Clinical Pharmaceutics, Nihon Pharmaceutical University

Summary

هنا، نقدم بروتوكول لتحديد خصوصية حوزتي في النسيج الخام الماوس مقتطفات استخدام TOF استخدام قياس الطيف الكتلي.

Abstract

وقد البروتياز العديد من الوظائف البيولوجية، بما في ذلك هضم البروتين التنشيط/المنظمة والغذاء. تحديد خصوصية حوزتي مهم للكشف عن حوزتي الدالة. الطريقة المقترحة في هذه الدراسة تحدد مبطلات خصوصية بقياس الوزن الجزيئي لركائز فريدة من نوعها باستخدام مصفوفة-بمساعدة الليزر الامتزاز/التأين وقت الطيران (استخدام-TOF) الطيف الكتلي. ركائز تحتوي على إيمينوبيوتين، بينما الموقع ملصوق يتكون من الأحماض الأمينية، ويتكون فاصل من البولي إيثيلين غليكول. سوف تولد الركيزة ملصوق وزن الجزيئي فريدة من نوعها باستخدام الأحماض الأمينية ملصوق. ومن مزايا هذا الأسلوب هو أنه قد تجري في وعاء واحد باستخدام عينات النفط الخام، وأيضا مناسبة لتقييم عينات متعددة. في هذا المقال، يمكننا وصف أسلوب تجريبي بسيط الأمثل مع العينات المستخرجة من أنسجة الرئة الماوس، بما في ذلك استخراج الأنسجة، وضع ركائز الجهاز الهضمي في عينات، وتنقية ركائز الجهاز الهضمي تحت ظروف مختلفة الأس الهيدروجيني ، وقياس الوزن الجزيئي لركائز استخدام TOF استخدام الطيف الكتلي. باختصار، تسمح هذه التقنية للتعرف على خصوصية حوزتي في عينات النفط الخام المستمدة من مقتطفات الأنسجة استخدام TOF استخدام الطيف الكتلي، التي يمكن بسهولة الارتقاء لتجهيز نماذج متعددة.

Introduction

البروتياز تنظيم العمليات الفيزيولوجية التي ناهضة البروتينات، وبدء نشاط البروتياز في أوقات محددة ومواقع التنظيم1. ولذلك من المهم تحديد التعبير والنشاط للأنسجة التي يتم تنظيمها محلياً، ووضع طريقة جديدة للكشف عن البروتياز. الطريقة المقترحة في هذه الدراسة تهدف إلى التعرف على خصوصية حوزتي بالتوازي مع كشف البروتياز.

توجد بعض الطرق للكشف عن خصوصية حوزتي. الأسلوب أزوكاسين معروفة لاستخدامها في الكشف عن البروتياز2 ولكن محدودة في قدرتها على الحصول على مزيد من المعلومات. زيموجرافي هو آخر طريقة الكشف عن حوزتي الشاملة التي يمكن استخدامها لتحديد الوزن الجزيئي من البروتياز3، ولكن لا يمكن استخدامه لدراسة خصوصية الركازة. يمكن تحديد خصوصية حوزتي فحوصات والمطيافيه، استخدام ركائز مثل نيتروانيليدي ف-4، وفحوصات فلوروميتريك، استخدام الكومارين ركائز5 أو فحوصات Fluorescence الرنين الطاقة نقل (بكى)6. هذه الأساليب تمكين الكشف عن خصوصية واحدة من ركائز الوارد في بئر واحدة. في هذه الدراسة، هو دراسة خصوصية حوزتي مقتطفات الأنسجة تحت ظروف مختلفة، كما تحتوي هذه المقتطفات البروتياز متعددة. وينظم العديد من العوامل، بما في ذلك درجة الحموضة والأنزيمات المساعدة ومجموعات الاصطناعية وقوة أيون نشاط البروتياز. في الآونة الأخيرة، وقد استخدمت الأساليب المستندة البروتيوميات تحديد خصوصية حوزتي؛ على سبيل المثال، الطريقة التي أفادت بها بينيوسيك وآخرون. 7 يستخدم البروتين لتحديد خصوصية الركيزة حتى في مقتطفات النفط الخام ويسمح تحديد دقيق لنشاط البروتياز التي تعترف بتسلسل الأحماض الأمينية متعددة8الانقسام. ومع ذلك، هذا الأسلوب غير مناسب لتحليل العينات العديدة. وفي المقابل، تمكن لدينا أسلوب المعالجة المتزامنة لعينات متعددة، واستخدام ماتريكساسيستيد الليزر الامتزاز/التأين وقت الطيران (استخدام-TOF) الكتلي لتحليل العينات ويسهل الكشف السريع والسهل ملصوق ركائز.

