Este protocolo ilustra um procedimento seguro e eficiente para modificar CD133+ células-tronco hematopoiéticas. A apresentado não-virais, magnética polyplex abordagem pode fornecer uma base para a otimização dos efeitos terapêuticos células-tronco, bem como acompanhamento do produto celular administrado via ressonância magnética.
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Artigo de método
Protocolo para transferência de MicroRNA na medula óssea-derivado hematopoiéticas células-tronco adultas para habilitar celular engenharia combinada com alvo magnético
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Enquanto CD133+ células-tronco hematopoiéticas (SCs) tem sido comprovadas para fornecer alto potencial no campo da medicina regenerativa, suas taxas de retenção baixa após a injeção em tecidos feridos, bem como as taxas de mortalidade observadas células maciça levam a muito restrito de efeitos terapêuticos. Para superar essas limitações, nós procurou estabelecer um protocolo baseado em não-viral para engenharia celular adequada antes da sua administração. A modificação de CD133 humana+ expressar SCs usando os polyplexes magnético microRNA (miR) carregado foi abordada em relação a eficiência de absorção e de segurança, bem como o alvo potencial das células. Confiando em nosso protocolo, podemos conseguir taxas de absorção alta miR de 80-90%, enquanto o CD133+ Propriedades de células-tronco permanecem inalteradas. Além disso, essas células modificadas oferecem a opção de segmentação magnético. Descrevemos aqui um procedimento seguro e altamente eficiente para a modificação de CD133+ SCs. Esperamos que esta abordagem para fornecer uma tecnologia padrão para otimização dos efeitos terapêuticos de células estaminais e para acompanhamento do produto celular administrado através de ressonância magnética (MRI).
Introdução
CD133+ SCs representam uma população de célula de tronco e progenitoras heterogénea com promissor potencial para a medicina regenerativa. Sua diferenciação hematopoiéticas, endoteliais e miogênico potencial1,2,3 permite o CD133+ células, por exemplo, contribuir para processos de neovascularização através da modulação em recém formando vasos e ativação de pro-angiogênico sinalização parácrina mecanismos4,5,6,7.
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Protocolo
Esternal BM humana para isolamento de célula foi obtido de doadores informados, que deu o seu consentimento por escrito para usar suas amostras para pesquisa de acordo com a declaração de Helsinque. O Comité de ética da Universidade de Rostock aprovou o estudo apresentado (reg. n. º A 23 2010, prolongada em 2015).
1. preparação da pilha
Nota: Use heparina de sódio (250 UI/mL BM) para impedir a coagulação para exame de BM.
- CD133+ SC isolamento
- Preparação das soluções necessárias
- Preparar o soro de tampão fosfato (PBS) / ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) ....
- Preparação das soluções necessárias
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Resultados
O protocolo apresentado descreve um isolamento manual e magnético enriquecimento do humano BM-derivado CD133+ SCs com uma célula independente de vírus subsequentes engenharia estratégia, como uma tecnologia não-invasiva para manipulação de células em vitro e em vivo ferramenta de monitoramento.
Esta tecnologia de isolamento de três etapas permite uma separação de multinacionais de BM esternal pré-dig.......
