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Artigo de método

Protocolo para transferência de MicroRNA na medula óssea-derivado hematopoiéticas células-tronco adultas para habilitar celular engenharia combinada com alvo magnético

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⸱

DOI:

10.3791/57474

⸱

18 de junho de 2018

 ,  ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty, Rostock University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo ilustra um procedimento seguro e eficiente para modificar CD133+ células-tronco hematopoiéticas. A apresentado não-virais, magnética polyplex abordagem pode fornecer uma base para a otimização dos efeitos terapêuticos células-tronco, bem como acompanhamento do produto celular administrado via ressonância magnética.

Resumo

Enquanto CD133+ células-tronco hematopoiéticas (SCs) tem sido comprovadas para fornecer alto potencial no campo da medicina regenerativa, suas taxas de retenção baixa após a injeção em tecidos feridos, bem como as taxas de mortalidade observadas células maciça levam a muito restrito de efeitos terapêuticos. Para superar essas limitações, nós procurou estabelecer um protocolo baseado em não-viral para engenharia celular adequada antes da sua administração. A modificação de CD133 humana+ expressar SCs usando os polyplexes magnético microRNA (miR) carregado foi abordada em relação a eficiência de absorção e de segurança, bem como o alvo potencial das células. Confiando em nosso protocolo, podemos conseguir taxas de absorção alta miR de 80-90%, enquanto o CD133+ Propriedades de células-tronco permanecem inalteradas. Além disso, essas células modificadas oferecem a opção de segmentação magnético. Descrevemos aqui um procedimento seguro e altamente eficiente para a modificação de CD133+ SCs. Esperamos que esta abordagem para fornecer uma tecnologia padrão para otimização dos efeitos terapêuticos de células estaminais e para acompanhamento do produto celular administrado através de ressonância magnética (MRI).

Introdução

CD133+ SCs representam uma população de célula de tronco e progenitoras heterogénea com promissor potencial para a medicina regenerativa. Sua diferenciação hematopoiéticas, endoteliais e miogênico potencial1,2,3 permite o CD133+ células, por exemplo, contribuir para processos de neovascularização através da modulação em recém formando vasos e ativação de pro-angiogênico sinalização parácrina mecanismos4,5,6,7.

Apesar de seu alto potencial demonstrado em ensaios clínicos aprovados mais de 30 (ClinicalTrails.gov), seu resultado terapêutico é ainda sob polêmica discussão4. Na verdade, uma aplicação clínica de SCs é dificultada pela baixa retenção no órgão de interesse e enorme pilha inicial morte5,8,9. Produção adicional de CD133+ transplante prévio de SCs ajudasse a superar esses desafios.

Um pré-requisito para uma terapia celular eficiente seria a redução da morte maciça de pilha inicial para melhorar a enxertia de células relevantes terapêutico10. Estudos atuais demonstraram uma perda imensa pilha de 90 – 99% em órgãos altamente perfundidos, como o cérebro e o coração durante as primeiras horas de 1 – 2, independente do tipo de células transplantadas ou aplicativo rota11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21. SC rotulagem usando nanopartículas magnéticas (MNPs) permite uma estratégia inovadora de não-invasivo para células-alvo para o site de interesse22,23,24,25,26 e simultaneamente permite que a célula de monitoramento usando MRI27 e partícula magnética (MPI) de imagem. O mais eficiente na vivo estudos aplicando magnetizada célula alvo de retenção célula usada após a administração local, em detrimento da orientação celular após injeção intravenosa23,24,28 . Portanto, o nosso grupo projetado um sistema de entrega consiste de nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético29. Com esta técnica, CD133+ SCs e células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) com eficiência poderiam ser alvo, como demonstrado em vitro tentativas de30,31.