وتلخص هذه الورقة أسلوباً لتقييم خصوصية حوزتي باستخدام TOF استخدام الطيف الكتلي لقياس الوزن الجزيئي لركائز فريدة من نوعها. النماذج الجزيئية لركائز ملصوق، جنبا إلى جنب مع أوزانها الجزيئية النظرية، مبينة في الشكل 1 و الجدول 1. الدراسات السابقة استخدمت الركازات المحتوية على الفواصل بوليجليسيني والبيوتين9؛ ومع ذلك، هي معيبة هذه ركائز لأنه قد يكون المشقوق التسلسل بوليجليسيني بالأنزيمات التي تعترف بالتسلسل جليكاين. بالإضافة إلى ذلك، قد يؤدي تقارب عالية بين عبدين والبيوتين إلى معدل استرداد منخفضة. ولتحسين هذه العيوب، في هذه الدراسة أننا توليفها الركازة فريد، الذي كان يتألف من البولي إيثيلين غليكول (شماعة)، إيمينوبيوتين، وهو من الأحماض الأمينية التي يمكن تحديد موقع الانقسام (الشكل 1). وأضيف إلى تميز بين الأحماض الأمينية من الأوزان الجزيئية مماثلة، د-سيرين بين مباعدة شماعة والأحماض الأمينية في الموقع ملصوق.

N--المحطة طرفية الركازة وصفت مع إيمينوبيوتين، الذي يتيح لتنقية تقارب من عينات النفط الخام. يتم استخدام إيمينوبيوتين بدلاً من البيوتين الحرجة؛ البيوتين له صلة قوية مع عبدين، الذي ينتج معدلات الاسترداد منخفضة من ركائز المسمى البيوتين من الراتنج عبدين، بينما يمكن تغيير النسب في إيمينوبيوتين لعبدين بالاس الهيدروجيني. سيتم ربط ركائز المسمى إيمينوبيوتين avidin في الشروط أعلاه الرقم الهيدروجيني 9، بينما avidin النشرات ركائز المسمى إيمينوبيوتين في ظروف أقل درجة الحموضة 4. ولذلك، استخدم إيمينوبيوتين ل تنقية تقارب10. وباختصار، يصف لنا بروتوكول مفصلة للكشف عن خصوصية حوزتي استخدام ركائز فريدة من نوعها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

البروتوكولات التجريبية الحيوانية وافقت عليها لجنة الأخلاقيات في جامعة نيهون الصيدلانية وتنفيذها وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية في جامعة نيهون الصيدلانية. وتم تعديل البروتوكول للأنسجة مقتطفات المستمدة من الفئران الممثل المدني الدولي. وتم شراء الفئران الممثل المدني الدولي من نيبون سلك المحدودة (شيزوكا، اليابان)

1-إعداد الركيزة المسمى إيمينوبيوتين

يخضع الركيزة الصلبة-مرحلة التوليف استخدام المجموعة 9-فلورينيلميثيلوكسيكاربونيل (معتدلاً)-حماية الأحماض الأمينية كما هو موضح أدناه11. استخدام الجدول 2 لتحديد معتدلاً-مجمع المستخدمة، اعتماداً على مرحلة التوليف والأحماض الأمينية المطلوب.

