Summary
Qui, presentiamo un protocollo per determinare la specificità di proteasi in tessuto grezzo del mouse estratti usando spettrometria MALDI-TOF.
Abstract
Proteasi hanno diverse funzioni biologiche, tra cui la digestione della proteina di attivazione/inattivazione e cibo. Identificazione della proteasi specificità è importante per rivelare la funzione di proteasi. Il metodo proposto in questo studio determina la specificità della proteasi misurando il peso molecolare dell'unici substrati utilizzando Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization spettrometria di massa di tempo di volo (MALDI-TOF). I substrati contengono iminobiotin, mentre il sito fenduto è composto da aminoacidi, e il distanziatore è costituito da polietilene glicole. Il substrato fenduto genererà un unico peso molecolare usando un aminoacido spaccato. Uno dei meriti di questo metodo è che può essere effettuata in una pentola utilizzando campioni di greggi, ed è anche adatto per valutare campioni multipli. In questo articolo, descriviamo un metodo sperimentale semplice ottimizzato con campioni estratti dal tessuto polmonare di topo, compresa l'estrazione del tessuto, inserimento di substrati digestivi in campioni, purificazione dei substrati digestivi in condizioni di pH diversi e la misurazione del peso molecolare dei substrati utilizzando la spettrometria di massa MALDI-TOF. In sintesi, questa tecnica consente l'identificazione della specificità di proteasi in campioni grezzi derivati da estratti di tessuto mediante spettrometria di massa MALDI-TOF, che facilmente può essere scalata per elaborazione di campione più.
Introduction
Proteasi regolano processi fisiologici fendendo proteine, e l'avvio di attività di proteasi a orari specifici e posizioni è regolato1. Pertanto è importante per identificare l'espressione e l'attività dei tessuti che sono regolate localmente e per sviluppare un nuovo metodo per rilevare le proteasi. Il metodo proposto questo studio mira a identificare le specificità di proteasi in parallelo al rilevamento di proteasi.
Ci sono alcuni metodi per la rilevazione di specificità di proteasi. Il metodo azocaseina è ben noto per il suo utilizzo nella rilevazione di proteasi2 ma è limitato nella sua capacità di ottenere ulteriori informazioni. Zymography è un altro metodo di rilevamento di proteasi completa che può essere utilizzato per determinare il peso molecolare di proteasi3, ma non può essere utilizzato per esaminare la specificità di substrato. Specificità della proteasi può essere determinato dalle analisi spettrometriche, utilizzando substrati quali p-nitroanilide4e le analisi fluorometriche, utilizzando substrati di cumarina5 o fluorescenza Resonance Energy Transfer (FRET) saggi6. Questi metodi consentono la rilevazione di singolo-specificità dei substrati contenute in un singolo pozzo. Nello studio presente, la specificità di proteasi di estratti di tessuto viene esaminata in varie condizioni, come questi estratti contengono proteasi multiple. L'attività della proteasi è regolata da diversi fattori, tra cui pH, coenzimi, gruppi prostetici e resistenza dello ione. Recentemente, metodi basati sulla proteomica sono state usate per identificare la specificità della proteasi; ad esempio, il metodo riportato da Biniossek et al. 7 utilizza il proteoma per determinare la specificità di substrato anche in estratti grezzi e consente la determinazione accurata dell'attività delle proteasi che riconoscono più dell'amminoacido sequenze8clivaggio. Tuttavia, questo metodo non è adatto per l'analisi di numerosi campioni. Al contrario, il nostro metodo consente l'elaborazione simultanea di più campioni e l'uso di Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) spettrometria di massa per l'analisi facilita la rilevazione rapida e facile della spaccati substrati.