Um outro obstáculo para terapias de SC é o ambiente hostil e inflamatório do tecido afetado após o transplante, o que contribui para a morte de pilha inicial32. Além de vários estudos de pré-condicionamento, a aplicação de terapêuticas miRs relevantes foi testado33; foi com sucesso demonstrado que anti-apoptotic miRs inibem a apoptose em vitro e realçam a enxertia de celular na vivo33. Estas pequenas moléculas, compostas por 20-25 nucleotides, desempenham um papel crucial como moduladores posttranscriptional de RNA mensageiro (mRNAs) e, portanto, afetam células estaminais destino e comportamento34. Além disso, a introdução exógena de miRs evitar a integração estável indesejada para o anfitrião do genoma34.

Atuais tentativas para introdução eficiente de ácidos nucleicos (NAs) em SCs primárias baseiam-se principalmente a vírus recombinante8,35. Apesar da eficiência elevada do transfection, manipulação de vírus recombinante apresenta um grande obstáculo para uma tradução de banco-de-cabeceira, por exemplo, expressão gênica incontrolável, patogenicidade, imunogenicidade e mutagênese insercional35 ,36. Portanto, sistemas de entrega não-virais como construções baseadas em polímero são fundamentais para desenvolver. Entre esses, o polyethylenimine (PEI) representa um veículo de entrega válido, oferecendo benefícios para miRs como condensação de ND para proteger da degradação, absorção celular, e liberação intracelular através de CDDP escapar37,38. Além disso, complexos de miR-PEI demonstraram uma alta biocompatibilidade em ensaios clínicos39. Portanto, nosso sistema de entrega consiste de um biotinilado ramificada 25 kDa PEI acoplado a um streptavidin-revestido MNP-núcleo30,31,40.

Neste manuscrito, apresentamos um protocolo abrangente descrevendo (i) o isolamento manual de CD133+ SC de doação de medula óssea humana (BM) com uma caracterização detalhada do produto SC e (ii) uma estratégia de transfeccao eficiente e suave de um sistema baseado em polímero magneticamente não-virais entrega por engenharia genética de CD133+ SCs usando miRs. CD133+ SCs são isoladas e magneticamente enriquecido de humanos aspirados BM esternais, usando uma superfície baseado em anticorpos magnético-ativado da pilha classificação sistema (MACS). Depois disso, a viabilidade celular, bem como a pureza de célula é analisada usando citometria de fluxo. Posteriormente, miR/PEI/MNP complexos são preparados e CD133+ SCs são transfectadas. 18 h após a transfeccao, a eficiência de absorção e o impacto do transfection na viabilidade de expressão e célula de marcador de SC são analisados. Além disso, avaliação da distribuição dos compostos complexos transfeccao intracelular é executada usando rotulagem quatro cores e iluminação estruturada microscopia (SIM).

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Protocolo

Esternal BM humana para isolamento de célula foi obtido de doadores informados, que deu o seu consentimento por escrito para usar suas amostras para pesquisa de acordo com a declaração de Helsinque. O Comité de ética da Universidade de Rostock aprovou o estudo apresentado (reg. n. º A 23 2010, prolongada em 2015).

1. preparação da pilha

Nota: Use heparina de sódio (250 UI/mL BM) para impedir a coagulação para exame de BM.