  1. إيجاد ز 0.2 من الراتنج معتدلاً-NH-سأل مع 10 مل N، N-dimethylformamide (DMF) في عمود توليف.
  2. إضافة 5 مل بيبيريديني 30% في DMF. روك الحل لمدة 10 دقيقة تهزم معتدلاً-المجموعة.
  3. اختبار الانقسام معتدلاً مع حمض ترينيتروبينزينيسولفونيك (تنبس) تحقق12: إضافة 10 ميليلتر من 1% أنبوب تنبس في DMF و 10 ميليلتر من دييسوبروبيليثيلاميني (ديبا) 10 × 75 مم2 زجاج الأنبوبة، ثم نقل كمية صغيرة من الراتنج للزجاج. وينبغي تطوير الراتنج المشقوق معتدلاً لون برتقالي.
    1. كرر الخطوات من 1، 1، 2-3 إذا كانت هذه النتيجة السلبية.
  4. أغسل الراتنج ثلاث مرات مع 5 مل DMF.
  5. إضافة 5 مل DMF يحتوي على 0.3 ميللي مول معتدلاً-مجمع ترد في الجدول 2 (بدءاً من مجمع المستخدمة في المرحلة 1)، 0.3 ميللي مول من 0.3 ميللي مول من 1-O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium سداسي فلوروفوسفات (هكتو)، هيدروكسيل-ح 1-بينزوتريازولي، مونوهيدرات (هوبت)، وملمول 0.6 من دييسوبروبيليثيلاميني (ديبا). روك الحل بالنسبة الزوجين فإنه مع الراتنج و 30 دقيقة.
    1. تحقق من هذه الخطوة باختبار تنبس. إذا كانت النتيجة إيجابية، وهذا يعني أن رد الفعل لم تتقدم بما فيه الكفاية ويجب تكرار هذه الخطوة.
  6. أغسل الراتنج ثلاث مرات مع 5 مل DMF.
  7. كرر رد فعل الإطالة بتكرار الخطوات من 1.2-1.6، تغيير معتدلاً-مجمع المستخدمة في الخطوة 1، 5 وفقا الجدول 2.
  8. أضف 1 مل من الماء 2.5%، 1% اثانيديثيول ترييسوبروبيلسيلاني (TIS)، و 2.5 في المائة (EDT) في حامض trifluoroacetic تهزم الببتيدات من الراتنج وحماية المجموعات. روك أن الحل لمدة 60 دقيقة.
  9. تصفية، وجمع فيلتراتي في أنبوب 50 مل.
  10. إضافة 40 مل إيثانول ثنائي إثيل الباردة ومخزن بين عشية وضحاها في-20 درجة مئوية.
  11. تجميع أجهزة الطرد المركزي س 4,000 ز في-20 درجة مئوية للحد الأدنى 30 بيليه.
  12. استخدام مجفف ح 3 لإزالة الاثير ثنائي إثيل.
  13. أضف 1 مل من الاسيتو الانيتريل 50% للمياه وحل الببتيدات النفط الخام. ليوفيليزي الحل لإزالة حامض trifluoroacetic. كرر هذه الخطوة عدة مرات.
  14. تنقية الببتيدات استخدام عمود C18 خرطوشة.
    1. تنشيط الراتنج في عمود C18 خرطوشة استخدام 3 مل من الاسيتو الانيتريل (ACN).
    2. حجته مع 5 مل من 5% تزاول، تفا 0.1% في ح2o.
    3. تحميل الببتيدات الاصطناعية النفط الخام في عمود C18 خرطوشة.
    4. يغسل مع 10 مل من 5% تزاول، تفا 0.1% في ح2o.
    5. الوت العينات مع 3 مل من 60% تزاول، 0.1% تفا ح2o.
  15. تحقق من الببتيدات بقياس الوزن الجزيئي باستخدام TOF استخدام الطيف الكتلي.
    1. "الماصة؛" 1 ميليلتر من الوينت على لوحة هدف. إضافة α-سينو-4-هيدروكسيسيناميك الحمضية المشبعة (شكا) الحل فورا في الاسيتو الانيتريل 50% في حامض trifluoroacetic 0.1%
    2. بلورة هذا الخليط بالتجفيف.
    3. الحصول على الأطياف الشامل للعينات وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة الصك.
      1. تعيين يدوياً مطياف TOF استخدام أسلحة إلى إيجابية تعكس الوضع.
      2. معايرة مطياف كتلة استخدام شكا، وتفتيت براديكينين 1-7 (الوزن الجزيئي مونويسوتوبيك = دا 756.3997)، والثاني انجيوتنسين (الوزن الجزيئي مونويسوتوبيك = دا 1,045.5423).
      3. الحصول على الأطياف الشامل من الببتيدات الاصطناعية، وتقييم ثم بمقارنته مع الوزن الجزيئي النظرية.