Questa carta descrive un metodo per valutare la specificità della proteasi mediante spettrometria di massa MALDI-TOF per misurare il peso molecolare di substrati unici. Le forme molecolari di substrati spaccati, insieme al loro peso molecolare teorico, sono mostrate in Figura 1 e tabella 1. Gli studi precedenti hanno usato substrati contenenti polyglycine distanziali e biotina9; Tuttavia, questi substrati sono viziati perché la sequenza di polyglycine può essere clivata da enzimi che riconoscono la sequenza di glicina. Inoltre, l'alta affinità tra avidina e la biotina può portare a un tasso basso di recupero. Per migliorare questi inconvenienti, in questo studio che abbiamo sintetizzato un substrato unico, che era composta di polietilenglicole (PEG), iminobiotin e un aminoacido che potrebbe identificare il sito di clivaggio (Figura 1). Per discriminare tra amminoacidi di simili pesi molecolari, D-serina è stato aggiunto tra il distanziale di PEG e dell'aminoacido nel sito spaccati.
il N-terminale del substrato è stato etichettato con iminobiotin, che permette la purificazione di affinità da campioni di greggi. L'uso di iminobiotin invece di biotina è critico; la biotina ha una forte affinità con avidina, che si traduce in tassi di recupero basso di biotina substrati da resina avidina, mentre affinità di iminobiotin per avidina può essere alterato da pH. Iminobiotin-etichettati substrati legheranno per avidina in condizioni sopra pH 9, mentre avidina rilascia iminobiotin-etichettati substrati in condizioni sotto pH 4. Pertanto, iminobiotin è stato usato per la purificazione di affinità10. In breve, descriviamo un protocollo dettagliato per la rilevazione di specificità di proteasi utilizzando substrati unici.
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Protocol
Protocolli sperimentali animali erano approvati dal comitato etico dell'Università Nihon Pharmaceutical ed eseguiti in conformità con le linee guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio dell'Università Nihon Pharmaceutical. Il protocollo è stato regolato per estratti di tessuto derivati da topi ICR. Topi ICR sono stati acquistati da Nippon SLC Ltd. (Shizuoka, Giappone)
1. preparazione del substrato con etichetta Iminobiotin
Il substrato subisce sintesi in fase solida utilizzando gruppo 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-protetti aminoacidi come descritto di seguito11. Utilizzare la tabella 2 per determinare il Fmoc-composto utilizzato, a seconda del desiderato dell'aminoacido e la fase di sintesi.
- Broda 0,2 g di resina Fmoc-NH-SAL con 10 mL di N, N-dimetilformammide (DMF) in una colonna di sintesi.
- Aggiungere 5 mL di 30% piperidina in DMF. La soluzione per 10 min a fendere Fmoc-gruppo della roccia.
-
Verifica Fmoc scissione con l'acido trinitrobenzenesulfonic (TNBS) prova12: aggiungere 10 µ l di 1% TNBS in DMF e 10 µ l di diisopropylethylamine (DIPEA) per un tubo di vetro 10 x 75 mm2 , poi trasferire una piccola quantità di resina al vetro tubo. La resina Fmoc-spaccati dovrebbe sviluppare un colore arancione.
- Ripetere i passaggi da 1.2-1.3 Se questo risultato è negativo.
- Lavare la resina tre volte con 5 mL di DMF.
-
Aggiungere 5 mL di DMF contenenti 0,3 mmol di Fmoc-composto elencati nella tabella 2 (a partire con il composto utilizzato nella fase 1), 0,3 mmol di Esafluorofosfato di O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium (HCTU), 0,3 mmol di 1- Idrossi-1h-benzotriazolo, monoidrato (HOBt) e 0,6 mmol di diisopropylethylamine (DIPEA). La soluzione per 30 min per abbinarlo con la resina della roccia.
- Controllare questo passaggio con il test TNBS. Se il risultato è positivo, questo significa che la reazione non è sufficientemente progredita e questo passaggio deve essere ripetuto.
- Lavare la resina tre volte con 5 mL di DMF.
- Ripetere la reazione di allungamento ripetendo i punti 1.2-1.6, cambiando il Fmoc-composto utilizzato nel passaggio 1.5 secondo la tabella 2.