  1. CD133+ SC isolamento
    1. Preparação das soluções necessárias
      1. Preparar o soro de tampão fosfato (PBS) / ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) estoque solução (2mm) misturando 996 mL de 1X PBS com 4 mL de EDTA (0,5 M). Vigorosamente, misturar a solução e filtrar usando um filtro de 0,45 µm. Armazenar em temperatura ambiente (RT).
      2. Prepare o buffer de MACS misturando 995 mL de PBS/EDTA de 2 mM com 5 g de albumina de soro bovino (BSA). Vigorosamente, misturar a solução e filtrar usando um filtro de 0,45 µm. Loja a 4 ° C.
      3. Prepare solução colagenase B (40mg/mL), diluir 500 mg de colagenase B (do Clostridium histolyticum) em 12,5 mL de PBS. Misturar a solução vigorosamente, alíquotas de 350 µ l de fazer e armazenar a-20 ° C.
      4. Preparar a desoxirribonuclease (DNAse) armazeno (10 mg/mL) de solução diluindo-se 100 mg de DNase I (a partir de pâncreas bovino) em 10 mL de PBS. Misturar a solução vigorosamente, alíquotas de 350 µ l de fazer e armazenar a-20 ° C.
    2. Digestão enzimática de BM humana
      1. Pré-aquecer o meio de linfócitos humanos para RT e descongelar enzimas (1 alíquota cada de colagenase B e DNAse por 20 mL BM).
      2. Coletar o BM de seringas em um tubo cónico de 50 mL e misture delicadamente. Descarte qualquer coágulos existentes.
        Nota: Transferi 200 µ l de BM não diluído em um tubo de 1,5 mL para análise de subsequentes fluxo cytometric. Armazenar a 4 ° C até o uso.
      3. Transferir 10 mL BM para um novo tubo cónico de 50 mL, adicionar 6 mL de PBS/EDTA (2 mM), 20 mL de meio de linfócitos humanos, 175 µ l de colagenase B (40mg/mL) e 175 µ l de DNAse eu (10mg/mL). Delicadamente, misturar a solução e incube por 30 min em RT em uma coqueteleira. Repita para a amostra restante do BM.
    3. Centrifugação de gradiente de densidade
      1. Primeiro um tubo de centrifugação gradiente de densidade de 50 mL, aplicando-se 15 mL de linfócitos humanos, separando médio em um tubo de 50 mL. Centrifugar a 1.000 x g por 30 s.
      2. Cuidadosamente, camada 35 mL de diluídos BM em cima do filtro de tubo de centrifugação gradiente de densidade e centrifugar 445 x g por 35 min em RT
        Nota: As configurações de centrífuga são baixa aceleração (3) e sem freio (1).
      3. Retire cuidadosamente o tubo de centrífuga sem tremer. Cuidadosamente descarte ~ 20 mL da solução clara superior sem tocar a nublado camada diretamente sobre o filtro.
      4. Cuidadosamente, transferir a camada turva (que está diretamente em cima do filtro e contém as células mononucleares (MNCs)) para um novo tubo cónico de 50 mL e encher com PBS/EDTA até um volume final de 50 mL.
        Nota: Combine todas as multinacionais de uma amostra do paciente BM em um novo tubo.
      5. Conte as MNCs pela transferência de 10 µ l de suspensão de células de 50 mL para um tubo de 1,5 mL. Adicione 10 µ l de ácido acético a 3% com azul de metileno. Delicadamente, misture e aplique 10 µ l em uma câmara de contagem. Calcule o número de multinacionais.