2-إعداد مستخلصات الأنسجة

  1. تخدير الفئران الذكور الممثل المدني الدولي في تشكيل غرفة استنشاق isoflurane والتحقق من عمق التخدير عن طريق رشة أخمص القدمين. Euthanize الفئران بخلع عنق الرحم.
  2. باستخدام مقص، جعل شق البطن خط الوسط عن طريق تمديد الجلد حتى عملية الرهابه.
  3. قطع طريق الحجاب الحاجز وجمع جميع أنسجة الرئة. قطع الأنسجة إلى قطع صغيرة.
  4. تغسل الأنسجة ثلاث مرات مع المالحة مخزنة تريس المثلج 50 مم (درجة الحموضة 7.4).
  5. وزن الأنسجة ونقل حوالي 100 ملغ أنسجة إلى أنبوب زجاج2 12 × 75 مم.
  6. أضف 0.3 مل من استخراج المخزن المؤقت (50 مم تريس-مخزن، درجة الحموضة 7.4، يحتوي على 0.1% بولي (أوكسيثيليني) أوكتيلفينيل البروم ثنائي الفينيل).
  7. مجانسة عينات أنسجة الرئة استخدام الخالطون خلط.
    1. تبريد العينات على الجليد.
    2. مجانسة العينات 20,000 لفة في الدقيقة لمدة 30 ثانية في خلاط. كرر هذه الخطوة حتى تكون العينات متجانسة تماما.
      ملاحظة: مجانسة ليس لأكثر من دقيقة واحدة بشكل مستمر، لتجنب زيادة في درجة الحرارة.
  8. نقل 1,000 ميليلتر من هوموجيناتي إلى أنبوب 1.5 مل والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 10,000 ز x عند 4 درجة مئوية.
  9. نقل 500 ميليلتر من المادة طافية بأنبوب بلاستيكي 1.5 مل جديدة.
  10. استخدام 10 ميليلتر من العينة لتحديد تركيز البروتين، باستخدام أساليب مثل بيسينتشونينيك حمض (اتفاق التعاون الأساسي) أو أسلوب أخذ الرائعة الأزرق (مصرف البحرين المركزي).
  11. لمنع تجميد، أضف والغليسيرول 80% للعينات لتركيز نهائي والغليسيرول 50%.
  12. تخزين العينات في-80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.

3-هضم ركائز في حوزتي النموذجي ومقتطفات الأنسجة

  1. إضافة 10 ميليلتر من 0.1 ميكروغرام/ميليلتر من N-توسيل-L-فينيلالاناين ثاني ميثيل كيتون (تبكك)-التربسين أو 0.1 ميكروغرام/ميليلتر من المكوّرات العنقودية المذهبة V8 حوزتي 10 ميكروغرام/ميليلتر من مقتطفات الأنسجة إلى 890 ميليلتر من المخزن المؤقت الهضم.
    1. لتوضيح الفرق في حوزتي خصوصية اعتماداً على درجة الحموضة، استخدام المخازن المؤقتة المعدلة للحموضة 3، 5 و 7 و 9. ويرد في الجدول 3تكوين المخزن المؤقت الهضم.
    2. تنفيذ عنصر تحكم سلبية استخدام حوزتي غير نشط في مقتطفات الأنسجة، أعدها حضانة في الماء المغلي (أو تدفئة في 100 درجة مئوية) لمدة 10 دقائق.
  2. إضافة 10 ميليلتر من ركائز المسمى إيمينوبيوتين (حله في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])، تركيز النهائي = 100 ميليلتر pmol/10).
  3. احتضان لمدة 3 ساعات في 37 درجة مئوية لهضم ركائز المسمى إيمينوبيوتين.
  4. بعد الحضانة، توقف هضم ركائز مع الماء المغلي (أو تدفئة في 100 درجة مئوية) لمدة 10 دقائق.
  5. الطرد المركزي ركائز الهضم لمدة 5 دقائق في 10,000 ز x عند 4 درجة مئوية.
  6. نقل المادة طافية في أنبوب 1.5 مل جديدة.