- Aggiungere 1 mL di acqua di 2,5%, 1% triisopropylsilane (TIS) e 2,5% etanditiolo (EDT) in acido trifluoroacetico fendere peptidi dai gruppi di resina e protezione. Roccia la soluzione per 60 min.
- Filtrare e raccogliere il filtrato in un tubo da 50 mL.
- Aggiungere 40 mL di etanolo freddo etilico e store durante la notte a-20 ° C.
- Centrifugare a 4.000 x g a-20 ° C per 30 min. raccogliere il pellet.
- Utilizzare un essiccatore per 3 h per eliminare l'etere etilico.
- Aggiungere 1 mL di acetonitrile 50% acqua e sciogliere i peptidi grezzi. Lyophilize la soluzione per rimuovere l'acido trifluoroacetico. Ripetere questa operazione più volte.
-
Purificare i peptidi utilizzando una colonna di cartuccia C18.
- Attivare la resina nella colonna Cartuccia C18 con 3 mL di acetonitrile (ACN).
- Equilibrare con 5 mL di ACN di 5%, 0,1% TFA in H2O.
- Caricare i greggi peptidi sintetici nella colonna Cartuccia C18.
- Lavare con 10 mL di ACN di 5%, 0,1% TFA in H2O.
- Eluire i campioni con 3 mL di 60% ACN, 0,1% TFA in H2O.
-
Controllare i peptidi misurando il loro peso molecolare mediante spettrometria di massa MALDI-TOF.
- Pipettare 1 µ l di eluente su una zolla di destinazione. Aggiungere immediatamente la soluzione satura di α-ciano-4-idrossicinnamico acido (CHCA) in 50% acetonitrile in 0,1% acido trifluoroacetico
- Cristallizzare la miscela di essiccamento ad aria.
- Acquisire spettri di massa dei campioni secondo il protocollo del produttore dello strumento.
- Impostare manualmente lo spettrometro di massa MALDI-TOF ad un positivo riflettono modalità.
- Calibrare lo spettrometro di massa utilizzando CHCA, bradichinina frammento 1-7 (peso molecolare monoisotopic = Da 756.3997) e dell'angiotensina II (peso molecolare monoisotopic = Da 1,045.5423).
- Acquisire spettri di massa dei peptidi sintetici e valutare quindi confrontarlo con il peso molecolare teorico.
2. preparazione di estratti di tessuto
- Anestetizzare topi ICR maschii in una camera di inalazione isoflurane e verificare la profondità di anestesia tramite pizzico di punta. Eutanasia i topi di dislocazione cervicale.
- Utilizzando le forbici, fare un'incisione addominale del midline attraverso la pelle che si estende fino al processo xifoideo.
- Tagliare attraverso il diaframma e raccogliere tutto il tessuto del polmone. Tagliare il tessuto in piccoli pezzi.
- Lavare il tessuto tre volte con soluzione fisiologica tamponata ghiacciata 50 mM (pH 7.4).
- Pesare i tessuti e il trasferimento di circa 100 mg di tessuti in una provetta di vetro2 12 x 75 mm.
- Aggiungere 0,3 mL di tampone di estrazione (50mm Tris-tampone, pH 7.4, contenenti 0,1% poli (oxyethylene) octylphenyl etere).
-
Omogeneizzare i campioni di tessuto polmonare utilizzando un omogeneizzatore di miscelazione.
- Raffreddare i campioni su ghiaccio.
- Omogeneizzare i campioni a 20.000 giri/min per 30 s in un frullatore. Ripetere questo passaggio fino a quando i campioni sono completamente omogenei.
Nota: Non omogeneizzare per più di 1 minuto di continuo, al fine di evitare un aumento della temperatura.
- Trasferire 1.000 µ l dell'omogenato in una provetta da 1,5 mL e centrifugare per 5 min a 10.000 x g a 4 ° C.
- Trasferire 500 µ l del surnatante ad un nuovo tubo di plastica da 1,5 mL.