      6. Centrifugar a suspensão de MNC x g durante 10 min. descartar o sobrenadante.
        Nota: Durante a centrifugação, arrefecer o centrifugador de RT para 4 ° C.
    4. Seleção magnética de CD133+ SCs humana CD133 partículas de dextran de ferro superparamagnético vinculados ao anticorpo
      Nota: Durante esta etapa, trabalha no gelo. Soluções de armazenamento até o uso em 4 ° C. Armazenar os MACS ímã permanente, colunas de separação e filtro de pré-separação a 4 ° C.
      1. Escolha o tamanho da coluna. Para < 1.2 x 108 MNCs, usar colunas de MS e para > 1.2 x 108 MNCs, usar colunas LS (veja a Tabela de materiais).
      2. Para preparar de seleção magnética para 1 x 108 celular total, cuidadosamente Resuspenda as multinacionais no buffer de MACS 300 µ l (4 ° C). Adicione 100 µ l reagente bloqueio de FcR (4 ° C) e 100 µ l CD133 vinculados ao anticorpo superparamagnético ferro dextrano partículas (4 ° C).
      3. Delicadamente misture a suspensão de eritrócitos e incube por 30 min a 4 ° C. Agite a suspensão de eritrócitos durante a incubação (2 – 3. x).
      4. Adicionar 2 mL de tampão de MACS (4 ° C) por 10 x 18 total que MNCs. Misture suavemente a suspensão de células e centrifugar x g por 10 min a 4 ° C.
      5. Configurar o titular do ímã de MACS e anexar o ímã permanente de MACS. Instalar a coluna de MACS e aplicar o filtro de pré-separação em cima.
      6. Equilibrar a primeira coluna de MACS MS/LS e filtro de pré-separação com 0,5 mL (MS) ou 3 mL (LS) de buffer de MACS (4 ° C).
        Nota: Nunca permita que as colunas de MACS secar depois de equilibração.
      7. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o obtidos em 500 µ l de tampão de MACS (4 ° C) por 1 x 108 montante de célula total. Aplica a suspensão de células para o filtro de pré-separação.
      8. Lavar o filtro de coluna e pré-separação de MACS usando três vezes, para cada lavagem, 0,5 mL (MS) ou 3 mL (LS) de MACS buffer (4 ° C).
        Nota: Durante a terceira etapa de lavagem, instalar uma segunda coluna de MACS para o ímã permanente de MACS e equilibrar a segunda coluna de MACS MS/LS com 0,5 mL (MS) ou 3 mL (LS) MACS buffer (4 ° C).
      9. Descarte o filtro de pré-separação.
      10. Eluir a fração de célula diretamente sobre a segunda coluna de MACS: adicionar 1 mL (MS) ou 5 mL (LS) MACS buffer (4 ° C) para a primeira coluna de MACS e remover a coluna de MACS do ímã permanente de MACS. Imediatamente transferir a primeira coluna de MACS acima da segunda coluna de MACS e empurre a suspensão de eritrócitos através da coluna de MACS usando o êmbolo fornecido.
      11. Lavar a coluna de MACS três vezes, usando para cada lavagem 0,5 mL (MS) ou 3 mL (LS) MACS de buffer (4 ° C).
      12. Eluir a fração de célula da coluna, adicionando 1 mL (MS) ou 5 mL (LS) MACS buffer (4 ° C) para a segunda coluna de MACS e retirar o ímã permanente de MACS a coluna de MACS. Imediatamente transferir a segunda coluna de MACS acima de um tubo de 1,5 mL (MS) ou tubo cônico de 15 mL (LS) e empurre a suspensão de eritrócitos através da coluna de MACS usando o êmbolo fornecido.