4-تنقية الركازة المسمى إيمينوبيوتين

  1. إضافة 50 ميليلتر من حبات سيفاروسي ستريبتافيدين 50% في 1 م تريس-المخزن المؤقت (pH 9) يحتوي على 0.1% poly(oxyethylene) أوكتيلفينيل الاثير.
    1. استخدم ورقة اختبار درجة الحموضة للتأكد من أن الحل حول الأس الهيدروجيني 9. إذا كان الرقم الهيدروجيني للحل منخفض، ضبطه على درجة الحموضة حوالي 9 بإضافة 1 م تريس-المخزن المؤقت (pH 9) يحتوي على 0.1% poly(oxyethylene) أوكتيلفينيل الاثير. هذه الخطوة غير هامة، كما أنها تنطوي على ربط الركازة المسمى إيمينوبيوتين إلى ستريبتافيدين.
  2. تبني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع خلط لطيف المستمر على عجلة المدورة لربط ركائز المسمى إيمينوبيوتين ستريبتافيدين. ينبغي أن تظل الخرز مع وقف التنفيذ في جميع أنحاء الحضانة.
  3. أجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 10,000 ز x عند 4 درجة مئوية. إزالة المادة طافية.
  4. أغسل الخرز خمس مرات على النحو التالي:
    1. إضافة ميليلتر 1,000 المخزن المؤقت الغسيل (50 مم تريس-المخزن المؤقت، الرقم الهيدروجيني 9) الخرز.
    2. المياه والصرف الصحي لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية مع خلط لطيف المستمر على عجلة المدورة. ينبغي أن تظل الخرز مع وقف التنفيذ في جميع أنحاء الحضانة.
    3. الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 10,000 ز x عند 4 درجة مئوية وإزالة المادة طافية.
  5. إضافة 100 ميليلتر من حامض trifluoroacetic 0.2% الخرز.
    1. استخدم ورقة اختبار درجة الحموضة للتأكد من أن الحل يكمن في درجة الحموضة 2 أدناه. في حالة ارتفاع الرقم الهيدروجيني للحل، قم بضبط ال pH إلى أقل من 2 بإضافة حامض trifluoroacetic 1%.
  6. احتضان مدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع خلط لطيف المستمر على عجلة المدورة.
  7. الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 10,000 ز x عند 4 درجة مئوية، ثم نقل المادة طافية إلى أنبوب 1.5 مل جديدة.

5-عينة من إعداد والليزر ساعد مصفوفة الامتزاز/التأين وقت الطيران الطيف الكتلي (TOF استخدام الطيف الكتلي)

ملاحظة: ينبغي إعداد كافة الحلول في الخطوات التالية مع كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك])-المياه تسلسل الصف الصف أو الأحماض الأمينية.

  1. "الماصة؛" 500 ميليلتر من الاسيتو الانيتريل على راتنج C18 لتنشيطه. إزالة الاسيتو الانيتريل المستخدمة. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
  2. حجته على راتنج C18 مع 100 ميليلتر من حامض trifluoroacetic 0.1%. قم بإزالة في الوينت. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
  3. لتحميل العينات، ربط العينات الراتنج استخدام ماصة.
  4. أغسل الراتنج مع 20 ميليلتر من حامض trifluoroacetic 0.1%. كرر هذه الخطوة من خمس مرات.
  5. الوت العينات مع 3 ميليلتر من الاسيتو الانيتريل 60% في حامض trifluoroacetic 0.1%. "الماصة؛" الوينت على لوحة هدف لاستخدام TOF الكتلي. فور إضافة α-سينو-4-هيدروكسيسيناميك الحمضية المشبعة (شكا) الحل في الاسيتو الانيتريل 50% في حامض trifluoroacetic 0.1%.
  6. بلورة هذا الخليط بالتجفيف.
  7. الحصول على الأطياف الشامل للعينات وفقا للبروتوكول صك الشركة المصنعة.
    1. تعيين يدوياً مطياف TOF استخدام أسلحة إلى إيجابية تعكس الوضع.
    2. معايرة مطياف كتلة استخدام شكا، وتفتيت براديكينين 1-7 (الوزن الجزيئي مونويسوتوبيك = دا 756.3997)، والثاني انجيوتنسين (الوزن الجزيئي مونويسوتوبيك = دا 1,045.5423).
    3. الحصول على الأطياف الشامل من العينات، وإيلاء اهتمام وثيق للاطياف الشامل من 700 إلى 900 دا للنموذج ملصوق من ركائز المسمى البيوتين.
  8. التعرف على قمم المكتشفة باستخدام الجدول 1. الكشف عن الوزن الجزيئي مناسبة تشير إلى انشقاق في ج-محطة الأحماض الأمينية ذات الصلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تقييم طريقة للتعرف على خصوصية حوزتي بحوزتي النموذجي