- Utilizzare 10 µ l di campione per determinare la concentrazione di proteine, mediante metodi quali il bicinconinico acido (BCA) o il metodo di Coomassie Brilliant Blue (CBB).
- Per evitare il congelamento, aggiungere 80% glicerolo ai campioni per una concentrazione finale di glicerolo al 50%.
- Conservare i campioni a-80 ° C fino all'utilizzo ulteriore.
3. la digestione dei substrati in estratti di tessuto e modello della proteasi
-
Aggiungere 10 µ l di 0,1 µ g / µ l del chetone di clorometil N-tosyl-L-fenilalanina (TPCK)-tripsina, 0.1 µ g / µ l della proteasi di Staphylococcus aureus V8 o 10 µ g / µ l di estratti di tessuto in 890 µ l di un tampone di digestione.
- Per chiarire la differenza nella specificità di proteasi a seconda del pH, utilizzare buffer regolata a pH 3, 5, 7 e 9. La composizione del buffer digestione è mostrata nella tabella 3.
- Eseguire un controllo negativo usando proteasi inattivi in estratti di tessuto, preparati da incubazione in acqua bollente (o riscaldamento a 100 ° C) per 10 min.
- Aggiungere 10 µ l di iminobiotin-etichettati substrati (disciolto in dimetilsolfossido (DMSO), concentrazione finale = 100 pmol/10 µ l).
- Incubare per 3 ore a 37 ° C per digerire i substrati iminobiotin-labeled.
- Dopo l'incubazione, è necessario interrompere la digestione di substrati con acqua bollente (o di riscaldamento a 100 ° C) per 10 min.
- Centrifugare i substrati digeriti per 5 min a 10.000 x g a 4 ° C.
- Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 mL.
4. purificazione del substrato con etichetta Iminobiotin
-
Aggiungere 50 µ l di 50% streptavidin sepharose perline in etere octylphenyl di 1m tampone Tris (pH 9) contenente 0,1% poly(oxyethylene).
- Utilizzare carta pH test per assicurarsi che la soluzione sia intorno a pH 9. Se il pH della soluzione è basso, la regolazione a circa pH 9 aggiungendo etere octylphenyl di 1m tampone Tris (pH 9) contenente 0,1% poly(oxyethylene). Questo passaggio è importante, come comporta l'associazione del substrato marcato iminobiotin di streptavidina.
- Incubare per una notte a 4 ° C con miscelazione delicata continuo su una ruota di rotatore per associare i substrati iminobiotin-etichettati per la streptavidina. Le perle dovrebbero restare sospese durante l'incubazione.
- Centrifugare per 1 min a 10.000 x g a 4 ° C. Eliminare il surnatante.
-
Lavare le perle cinque volte come segue:
- Aggiungere 1.000 µ l di tampone di lavaggio (50 mM Tris-tampone di pH 9) ai talloni.
- Lavare per 10 min a 4 ° C con miscelazione delicata continuo su una ruota di rotatore. Le perle dovrebbero restare sospese durante l'incubazione.
- Centrifugare per 1 min a 10.000 x g a 4 ° C e rimuovere il surnatante.
-
Aggiungere 100 µ l di acido trifluoroacetico 0,2% ai talloni.
- Utilizzare carta pH test per assicurarsi che la soluzione sia sotto pH 2. Se il pH della soluzione è elevato, è possibile regolare il pH a sotto 2 aggiungendo acido trifluoroacetico 1%.
- Incubare per 30 min a temperatura ambiente con miscelazione delicata continuo su una ruota di rotatore.
- Centrifugare per 1 min a 10.000 x g a 4 ° C, quindi trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 mL.
5. preparazione e Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight (spettrometria di massa MALDI-TOF) spettrometria di massa del campione
Nota: Tutte le soluzioni di seguito dovrebbero essere preparate con cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC)-acqua di sequenziamento-grado grado o dell'amminoacido.