      13. Centrifugação a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Cuidadosamente, desprezar o sobrenadante e ressuspender o obtidos em 100 µ l de tampão de MACS (4 ° C).
      14. Contar o CD133+ células: transferência 6 µ l de suspensão de células para um tubo de 1,5 mL. Adicione a solução de azul de trypan 6 µ l (0,4%). Delicadamente, misture e aplique 10 µ l em uma câmara de contagem. Calcular o número de CD133+ células.
      15. Armazenar o CD133+ células no gelo até a semeadura.
  2. Caracterização de isolados recentemente CD133+ SCs
    Nota: O seguinte trabalho deve ser efectuado num quarto protegido da luz brilhante (fraca iluminação apenas). Manter os tubos, buffers e anticorpos no gelo, salvo indicação em contrário.
    1. Preparação das SCs para análise de fluxo cytometric
      1. Use duas amostras (cada 10 µ l) de alíquotas BM e uma amostra de recém isolado CD133+ SCs (mínimo, 1 x 104 células) para análise. Transferi as células para um tubo de 1,5 mL. Adicionar 10 µ l de FcR bloqueando o reagente e encher com buffer de MACS (4 ° C) para um volume de 33 µ l.
      2. Adicionar os seguintes anticorpos para o lado interno das respectivas do tubo (ver tabela 1): isotiocianato de anti-CD34-fluoresceína (FITC) (clone: AC136), anti-CD133/2-ficoeritrina (PE) (clone: 293 3), isotipo controle do mouse IgG 2b-PE, anti-CD45-allophycocyanin (APC)-H7 (clone: 2D 1) e 7-aminoactinomycin (AAD). Depois que todos os anticorpos foram adicionados, chacoalhar o lado de anticorpos do tubo. Delicadamente, misturar a solução (volume final de 50 μL) e incubar durante 10 minutos a 4 ° C.
      3. Adicionar 1 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC) x 1, delicadamente misturar a suspensão e incubar no gelo 10 min. centrifugar a suspensão de 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
      4. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o obtidos em 100 µ l PBS (4 ° C). Armazenar no gelo até a análise de fluxo cytometric.
    2. Fluxo cytometric análise de CD133+ SCs
      1. Para examinar a viabilidade celular e pureza de CD133+ SC, usar um adaptado da sociedade internacional de Hematotherapy e de estratégia associada de enxerto engenharia (ISHAGE) fluxo cytometry41 (veja a descrição representativa na Figura 1). Use a seguinte ordem:
        Passo 1: seleção da população celular (figura 1A)
        Passo 2: seleção de CD45+ células (figura 1B)
        Etapa 3: seleção de CD45 viável+ células (Figura 1)
        Passo 4: seleção de CD45 viável+/CD34+ células (Figura 1)
        Passo 5: seleção de CD45 viável+/CD34+/CD133+ células (Figura 1E)
        Executar o citômetro de fluxo (ver Tabela de materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
      2. Calcule a viabilidade celular e pureza utilizando as seguintes equações:

figure-protocol-1   Equação 1

figure-protocol-2   Equação 2

  1. Cultura de CD133 recentemente isolados de células+ SCs
    1. Alíquota 100x citocina humana recombinante complementar em 100 alíquotas µ l e armazenar a-20 ° C. Descongelar uma alíquota de 100 x antes da preparação média.
    2. Preparar o CD133+ SC cultura médio, suplementado com suplemento de citocina humana recombinante (final 1 x) e 1% penicilina/estreptomicina expansão células hematopoiéticas isento de soro.
    3. Semente de 5 x 104 recentemente isolado CD133+ SCs para transfeccao em uma placa com meio de cultura 500 µ l de 24. Incube as celulas em 37 ° C, 5% de CO2 e de 20% O2.
      Nota: Semente 5 x 104 recentemente isolado CD133+ SCs como um controle para análise de fluxo cytometric.

2. preparação de transfeccao complexos

Nota: Durante este passo, manter a ribonuclease de espaço de trabalho inteiro (RNAse)-livre usando solução de descontaminação de RNAse e usar apenas material consumível RNAse-livre.

  1. Preparação de miR
    Nota: O seguinte trabalho deve ser efectuado num quarto protegido da luz brilhante (fraca iluminação apenas).
    Nota: para a miR-amostra: uso da cianina 3 tingir etiquetados miR precursor e miR precursor sem rótulo.
    1. Para preparar a solução-mãe de miR (50 µM), dilua a quantidade desejada de miR no volume adequado de água livre de nuclease (por exemplo, diluir 5 nmol de miR em 100 água µ l). Delicadamente misturar a solução, alíquota o estoque de miR (5 µ l) e armazenar abaixo de-20 ° C.
  2. Preparação do PEI
    1. Prepare o PEI seguindo protocolos padrão e nota o PEI concentração estoque31,42 .
  3. Preparação de MNP
    1. Preparar os MNPs seguindo protocolos padrão e observe a concentração das ações de MNP31,42.
  4. Preparação de complexos da miR/PEI
    1. Preparar a solução de glicose 5% diluindo D-(+)-glicose em água livre de nuclease. Delicadamente misturar a solução, alíquota o estoque (1,5 mL) e armazenar a 4 ° C.
      Nota: O seguinte trabalho deve ser efectuado num quarto protegido da luz brilhante (fraca iluminação apenas).
    2. Use 20 pmol miR por alvéolo de uma placa 2430. Dilua a miR em solução de glicose a 5% para uma concentração final de 0,25 pmol miR / µ l.
    3. Calcular a quantidade de PEI necessário baseado na quantidade de miR (20 pmol, passo 2.3.1) e ideal azoto (PEI) de fosfato (de miR) ratio (N/P) com base na concentração das ações PEI (passo 2.2.1; aqui, utilizou-se uma proporção de 7,5)30. Dilua o PEI em uma quantidade igual de solução de glicose 5% com base na equação:
      figure-protocol-3
      que reorganiza a
      figure-protocol-4    Equação 3
      onde o volume de PEI está em µ l e [PEI] está em mM e N/P (otimizado para este protocolo) é de 0,75. 0.12 é um fator de conversão específico à miR.
    4. Adicionar o PEI pré-diluídos nas miR pré-diluídos e vórtice por 30 s.
    5. Incubar o miR/PEI complexo durante 30 min à RT
  5. Preparação dos complexos miR/PEI/MNP
    Nota: O seguinte trabalho deve ser efectuado num quarto protegido da luz brilhante (fraca iluminação apenas).
    1. Ao mesmo tempo incubando os complexos de miR/PEI, prepare os MNPs sonicating os MNPs por 20 min a 35 kHz o banho de água sonicating a RT para garantir as partículas em suspensão e não agregando.
    2. Calcule o número de MNPs exigidos (ferro de 3 µ g/mL) com base na solução-mãe MNP (passo 2.3.1).
    3. Adicionar os MNPs lisados nas complexos miR/PEI e vórtice por 30 s. Incubar os complexos de miR/PEI/MNP por 30 min em RT
  6. Preparação dos complexos para transfeccao rotulagem quatro cores usando SIM
    Nota: Use miR precursor sem rótulo.
    1. Rotular a miR com cianina 5 tintura usando uma tintura de cianina 5 miR rotulagem kit (veja a Tabela de materiais) seguindo as instruções do fabricante. Medir a concentração de miR final utilizando o espectrofotômetro listado (ver Tabela de materiais) de acordo com a pre-configuração fornecida pelo fabricante (ácidos nucleicos, RNA-40). Alíquota que do miR (5 µ l) e loja a-80 ° C, protegidos da luz.
    2. Rotular o PEI com um corante de fluorescência verde brilhante usando uma rotulagem adequada proteína kit (veja a Tabela de materiais) seguindo as instruções do fabricante. Defina a concentração final de PEI usando o ensaio de ninidrina (etapa 2.2.1). Alíquota do PEI (no volume calculado com base na equação 3) e armazenar a 4 ° C, protegido da luz.
    3. Rotular os MNPs com rodamina tintura conjugada com biotina usando uma relação de 1:1,000 w/w, tintura de MNP. Misture o corante rodamina e MNPs concomitantemente com a preparação da formação complexa miR/PEI e incube a solução por 30 min no escuro. Use diretamente MNPs rotuladas.

3. a transfeccao de CD133+ SCs

Nota: Durante este passo, manter a ribonuclease de espaço de trabalho inteiro (RNAse)-livre usando solução de descontaminação de RNAse e usar apenas material consumível RNAse-livre
Nota: O seguinte trabalho deve ser efectuado num quarto protegido da luz brilhante (fraca iluminação apenas).

  1. Adicionar o preparado miRNA/PEI/MNP complexo gota a gota diretamente no poço apropriado contendo o CD133 recém isoladas+ SCs em meio de cultura.
  2. Misture delicadamente agite-a placa e para trás. Incube as celulas por 18 h a 37 ° C, 5% de CO2 e de 20% O2.