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Discussão
Nos últimos anos, CD133+ SCs surgiram como uma população celular promissor para terapias baseadas em SC, como evidenciado por vários fase I, II e III ensaios clínicos43,44,,45,46, 47 , 48 , 49 , 50 , 51 ,
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Divulgações
Os autores declaram não haverá conflito de interesses.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo Ministério Federal da educação e pesquisa Alemanha (FKZ 0312138A e FKZ 316159), o estado Mecklemburgo-Pomerânia Ocidental com fundos estruturais (FSE/IVWM-B34-0030/10 e FSE/IVBM-B35-0010/12) e a DFG (DA1296/2-1), o Fundação coração alemão (F/01/12), o BMBF (VIP + 00240) e a Fundação úmida. Além disso, F.H. e P.M. são suportados pelo Forum programa de Rostock University centro médico (889001).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Ácido Acético com Azul de Metileno | Stemcell Technologies | 7060 | 3% |
| anti-CD133/2-PE (clone: 293C3) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-853 | |
| anti-CD34-FITC (clone: AC136) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-081-001 | |
| anti-CD45-APC-H7 (clone: 2D1) | BD Biosciences | ||
| corante de rodamina; Atto 565 corante conjugado à biotina | ATTO-TEC GmbH | AD 565-71 | |
| BD FACS LSRII citômetro de fluxo | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva Software 6.1.2 | BD Biosciences | ||
| BSA | Sigma-Aldrich GmbH | A7906 | |
| CD133 partículas superparamagnéticas de ferro dextrano ligadas a anticorpos; CD133 MicroBead Kit | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-049 | |
| colagenase B | Roche Diagnostics GmbH | 11088831001 | |
| câmara de contagem | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | ||
| Cianina 3 corante marcado como precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Controle Negativo #1 | Ambion | AM17120 | |
| Cyanine 5 kit de rotulagem de corante miR; Kit de rotulagem de miRNA de TI de etiqueta de corante Cy5 | Mirus Bio | MIR 9650 | |
| DNAse I | Roche Diagnostics GmbH | 10104159001 | (100 U/mL) |
| ELYRA PS.1 LSM 780 microscópio confocal | Carl Zeiss Jena GmbH | ||
| FcR Reagente de bloqueio, humano | Miltenyi Biotec GmbH | 130-059-901 | |
| kit de rotulagem de proteína verde brilhante; Kit de Rotulagem de Proteínas Oregon Green 488 | Thermo Fisher Scientific | O10241 | |
| meio de montagem aquoso; Fluoroshield | Sigma-Aldrich GmbH | F6182 | |
| tubo de centrifugação de gradiente de densidade; Tubo de Centrífuga Leukosep | Greiner Bio-One | 89048-932 | |
| Suporte magnético MACS; MACS MultiStand | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-303 | |
| Filtro de pré-separação MACS | Miltenyi Biotec GmbH | 130-041-407 | 30 µ m |
| Coluna de separação MACS (MS / LS) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-201 / 130-042-401 | |
| Ímã permanente MACS; Separador MACS | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-302 | |
| Millex-HV PVDF Filtro | Merck | SLHV013SL | 0,45 μ m |
| camundongo IgG 2b-PE | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-215 | |
| corante reativo de amina; Kit de Coloração de Células Mortas Corrigíveis Near-IR LIVE/DEAD | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
| meio de separação de linfócitos humanos; Pancoll | Pan Biotech GmbH | P04-60500 | densidade: 1,077 g/mL |
| PBS | Pan Biotech GmbH | P04-53500 | sem Ca e Mg |
| PEI | Sigma-Aldrich GmbH | 408727 | ramificado; 25 kDa |
| Penicilina/Estreptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/mL, 100 μ g/mL |
| PFA | Merck Schuchardt OHG | 1040051000 | |
| precursor miR não marcado; Controle Negativo do Precursor de miRNA Pré-miR #1 | Tampão | Ambion AM17110 | |
| eBioscience | 00-4333-57 | ||
| Solução de descontaminação de RNAse; RNaseZap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| meio linfócito humano; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 médio | Pan Biotech GmbH | P04-16500 | |
| suplemento de citocina humana recombinante; StemSpan CC100 | Stemcell Technologies | 2690 | |
| meio de expansão de células hematopoiéticas sem soro; StemSpan H3000 | Stemcell Technologies | 9800 | |
| Estreptavidin MagneSphere Partículas Paramagnéticas | Promega Corporation | Z5481 | |
| Solução Trypan Blue | Sigma-Aldrich GmbH | T8154 | 0,4 % |
| UltraPure EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | 0,5 M; pH 8,0 |
| ZEN2011 software | Carl Zeiss Jena GmbH | ||
| NanoDrop 1000 Espectrofotômetro | Thermo Fisher Scientific | ||
| Sonorex RK 100 SH sonicação banho-maria | Bandelin eletrônico | Ultrassônico saída nominal: 80 W; Frequência ultrassônica: 35 kHz |
Referências
- Meregalli, M., Farini, A., Belicchi, M., Torrente, Y. CD133(+) cells isolated from various sources and their role in future clinical perspectives. Expert opinion on biological therapy. 10 (11), 1521-1528 (2010).
- Lee, S., Yoon, Y. -S.
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Reimpressões e permissões