- Pipettare 500 µ l di acetonitrile su una resina C18 per attivarlo. Rimuovere l'acetonitrile usato. Ripetere questa operazione tre volte.
- Equilibrare la resina C18 con 100 µ l di acido trifluoroacetico 0,1%. Rimuovere l'eluente. Ripetere questa operazione tre volte.
- Per caricare i campioni, è necessario associare i campioni per la resina con una pipetta.
- Lavare la resina con 20 µ l di acido trifluoroacetico 0,1%. Ripetere questo passaggio cinque volte.
- Eluire i campioni con 3 µ l di acetonitrile 60% in acido trifluoroacetico 0,1%. Pipettare l'eluente su una piastra di destinazione per la spettrometria di massa MALDI-TOF. Immediatamente aggiungere soluzione satura di α-ciano-4-idrossicinnamico acido (CHCA) nel 50% acetonitrile in acido trifluoroacetico 0,1%.
- Cristallizzare la miscela di essiccamento ad aria.
-
Acquisire spettri di massa dei campioni secondo il protocollo del produttore dello strumento.
- Impostare manualmente lo spettrometro di massa MALDI-TOF ad un positivo riflettono modalità.
- Calibrare lo spettrometro di massa utilizzando CHCA, bradichinina frammento 1-7 (peso molecolare monoisotopic = Da 756.3997) e dell'angiotensina II (peso molecolare monoisotopic = Da 1,045.5423).
- Acquisire gli spettri di massa di campioni, prestando particolare attenzione a spettri di massa da 700 a 900 Da per il modulo spaccato dei substrati biotina.
- Identificare i picchi rilevati utilizzando la tabella 1. Rilevamento del peso molecolare appropriato indica fenditura al C-terminale dell'amminoacido pertinente.
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Representative Results
Valutazione del metodo per l'identificazione della specificità di proteasi di proteasi di modello
L'efficienza di questo sistema è stata valutata usando TPCK-tripsina e V8 proteasi, cui specificità del substrato sono state ottenute. TPCK-tripsina e V8 proteasi sono stati stimati a fendere la sequenza dell'amminoacido al C-terminale dei residui di lisina e arginina e sul lato di carboxy del acido aspartico e acido glutammico residui, rispettivamente. La tabella 1 Mostra il peso molecolare teorico del substrato e digerito frammenti spaccati da proteasi specifiche. Digestione di substrato utilizzando TPCK-tripsina prodotto frammenti fenduti, due delle quali potrebbe essere rilevato Da 839.81 e Da 796.76 (Figura 2A). I pesi molecolari di questi frammenti erano strettamente in linea con i pesi molecolari teorici dei frammenti spaccati da C-terminale di lisina e arginina, rispettivamente. Inoltre, la proteasi V8 convertito substrati precursore alla loro forma spaccato, con peso molecolare di Da 769.78 e Da 755.62 (Figura 2B), che ha trovato la teorica m/z di acido glutammico e acido aspartico, rispettivamente. Questi risultati indicano che questo metodo potrebbe essere utilizzato per identificare correttamente la specificità di proteasi con spettrometria di massa MALDI-TOF.
Valutazione della specificità di substrato a livelli di pH differenti utilizzando il polmone del topo estratti
Uno dei vantaggi di questa tecnica era che un gran numero di campioni possa essere elaborato contemporaneamente. Questo studio ha dimostrato che la specificità di substrato modificato secondo il livello di pH (Figura 3). In condizioni acide (Figura 3B; pH 5), il peso molecolare di un frammento fenduto era Da 770.13 e Da 826.66. Questi risultati hanno indicato che l'Estratto di tessuto polmonare contenuto proteasi con la capacità di fendere al C-terminale di acido glutammico e triptofano. Come il livello di pH è aumentato gradualmente, le cime di frammenti spaccati da acido glutammico e di triptofano è diminuito gradualmente, mentre picchi di frammenti spaccati di lisina e arginina gradualmente aumentato (Figura 3C, D; pH 7 e 9). Questi risultati hanno indicato che l'Estratto del polmone ha contenuto due o più proteasi che aveva diverse specificità ottimale di pH e scissione.