وكان تقييم كفاءة هذا النظام باستخدام تبكك-التربسين وحوزتي V8، خصوصيات الركيزة التي تم الحصول عليها. وقدرت تبكك-التربسين وحوزتي V8 تنشق تسلسل الأحماض الأمينية في ج--المحطة طرفية مخلفات يسين وارجينين، وإلى جانب كاربوكسي حمض الأسبارتيك وحمض الجلوتاميك المخلفات، على التوالي. الجدول 1 يبين الوزن الجزيئي النظرية للركيزة ويهضم شظايا المشقوق من البروتياز محددة. أنتجت الهضم الركيزة باستخدام تبكك-التربسين ملصوق الشظايا، اثنتان منها يمكن أن يتم الكشف عنها في 839.81 دا ودا 796.76 (الشكل 2A). كانت الأوزان الجزيئية لهذه الشظايا عن كثب تمشيا مع الأوزان الجزيئية النظرية الشظايا المشقوق من ج--المحطة الطرفية من يسين وارجينين، على التوالي. وبالإضافة إلى ذلك، تحويل حوزتي V8 ركائز السلائف إلى شكلها ملصوق، مع الأوزان الجزيئية دا 769.78 و 755.62 دا (الشكل 2)، الذي يقابل النظرية m/z من حمض الجلوتاميك وحمض الأسبارتيك، على التوالي. تشير هذه النتائج إلى أنه يمكن استخدام هذا الأسلوب لتحديد خصوصية حوزتي مع TOF استخدام الطيف الكتلي بنجاح.

مقتطفات التقييم لخصوصية الركيزة في مستويات الأس الهيدروجيني مختلفة باستخدام الماوس الرئة

وكان من مزايا هذا الأسلوب أنه يمكن معالجة عدد كبير من العينات في وقت واحد. أظهرت هذه الدراسة أن خصوصية الركازة تغير وفقا لمستوى الرقم الهيدروجيني (الشكل 3). في الظروف الحمضية (الشكل 3B؛ ودرجة الحموضة 5)، كان الوزن الجزيئي لجزء ملصوق دا 770.13 ودا 826.66. هذه النتائج أشارت إلى أن يتضمن استخراج أنسجة الرئة البروتياز مع القدرة على تنشق في ج-المحطة من حمض الجلوتاميك والتربتوفان. كمستوى الرقم الهيدروجيني زيادة تدريجيا، القمم من شظايا المشقوق بحمض الجلوتاميك والتربتوفان انخفضت تدريجيا، بينما زادت قمم الشظايا المشقوق ارجينين ويسين تدريجيا (الشكل 3جيم، ودال؛ الرقم الهيدروجيني 7 و 9). هذه النتائج أشارت إلى أن يتضمن استخراج الرئة البروتياز اثنين أو أكثر أن كان مختلف الخصوصيات الأس الهيدروجيني والانقسام والأمثل.

Figure 1
رقم 1: مخطط للكشف عن خصوصية حوزتي. (أ) هيكل الركازة المسمى إيمينوبيوتين لخصوصية حوزتي. (ب) ركائز قد إيمينوبيوتين، وفاصل البولي إيثيلين غليكول، وموقع كليفابل من الأحماض الأمينية. (ج) أطياف ركائز المسمى إيمينوبيوتين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: تقييم الأسلوب لتحديد خصوصية حوزتي استخدام إنزيم المنقي. (أ) تعامل الأطياف لركائز المسمى إيمينوبيوتين مع تبكك-التربسين. مطابقة قمم 839.81 و 796.76 الوزن الجزيئي النظرية الأجزاء التي تم إنشاؤها بواسطة الانقسام إلى جانب المحطة الطرفية ج يسين وارجينين، على التوالي. (ب) يعامل الأطياف لركائز المسمى إيمينوبيوتين بحوزتي V8. مطابقة قمم 769.78 و 755.62 الوزن الجزيئي النظرية الأجزاء التي تم إنشاؤها بواسطة الانقسام إلى جانب المحطة الطرفية ج حمض الجلوتاميك وحمض الأسبارتيك، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
رقم 3: تقييم الأسلوب لتحديد خصوصية حوزتي استخدام أنسجة تستخرج. استخراج الأطياف لركائز المسمى إيمينوبيوتين تعامل مع أنسجة الرئة. وتظهر هذه الأطياف القمم التي تم الحصول عليها في الأس الهيدروجيني (A) 3 والأس الهيدروجيني (ب) 5 (ج) الرقم الهيدروجيني 7 (د) الأس الهيدروجيني 9. (ه) المسمى إيمينوبيوتين ركائز المحتضنة مع انتزاع الأنسجة غير نشط مع المعالجة الحرارية لتقييم الهضم غير محددة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