4. análise da miR Transfection

  1. Análise da eficiência de absorção a miR e a citotoxicidade dos complexos de transfeccao
    Nota: para o miR-espécime: usar tintura de cianina 3 rotulada miR precursor para a avaliação da absorção e não transfectadas CD133+ SCs para os portões de controle de citometria de fluxo.
    Nota: O seguinte trabalho deve ser efectuado num quarto protegido da luz brilhante (fraca iluminação apenas).
    Nota: Manter os tubos, buffers e anticorpos no gelo, salvo indicação em contrário.
    1. Preparar a solução de paraformaldeído (PFA, 4%) diluindo 4G PFA em 100 mL de PBS e aquecimento da solução a 80 ° C. Vigorosamente, misturar a solução e ajustar o valor de pH de 7,3. Alíquota da PFA estoque (1,5 mL) e armazenar a-20 ° C.
    2. 18 h após a transfeccao, recolher cada poço em um separado 1,5 mL do tubo. Lave bem uma vez com 500 µ l de PBS e transferir esta suspensão de células para o mesmo tubo.
    3. Centrifugação a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o obtidos em 100 µ l de tampão de MACS de 4 ° C.
    4. Adicionar 0,5 µ l de um corante reativo de amina para distinguir entre células vivas e mortas, delicadamente misturar a suspensão e incubar durante 10 minutos a 4 ° C. Adicionar 1 mL PBS (4 ° C) e centrifugar a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
    5. Desprezar o sobrenadante, resuspenda o pellet Obtido em 100 µ l PBS, adicionar 33 µ l PFA (4%) e armazenar no gelo ou a 4 ° C até análise de fluxo cytometric.
    6. Organize a estratégia associada de acordo com a representação representante na Figura 2. Executar os exemplos sobre o citômetro de fluxo (ver Tabela de materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
  2. Caracterização do CD133 miR-transfectadas+ SCs
    Nota: Usado miR precursor sem rótulo, bem como não-transfectadas CD133+ SCs para portões de controle de citometria de fluxo.
    1. Recolher cada um bem em um tubo separado 1,5 mL e centrifugar a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
    2. Use a estratégia associada conforme descrito na etapa 1.2.
  3. Exame da distribuição intracelular de complexos de transfeccao pelo SIM
    1. Preparar os complexos e transfect as células conforme descrito na seção 2 e na secção 3.
    2. 18 h após o transfeccao, recolher cada poço em um separado 1,5 mL do tubo. Lave bem uma vez com 500 µ l de PBS e transferir a lavagem no respectivo tubo do poço. Centrifugação a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
    3. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado obtido em 1 mL de 2% de soro fetal bovino (FBS) em PBS, delicadamente misturar a suspensão e centrifugar a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
    4. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o obtidos em 100 µ l de PBS adicionar 33 µ l PFA (4%) por 20 min.
    5. Transferir a suspensão de células em uma nova placa de 24-cultura contendo as lamelas de vidro estéril e centrifugar x g por 10 min a 4 ° C.
    6. Desprezar o sobrenadante e adicionar 500 µ l de PBS. Homogeneizar a placa e descartar a PBS.
    7. Coloque as preparado lamelas microscópicos slides usando o meio de montagem aquoso para preservar a fluorescência e secá-los no RT pelo menos 1 h.
    8. Adquira imagens usando um objectivo de imersão de óleo X 100. Configurações de SIM: 405, 488, 561 e 633 nm laser linhas para excitação e z-pilhas com uma profundidade de 16 bits em 3 ângulos, 3 fases, com uma média de 4, grades por linha de laser: 23 µm – 405, 34 µm – 488, 42 µm-561, 51 µm-633.

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Resultados

O protocolo apresentado descreve um isolamento manual e magnético enriquecimento do humano BM-derivado CD133+ SCs com uma célula independente de vírus subsequentes engenharia estratégia, como uma tecnologia não-invasiva para manipulação de células em vitro e em vivo ferramenta de monitoramento.

Esta tecnologia de isolamento de três etapas permite uma separação de multinacionais de BM esternal pré-dig...

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Discussão

Nos últimos anos, CD133+ SCs surgiram como uma população celular promissor para terapias baseadas em SC, como evidenciado por vários fase I, II e III ensaios clínicos43,44,,45,46, 47 , 48 , 49 , 50 , 51 ,

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Divulgações

Os autores declaram não haverá conflito de interesses.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo Ministério Federal da educação e pesquisa Alemanha (FKZ 0312138A e FKZ 316159), o estado Mecklemburgo-Pomerânia Ocidental com fundos estruturais (FSE/IVWM-B34-0030/10 e FSE/IVBM-B35-0010/12) e a DFG (DA1296/2-1), o Fundação coração alemão (F/01/12), o BMBF (VIP + 00240) e a Fundação úmida. Além disso, F.H. e P.M. são suportados pelo Forum programa de Rostock University centro médico (889001).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
7-AADBD Biosciences559925
Ácido Acético com Azul de MetilenoStemcell Technologies70603%
anti-CD133/2-PE (clone: 293C3)Miltenyi Biotec GmbH130-090-853
anti-CD34-FITC (clone: AC136)Miltenyi Biotec GmbH130-081-001
anti-CD45-APC-H7 (clone: 2D1)BD Biosciences
corante de rodamina; Atto 565 corante conjugado à biotinaATTO-TEC GmbHAD 565-71
BD FACS LSRII citômetro de fluxoBD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2BD Biosciences
BSASigma-Aldrich GmbHA7906
CD133 partículas superparamagnéticas de ferro dextrano ligadas a anticorpos; CD133 MicroBead KitMiltenyi Biotec GmbH130-097-049
colagenase BRoche Diagnostics GmbH11088831001
câmara de contagemPaul Marienfeld GmbH & Co. KG
Cianina 3 corante marcado como precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Controle Negativo #1AmbionAM17120
Cyanine 5 kit de rotulagem de corante miR; Kit de rotulagem de miRNA de TI de etiqueta de corante Cy5Mirus BioMIR 9650
DNAse IRoche Diagnostics GmbH10104159001(100 U/mL)
ELYRA PS.1 LSM 780 microscópio confocalCarl Zeiss Jena GmbH
FcR Reagente de bloqueio, humanoMiltenyi Biotec GmbH130-059-901
kit de rotulagem de proteína verde brilhante; Kit de Rotulagem de Proteínas Oregon Green 488Thermo Fisher ScientificO10241
meio de montagem aquoso; FluoroshieldSigma-Aldrich GmbHF6182
tubo de centrifugação de gradiente de densidade; Tubo de Centrífuga LeukosepGreiner Bio-One89048-932
Suporte magnético MACS; MACS MultiStandMiltenyi Biotec GmbH130-042-303
Filtro de pré-separação MACSMiltenyi Biotec GmbH130-041-40730 µ m
Coluna de separação MACS (MS / LS)Miltenyi Biotec GmbH130-042-201 / 130-042-401
Ímã permanente MACS; Separador MACSMiltenyi Biotec GmbH130-042-302
Millex-HV PVDF FiltroMerckSLHV013SL0,45 μ m
camundongo IgG 2b-PEMiltenyi Biotec GmbH130-092-215
corante reativo de amina; Kit de Coloração de Células Mortas Corrigíveis Near-IR LIVE/DEADThermo Fisher ScientificL10119
meio de separação de linfócitos humanos; PancollPan Biotech GmbHP04-60500densidade: 1,077 g/mL
PBSPan Biotech GmbHP04-53500sem Ca e Mg
PEISigma-Aldrich GmbH408727ramificado; 25 kDa
Penicilina/EstreptomicinaThermo Fisher Scientific15140122100 U/mL, 100 μ g/mL
PFAMerck Schuchardt OHG1040051000
precursor miR não marcado; Controle Negativo do Precursor de miRNA Pré-miR #1TampãoAmbion AM17110
eBioscience00-4333-57
Solução de descontaminação de RNAse; RNaseZapThermo Fisher ScientificAM9780
meio linfócito humano; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 médioPan Biotech GmbHP04-16500
suplemento de citocina humana recombinante; StemSpan CC100Stemcell Technologies2690
meio de expansão de células hematopoiéticas sem soro; StemSpan H3000Stemcell Technologies9800
Estreptavidin MagneSphere Partículas ParamagnéticasPromega CorporationZ5481
Solução Trypan BlueSigma-Aldrich GmbHT81540,4 %
UltraPure EDTAThermo Fisher Scientific155750200,5 M; pH 8,0
ZEN2011 softwareCarl Zeiss Jena GmbH
NanoDrop 1000 EspectrofotômetroThermo Fisher Scientific
Sonorex RK 100 SH sonicação banho-mariaBandelin eletrônicoUltrassônico saída nominal: 80 W; Frequência ultrassônica: 35 kHz
560178 de lise de hemácias

Referências

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