Figura 1: Schema per il rilevamento della specificità proteasi. (A) la struttura del substrato iminobiotin-etichettati per specificità di proteasi. (B) i substrati avevano iminobiotin, uno spaziatore di polietilene glicole e un sito spaccabili dell'amminoacido. (C) spettri di substrati iminobiotin-labeled. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: valutazione del metodo per determinare la specificità di proteasi utilizzando un enzima purificato. (A) gli spettri per iminobiotin-etichettati substrati trattati con TPCK-tripsina. Le cime 839.81 e 796.76 abbinati al peso molecolare teorico dei frammenti generati tramite fenditura nella parte C-terminale di lisina e arginina, rispettivamente. (B) gli spettri per iminobiotin-etichettati substrati trattati con V8 proteasi. Le cime 769.78 e 755.62 abbinati al peso molecolare teorico dei frammenti generati tramite fenditura nella parte C-terminale di acido glutammico e acido aspartico, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: valutazione del metodo per determinare la specificità di proteasi usando il tessuto estrae. Estrarre gli spettri per iminobiotin-etichettati substrati trattati con un tessuto polmonare. Questi spettri mostrano picchi ottenuti a (A) pH 3, (B) pH 5, (C) pH 7 e pH (D) 9. (E) iminobiotin-etichettati substrati incubati con l'Estratto di tessuto inattivato con trattamento termico per valutare la digestione non specifici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| X | Precursore | Modulo spaccato |
| G | 886.58 | 697.58 |
| A | 900.60 | 711.60 |
| S | 916.59 | 727.59 |
| P | 926.61 | 737.61 |
| V | 928.63 | 739.63 |
| T | 930.61 | 741.61 |
| C * | 1003.57 | 814.57 |
| Ho * | 1013.64 | 824.64 |
| L | 942.64 | 753.64 |
| N * | 1014.60 | 825.60 |
| D | 944.59 | 755.59 |
| Q | 957.62 | 768.62 |
| K * | 1028.65 | 839.65 |
| E | 958.60 | 769.60 |
| M * | 1031.60 | 842.60 |
| H | 966.62 | 777.62 |
| F | 976.63 | 787.63 |
| R | 985.66 | 796.66 |
| Y | 992.62 | 803.62 |
| W * | 1015.64 | 826.64 |
| *: Modulo D-Ser-Xaa | ||
Tabella 1: il peso molecolare teorico di substrati iminobiotin-con l'etichetta e il peso molecolare previsto di frammenti proteasi. Asterischi (*) indicano l'aggiunta della D-serina tra lo spaziatore di polietilene e l'aminoacido spaccabili.
| Xaa: Gly, Ala, Ser, Pro, Val, Thr, Leu, Asp, Gln, Glu, sua, Phe, Arg, Tyr | |||
| Fase | Fmoc-composto | ||
| 1 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 2 | Fmoc-Xaa-OH | ||
| 3 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 4 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 5 | Iminobiotin | ||
| Xaa: Cys, Ile, Asn, Lys, Met, Trp | |||
| Fase | Fmoc-composto | ||
| 1 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 2 | Fmoc-Xaa-OH | ||
| 3 | Fmoc-D-Ser (tBu)-OH | ||
| 4 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 5 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 6 | Iminobiotin | ||
Tabella 2: Elenco sequenziale di reagenti per la sintesi di substrato.
| pH | Composizione | ||
| 9 | 50 Tricine contenente 0,1 M NaCl e 10 mM CaCl2 | ||
| 7 | 50 mM Tris-HCl contenente 0,1 M NaCl e 10 mM CaCl2 | ||
| 5 | 50 millimetri di acetato di sodio contenente 0,1 M NaCl e 10 mM CaCl2 | ||
| 3 | acido citrico 50 mM contenente 0,1 M NaCl e 10 mM CaCl2 | ||
Tabella 3: Composizioni delle soluzioni tampone usate.