X السلائف نموذج ملصوق
ز 886.58 697.58
A 900.60 711.60
S 916.59 727.59
ف 926.61 737.61
V 928.63 739.63
T 930.61 741.61
ج * 1003.57 814.57
أنا * 1013.64 824.64
L 942.64 753.64
N * 1014.60 825.60
د 944.59 755.59
Q 957.62 768.62
ك * 1028.65 839.65
ه 958.60 769.60
M * 1031.60 842.60
ح 966.62 777.62
و 976.63 787.63
R 985.66 796.66
Y 992.62 803.62
W * 1015.64 826.64
*: نموذج د-سر-إكسا

الجدول 1: الوزن الجزيئي النظرية لركائز المسمى إيمينوبيوتين والوزن الجزيئي المتوقعة من شظايا حوزتي. وتشير العلامات النجمية (*) إلى إضافة د-سيرين بين مباعدة البولي إيثيلين والأحماض الأمينية كليفابل.

إكسا: علاء الغليسين، Ser، برو، Val، Thr، لوي، آسيا والمحيط الهادئ، جلن، غلو، له، الفنيل ألانين، الأرجنتين، صور.
المرحلة مجمع معتدلاً
1 معتدلاً-ميني--PEG3--أوه
2 معتدلاً-إكسا-أوه
3 معتدلاً-ميني--PEG3--أوه
4 معتدلاً-ميني--PEG3--أوه
5 إيمينوبيوتين
إكسا: Cys، إيل، Asn، ليز، اجتمع، الحزب
المرحلة مجمع معتدلاً
1 معتدلاً-ميني--PEG3--أوه
2 معتدلاً-إكسا-أوه
3 معتدلاً-د-كادينا (تبو)-أوه
4 معتدلاً-ميني--PEG3--أوه
5 معتدلاً-ميني--PEG3--أوه
6 إيمينوبيوتين

الجدول 2: قائمة متسلسلة من الكواشف المستخدمة لتوليف الركازة.

الأس الهيدروجيني تكوين
9 تريسيني تحتوي على كلوريد الصوديوم M 0.1 50 و 10 ملم كاكل2
7 تريس-HCl التي تحتوي على كلوريد الصوديوم M 0.1 50 و 10 ملم كاكل2
5 خلات الصوديوم 50 ملم التي تحتوي على كلوريد الصوديوم M 0.1 و 10 مم كاكل2
3 حمض الستريك 50 ملم التي تحتوي على كلوريد الصوديوم M 0.1 و 10 مم كاكل2

الجدول 3: التراكيب الحلول المخزن المؤقت للمستخدم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هذا البروتوكول يستخدم TOF استخدام الطيف الكتلي للتعرف على خصوصية حوزتي في عينات النفط الخام المستمدة من مستخلصات الأنسجة ويمكن الارتقاء بسهولة لتجهيز نماذج متعددة. على وجه الخصوص، نحن التلاعب بدرجة الحموضة تسبب تغييرا في خصوصية الركازة.

واستخدمت الطريقة (ABC) عبدين-البيوتين المعقدة، التي استخدمت على نطاق واسع في الكيمياء الحيوية بسبب خصوصيته ملزمة، لدينا بروتوكول. سبب انجذاب قوي من أي بي سي، ربط avidin إلى البيوتين لا رجعة فيه تقريبا. ولذلك انجذاب تطهير لأبجديات غير فعالة. لهذا السبب، نحن التقرير أن معدل الاسترداد لركائز المسمى البيوتين من المتوقع أن تكون منخفضة. في هذه الدراسة، كنا فقط على مستوى الرقم الهيدروجيني منخفض شطف؛ ومع ذلك، ديجليكوسيلاتيد عبدين-راتنج13 أو الراتنج عبدين أحادي14 قد ستستخدم أيضا لتنقية ركائز المسمى البيوتين.

ويمكن تعديل الأسلوب المقترح في هذه الدراسة لمختلف النظم التجريبية والتطبيقات؛ إذ تضع في اعتبارها أن مطياف كتلة TOF استخدام غير قادر على إجراء التحليل الكمي. بمجرد تحديد خصوصية الركازة، قد يكون من الأفضل القيام بالقياس الكمي باستخدام فحوصات والمطيافيه أو فحوصات فلوروميتريك Fluorescence الرنين الطاقة نقل (بكى).