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Discussion
Questo protocollo utilizza la spettrometria di massa MALDI-TOF per identificare specificità di proteasi in campioni grezzi derivati da estratti di tessuto e facilmente può essere scalato per elaborazione di campione più. In particolare, abbiamo maneggiato pH per causare un cambiamento nella specificità di substrato.
Il metodo (ABC) complesso avidina-biotina, che è stato ampiamente usato in biochimica a causa della sua specificità di legame, è stato utilizzato nel nostro protocollo. A causa della forte affinità di ABC, l'associazione dell'avidina a biotina è quasi irreversibile. Purificazione di affinità per ABC è quindi altamente inefficiente. Per questo motivo, segnaliamo che il tasso di recupero per substrati di biotina dovrebbe essere basso. In questo studio, abbiamo usato solo un livello di pH basso per eluizione; Tuttavia, deglicosilata avidina-resina13 o monomerico avidina-resina14 può essere utilizzato anche per purificare la biotina substrati.
Il metodo proposto in questo studio possa essere regolato per diversi sistemi sperimentali e applicazioni; tenendo presente che lo spettrometro di massa MALDI-TOF è in grado di condurre analisi quantitativa. Una volta che è stata determinata la specificità di substrato, può essere preferibile eseguire quantificazione mediante analisi spettrometriche, analisi fluorometriche o fluorescenza Resonance Energy Transfer (FRET).
La calibrazione della spettrometria di massa è stato il passo più importante in questo protocollo. In casi dove vengono rilevati i substrati con pesi molecolari simili, la precisione dei risultati può essere migliorata aggiungendo il peso molecolare dei precursori.
Poiché la reazione enzimatica è migliorata con il tempo, è possibile estendere il tempo di reazione se l'enzima non viene rilevato. Tuttavia, lasciando che la reazione di continuare per più di 24 h provoca le reazioni collaterali che generano picchi indesiderati. Pertanto, è consigliabile effettuare la reazione per fino a 18 h o per controllare il test usando il calore trattato campioni. Questa procedura potrebbe determinare la specificità di proteasi a entro pochi femtomol di tripsina.
In conclusione, vi presentiamo un metodo pratico che utilizza iminobiotin-etichettati substrati per valutare la specificità della proteasi. Questo metodo consente l'elaborazione simultanea di più campioni e può essere utilizzato per semplificare la selezione della proteasi.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato in parte da Nihon farmaceutica University Research Grant da Nihon Pharmaceutical University (2016) e il JP17854179 di numero di MEXT KAKENHI Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl) aminomethyl]phenoxy resin) |
Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00102 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00185 | |
| piperidine | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00176 | |
| trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) | WAKO Chemical | 209-1483 | |
| O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00067 | |
| 1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00014 | |
| diisopropylethylamine (DIPEA) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00030 | |
| triisopropylsilane (TIS) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00170 | |
| ethanedithiol (EDT) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00057 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Millipore | S6612278 403 | |
| acetonitrile | Kokusan Chemical | 2153025 | |
| C18 cartridge column | Waters | WAT051910 | |
| poly(oxyethylene) octylphenyl ether | WAKO Chemical | 168-11805 | Triton X-100 |
| mixing homogenizer | Kinematica | PT3100 | polytron homogenizer |
| Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250 | Nakarai Chemical | 094-09 | |
| glycerol | Nakarai Chemical | 170-18 | |
| N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | WAKO Chemical | 043-07216 | |
| streptavidin sepharose | GE Healthcare | 17-511-01 | |
| ZipTipC18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | C2020 | |
| MALDI-TOF mass spectrometry | Bruker Daltonics, Germany | autoflex | |
| 2-iminobiotin | Sigma-Aldrich | I4632 | |
| Fmoc-amino acids | Watanabe Chemical Co., Ltd. |
References
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