معايرة الكتلي هو أهم خطوة في هذا البروتوكول. وفي الحالات التي يكشف فيها ركائز مع الأوزان الجزيئية مماثلة، يمكن تحسين دقة النتائج عن طريق إضافة الوزن الجزيئي للسلائف.

نظراً لأن رد فعل إنزيم يتعزز مع مرور الوقت، فمن الممكن لتمديد وقت رد الفعل إذا لا يمكن الكشف عن الإنزيم. ومع ذلك، ترك رد الفعل تستمر لأكثر من 24 ساعة النتائج في التفاعلات الجانبية التي تولد قمم غير مرغوب فيها. ولذلك، فإنه من المستحسن القيام برد فعل لما يصل إلى 18 س أو للتحكم في الاختبار باستخدام الحرارة تعامل العينات. ويمكن تحديد هذا الإجراء خصوصية مبطلات لداخل فيمتومول عدد قليل من التربسين.

وفي الختام، نحن نقدم أسلوب مناسب يستخدم ركائز المسمى إيمينوبيوتين لتقييم خصوصية حوزتي. هذا الأسلوب يسمح للمعالجة المتزامنة لعينات متعددة ويمكن استخدامها لتبسيط فحص البروتياز.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل جزئيا "منحة بحثية جامعة نيهون الصيدلانية" من جامعة نيهون الصيدلانية (2016) و JP17854179 رقم المنحة كاكينهي يأمرون.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)
aminomethyl]phenoxy resin)		 Watanabe Chemical Co., Ltd. A00102
N,N-dimethylformamide (DMF) Watanabe Chemical Co., Ltd. A00185
piperidine Watanabe Chemical Co., Ltd. A00176
trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) WAKO Chemical 209-1483
O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU) Watanabe Chemical Co., Ltd. A00067
1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt) Watanabe Chemical Co., Ltd. A00014
diisopropylethylamine (DIPEA) Watanabe Chemical Co., Ltd. A00030
triisopropylsilane (TIS) Watanabe Chemical Co., Ltd. A00170
ethanedithiol (EDT) Watanabe Chemical Co., Ltd. A00057
trifluoroacetic acid (TFA) Millipore S6612278 403
acetonitrile Kokusan Chemical 2153025
C18 cartridge column Waters WAT051910
poly(oxyethylene) octylphenyl ether WAKO Chemical 168-11805 Triton X-100
mixing homogenizer Kinematica PT3100 polytron homogenizer
Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250 Nakarai Chemical 094-09
glycerol Nakarai Chemical 170-18
N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin Sigma-Aldrich T1426
dimethyl sulfoxide (DMSO) WAKO Chemical 043-07216
streptavidin sepharose GE Healthcare 17-511-01
ZipTipC18 Millipore ZTC18S096
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) Sigma-Aldrich C2020
MALDI-TOF mass spectrometry Bruker Daltonics, Germany autoflex
2-iminobiotin Sigma-Aldrich I4632
Fmoc-amino acids Watanabe Chemical Co., Ltd.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neurath, H., Walsh, K. A. Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review). Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).
  2. Surinov, B. P., Manoilov, S. E. Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein. Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).
  3. Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases. Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).
  4. Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin. Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).
  5. Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin. Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).
  6. Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer. Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).
  7. Timmer, J. C., et al. Profiling constitutive proteolytic events in vivo. Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).
  8. Biniossek, M. L., et al. Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).
  9. Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates. Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).
  10. Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).
  11. Merrifield, R. B. Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).
  12. Hancock, W. S., Battersby, J. E. A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid. Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).
  13. Marttila, A. T., et al. Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties. FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).
  14. Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography. Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).

Tags

الكيمياء الحيوية، 135 قضية، خصوصية حوزتي، TOF استخدام الطيف الكتلي، المسمى البيوتين الركازة، واستخراج النفط الخام، متعددة شرط، الرئة
مقتطفات البت في حوزتي خصوصية في الأنسجة الماوس باستخدام TOF الكتلي: التلاعب بدرجة الحموضة تسبب التغييرات النوعية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yamamoto, H., Sawaguchi, Y., Kimura, … More

Yamamoto, H., Sawaguchi, Y., Kimura, M. The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes. J. Vis. Exp. (135), e57469, doi:10.3791/57469 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter