Artigo de método

Uso de anticorpos Antifosfo-girdin Visualizar células intestinais topete no Mouse flutuante Jejunum Cryosections

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DOI:

10.3791/57475

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21 de março de 2018

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1Division of Perinatology, Institute for Developmental Research, Aichi Human Service Center, 2Surgery Department, Anjo Kosei Hospital, 3Department of Pathology, Nagoya University Graduate School of Medicine

Neste artigo

Resumo

Kuga et al descobriram que anticorpos específicos de fosforilação-estatuto contra a ligação actina proteína girdin fosforilado em tirosina 1798 (pY1798) podem ser usados para rotular o topete células (TCs). Este protocolo permite visualização robusta de SCT usando coloração imunofluorescente de jejuno flutuantes cryosections com anticorpos pY1798.

Resumo

A proteína de ligação de actina girdin é uma proteína citosólica que é necessária para actina remodelação para acionar a migração celular em vários tecidos. Girdin é fosforilado por quinases não receptores tirosina a tirosina 1798 e do receptor. Omori et al . desenvolvido site - e fosforilação estatuto anticorpos específicos contra a girdin humana em tirosina-1798 (pY1798), que se ligam especificamente a tirosina fosforilada-1798, mas não a tirosina-1798 unphosphorylated. pY1798 anticorpos têm sido utilizados para rotular especificamente células de topete (TCs) que estão presentes em tecidos gastrointestinais dos mamíferos, mas desconhece-se a função dessas células. Este protocolo permite a visualização robusta da TCs no jejuno utilizando imunofluorescência e anticorpos pY1798. Para garantir a visualização de TC simples e bem sucedida, este protocolo inclui duas técnicas histológicas: produção de cryosections flutuante de tecido cheio de gelatina jejuno e recuperação de baixa temperatura do antígeno a 50 ° C por 3 h. enchimento do jejuno com gelatina mantém a forma das seções flutuantes durante todo o processo de coloração, Considerando que a recuperação do antígeno de baixa temperatura garante sinais robustos de uso bem sucedido do presente protocolo resulta em pY1798 dos TCs distribuídos da ponta das vilosidades à coloração TCs. cripta. TCs manchadas tem uma soma em forma de carretel e sinais fluorescentes condensam na ponta lumenal, que corresponde o 'topete' saliente. Faloidina coloração colocalized com pY1798-positivo TCs na fronteira escova espessada e corresponde a uma massa de radicelas, estendendo-se desde o topete de TC. Este protocolo pode ser usado para examinar o TCs em biópsia humana amostras coletadas com endoscópios gastrointestinais. Além disso, TCs recentemente foram relatados para acumular após infecção do parasita em ratos, sugerindo que este protocolo pode ter aplicações para o diagnóstico das infecções do parasita no intestino humano.

Introdução

Células de topete (TCs) são menores componentes dispersos de epitélios gastrointestinais que caracterizam-se por tufos apicais e somas em forma de carretel1. Embora TCs foram descrito pela primeira vez em 19562, função TC permanece obscura, em parte devido à falta de marcadores confiáveis de TC.

Et al . Enomoto primeiro caracterizada a proteína de ligação de actina girdin3, que é expressa no sistema nervoso, bem como nos tecidos não-neurais, tais como vasos sanguíneos, válvulas cardíacas, tendões e músculo esquelético4. Ratos com ablação genética de girdin exibem atraso de crescimento e vários cérebro anomalias4,5,6. Enquanto isso, perda-de-função mutação no girdin humano está associada com encefalopatia progressiva, retardo grave e precoce de crises epilépticas início7.

Em 2011, Lin et al identificaram dinâmica fosforilação de girdin em tirosina 1798 mediada pela quinase de tirosina como EGFR e Src8. Eles também mostraram que girdin fosforilada é necessária para a remodelação da actina para acionar a célula migração8. Et al . Omori desenvolvido site - e fosforilação estatuto específico anticorpos contra girdin humana fosforilado em tirosina 1798 (anticorpos pY1798) seguindo o protocolo do Goto e validados os anticorpos usando o mutagenesis local-dirigido de expressão vetores escriturada completos girdin9,10. Em 2017, Kuga et al relatou que pY1798 rotula TCs com alta especificidade e sensibilidade alta1. Os anticorpos pY1798 foram mostrados para ser superior ao anteriores marcadores de TC, com base nas propriedades de coloração excelentes que revelou a forma da célula inteira, incluindo a característica 'topete' na ponta lumenal, ainda o papel biológico de girdin e fosfo-girdin em TC função permaneceu incerto1.

O método descrito neste estudo envolve a mancha, uma técnica histológica para marcar uma proteína específica no tecido, usando um anticorpo primário contra uma proteína do alvo e um anticorpo secundário conjugado fluorescência contra o principal anticorpo. A finalidade desse método é permitir que os investigadores com experiência limitada histológica obter imagens de TC de alta qualidade. Este protocolo usa cryosections flutuantes que evite a necessidade de cryosections slide-montado, ou seção de parafina. No entanto, seções flutuantes são frágeis devido à ausência de apoio de uma lâmina de vidro e a espessura de corte pode diminuir a permeabilidade do anticorpo. Este protocolo inclui duas abordagens que superam estas questões: 1) preenchendo o lúmen do jejuno inteiro com gelatina para preservar a morfologia das seções flutuantes durante os procedimentos de coloração e 2) uso de recuperação de antígeno de baixa temperatura para intensificar os sinais de pY1798.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de utilização do Instituto para a investigação do desenvolvimento, centro de serviços humanos de Aichi e cuidado Animal (número do pedido: M-03).

1. preparações

  1. Prepare-se 10 L de soro de tampão fosfato (PBS): 32,27 g de Na2HPO4·12H2O, 4,5 g de NaH2PO4·2H2O, 80,0 g de NaCl adicionado à água ultrapura para um volume final de 10 L. loja solução, à temperatura ambiente (RT).
  2. Prepare 200 mL de PBS-t: 200 mL de PBS da etapa 1.1 com 100 µ l de polyoxyethylene(10) octilfenil éter para uma concentração final de 0,05% (vol: Vol). Loja em RT.
  3. Enquanto usava luvas e óculos de proteção, preparar 50 mL de 15% de sacarose em solução de formol neutro a 10% tamponada: 7,5 g de sacarose adicionada a 10% tamponada solução formalina neutra (Tabela de materiais) para um volume final de 50 mL. Loja em RT.
    Cuidado: Inalação e/ou pele/olho contato com formaldeído em solução de formol neutro a 10% tamponada pode ser perigoso. Manipular com cuidado.
  4. Prepare-se 1,5 mL de 200 unidades/mL corante fluorescente-faloidina conjugado de solução: faloidina-fluorescente tingem o conjugado (300 unidades em 1 frasco, sólidos liofilizados, excitação e emissão de comprimentos de onda: 581 nm e 609 nm, respectivamente) suspenso em 1,5 mL de metanol. Solução de armazenamento no escuro a-20 ° C.
  5. Prepare-se 5 mg / mL 4', 6-diamidino-2-phenylindole, dicloridrato (DAPI) solução de reserva: 10 mg de DAPI em 2 mL de N, N-dimetilformamida (DMF). Solução de armazenamento no escuro a-20 ° C.
  6. Prepare-se 5% albumina de soro bovino (BSA) em PBS: 0,5 g de BSA, 10 mL de PBS. Loja a 4 ° C.
  7. Retire a ponta chanfrada, de uma agulha de calibre 18 reta usando uma pinça e aperte as beliscadas final com um pincher no sentido longitudinal para permitir que o líquido a fluir através do lúmen da agulha (figura 1A1).
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.

2. animal dissecção e o isolamento do jejuno

  1. Fixação de perfusão de um rato
    1. Utilize luvas e trabalhe numa área bem ventilada.
    2. Preparar um copo de vidro de 100 mL, 10% tamponada solução de formalina neutra, instrumentos cirúrgicos (tesouras, pinças), um tabuleiro metálico, nylon 6-0 corte suturas, uma agulha de calibre 18 reta preparada como 1.7, uma agulha de calibre 22 alada, uma seringa de 20 mL.
    3. Carregar 20 mL da solução de formol neutro a 10% tamponada do copo de vidro para a seringa de 20 mL e conecte a agulha de calibre 22 alada à saída do.
    4. Prepare a gelatina líquida, acrescentando 1 g de pó de gelatina a 20 mL de PBS (final 5% gelatina) num tubo de centrífuga de 50 mL. Após a imersão em RT por 15 min, incube a 50 ° C em banho-maria por 15 min sem tremer.
    5. Brevemente o vórtice e incubar a 50 ° C por mais 15 minutos dissolver completamente a gelatina. Deixe o tubo em RT até o uso.
    6. Eutanásia em um rato adulto por deslocamento cervical.
    7. Coloque o mouse da etapa 2.1.6 em uma bandeja metálica e faça uma pequena incisão na pele através da cartilagem ensiform usando instrumentos cirúrgicos.
    8. Expanda a incisão com as duas mãos para expor as regiões torácicas e abdominais.
    9. Abrir o peritônio para expor o diafragma e em seguida, abra o diafragma em ambos os lados.
    10. Corte a caixa torácica na linha axilar anterior de ambos os lados e, em seguida, remover a parede torácica pela corte no sentido transversal na posição do timo para expor o coração.
    11. Faça uma pequena incisão da aurícula do átrio direito para drenar o sangue e inserir uma agulha de calibre 22 alada do ápice do ventrículo esquerdo. Empurre o êmbolo para perfundir os tecidos com solução de formol neutro a 10% tamponada.
    12. Depois de expor os órgãos na pélvis, cortar a extremidade do reto do ânus e separar os intestinos do corpo cortando o mesentério.
    13. Para isolar o jejuno, corte os intestinos a 4 cm do lado anal do antro gástrico. Descarte a anal metade do intestino delgado remanescente.
    14. Clip do jejuno ao meio para facilitar o procedimento de lavagem. Carga 20 mL de 10% solução de formalina neutra do tampão para a seringa de 20 mL e anexar a 18 reta agulha preparada na etapa 1.7 para a tomada.
    15. Injecte a solução de neutro de formalina 10% tamponada de uma ponta de jejuno recortado para expulsar o conteúdo intestinal e fixar a superfície de lúmen do intestino (figura 1A2).
    16. Lave o lúmen do intestino através da injeção de PBS conforme descrito na etapa 2.1.15.
    17. Lave a gelatina líquida no lúmen do intestino, conforme descrito na etapa 2.1.15 para substituir PBS com gelatina líquida.
    18. Fechar uma das extremidades do jejuno recortado pela ligadura de sutura utilizando um nylon 6-0 corte sutura, encha o jejuno com gelatina líquida e feche a extremidade oposta pela ligadura de sutura (figura 1A3).
    19. Adicione quatro pontos de sutura para caber uma seção em forma de salsicha jejuno à parte deprimida de uma cryomold (figura 1A4).
      Nota: Para cryomolds com uma 20 x 25 mm x 5 mm deprimido seção, uma seção de salsicha-como jejuno ~ 20 mm é preferível.
    20. Mergulhe os tecidos em 50 mL de 15% de sacarose em solução de formol neutro a 10% tamponada durante a noite a 4 ° C.
      Nota: Estes passos assegurar cryoprotection por sacarose e proteína de fixação por formalina de gelatina e tecido. Formalina-gelatinizado gelatina não derrete em RT, Considerando que a gelatina gelatinizada não fixa a 4 ° C derrete no RT

3. encaixe o congelamento dos tecidos jejuno cheio de gelatina

  1. Cortando o jejuno nos pontos de sutura, três pedaços de salsicha, como jejuno com ambas as extremidades ligados são obtidos (figura 1A4). Alinhe os pedaços de salsicha, como em um cryomold para além da incorporação de compostos para preparação de amostras congeladas.
  2. Snap congelar o cryomold em isopentano arrefecido com nitrogênio líquido. Loja cryomolds a-80 ° C
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.

4. imunofluorescência de tufo células usando Cryosections flutuantes

  1. Cryosectioning
    1. Defina a temperatura da câmara do criostato (CT) e a temperatura do objeto (OT)-22 ° c. Lugar do tecido congelado bloco em um cryomold na câmara do criostato pelo menos 15 min.
    2. Adicione 3 mL de PBS para um prato de cultura 35mm.
    3. Remover o bloco de tecido congelado da cryomold e cortar o bloco ao meio com uma lâmina de barbear para expor a seção transversal do jejuno. Montar uma metade do bloco em um mandril (um adaptador criostato), a seção do plano de corte com a lâmina de barbear.
    4. Seção do jejuno cheia de gelatina em 30 seções µm de espessura. Uso congelada fórceps para transferir suavemente as seções para o prato de 35mm cultura preparado na etapa 4.1.2 (Figura 2Bcerto).
  2. Aplicação de anticorpos primários
    1. Lave as seções flutuantes no prato 3 vezes durante 5 min cada com 3 mL de PBS-T com agitação suave num agitador recíproco 35mm cultura (aproximadamente 36 vezes / min).
    2. Preparar a solução de recuperação de antígeno: 0,3 mL de concentrado de solução de recuperação do antígeno (Tabela de materiais) em 2,7 mL de água ultrapura. Adicione 3 mL de solução de recuperação de antígeno para o prato de 35mm cultura contendo seções flutuantes.
    3. Feche a tampa, selar a abertura entre o prato e a tampa com uma tira de fita de vinil e incubar a 50 ° C em uma incubadora de hibridização para 3h sem tremer.
    4. Retire o prato da incubadora e cool no RT por 20 min. Depois de retirar a fita de vinil, lave as seções 3 vezes durante 5 min cada com 3 mL de PBS-T e agitação suave.
    5. Aspirar o PBS-T e adicionar 5 gotas de solução de bloqueio (Tabela de materiais) para as seções. Incube a RT por 5 min com agitação suave.
    6. Preparar a solução de anticorpo primário: 495 µ l de BSA de 5% em PBS com 5 µ l de fosfo-Y1798 girdin (pY1798) anticorpos (Tabela de materiais). Adicione 500 µ l de solução de anticorpo primário sobre as seções (a solução de bloqueio não precisam ser removidos).
    7. Coloque o prato em uma câmara de incubação umidificado e incubar durante uma noite a 4 ° C, com agitação suave.
      Nota: A incubação durante a noite pode ser estendida para até três noites.
  3. Aplicação de anticorpos secundários
    1. Lave as seções 3 vezes durante 5 min cada em 3 mL de PBS-T com leve agitação.
    2. Preparar a solução diluída DAPI: 2 µ l de solução-mãe de DAPI (passo 1.5), 998 µ l de PBS.
    3. Fazer a solução de anticorpo secundário: 476 µ l de BSA de 5% em PBS, 10.5 µ l de solução diluída de DAPI, 12,5 µ l de conjugado solução corante fluorescente-faloidina, 1 µ l de conjugado de tintura cabra anti-coelho IgG-fluorescente (comprimento de onda: excitação 496 nm, emissão de 520 nm).
    4. Depois de aspirar a PBS-T, aplicar a solução de anticorpo secundário e incubar em uma câmara de incubação luz blindado em RT por 30 min com agitação suave.
    5. Lave as seções 3 vezes durante 5 min cada com 3 mL de PBS-T e agitação suave.
    6. Após a lavagem final, retire o PBS-T e substitua com 3 mL de PBS falta polyoxyethylene(10) octilfenil éter. Transferi a cápsula para um microscópio estereoscópico.
    7. Lugar de 200 µ l de PBS em uma gota no centro de uma seção vidro branco revestido MAS slide e transferência um jejuno do prato para a gota usando uma ponta da pipeta P200.
    8. Depois de ajustar o alinhamento de seção sob o microscópio estereoscópico, Aspire todos os restantes PBS em torno da seção.
    9. Adicionar 20 µ l de mídia de montagem aquoso e coloque uma lamela de 20 x 20 mm no topo da mídia.
    10. Imediatamente sele as bordas de lamela com mídia de montagem baseada em xilol. Coloque o slide em uma madeira mappe e permitir que a mídia de montagem baseada em xileno a solidificar no RT para 2-3 h.
      Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Depois que a mídia de montagem baseada em xileno se solidifica, os slides podem ser armazenados por 2-3 semanas em uma caixa de luz-blindado slide na RT

5. Confocal da microscopia

  1. Coloque óleo de imersão sobre o objectivo X 63 de um microscópio confocal. Desliguem o lamela-slide e colocar o slide no palco.
  2. Digitalizar as imagens de TC adquiridas à laser de comprimentos de onda 405, 488 e 555 nm e salvar as imagens em formato tiff (. TIFF).
    Nota: Escolher um conjunto de filtro de deteção que é apropriado para as tinturas de fluorescência (ou seja, maxima de excitação/emissão: 358/461 nm, 490/525 e 590/617).

Resultados

Gelatina-enchimento do jejuno

Um procedimento típico para o enchimento do mouse jejuno com gelatina é mostrado (figura 1A), como são os benefícios da gelatina-enchimento (figura 1B). Em breve, a ponta chanfrada de uma agulha reta 18 foi removida para proteger contra perfuração da parede do intestino (figura 1A1). Recheio de gelatina foi conseguido usando 10% em solução de formol neutro injectada de uma extremidade de uma seção de jejuno recortado para limpar o intestino e fixar a superfície de lúmen do intestino (figura 1A2) de buffer antes do enchimento com gelatina líquida ( Figura 1A3). Os pedaços de salsicha, como resultantes (figura 1A4) foram incorporados, congelados e seccionados transversalmente em 30 µm de espessura fatias em um criostato. Na ausência de gelatina de enchimento, seções jejunal tendem a torcer, permitindo que as vilosidades balançar para trás (figura 1Bà esquerda). Recheio de gelatina preserva o disco-forma redonda das seções e mantém o posicionamento vertical das vilosidades (figura 1Bcerto). As imagens indicam claramente a vantagem conferida pela gelatina de enchimento em preservar a morfologia das seções flutuantes jejuno.

Imagem de sucesso das células intestinais topete

pY1798 anticorpos podem ser aplicados por técnicas de imunocoloração variável, incluindo mancha do ponto, mancha ocidental, coloração de seção de parafina, degelo-montado cryosection coloração ou flutuante cryosection coloração1,9. Neste protocolo, enfocamos cryosections flutuante para fluorescência de coloração de SCT no jejuno de rato usando anticorpos pY1798, faloidina e DAPI coloração para demonstrar as características estruturais dos TCs1. Em geral, TCs estão espalhadas em uma taxa de aproximadamente um TC/100 células epiteliais da ponta das vilosidades a cripta1. Os resultados representativos mostram que pY1798 reproducibly delineia TCs inteiras, incluindo a membrana, citoplasma do soma em forma de carretel e a ponta lumenal fortemente corada, onde condensação sinal robusto corresponde a salientes 'topete' de um TC1 (Figura 2A-2B). Enquanto isso, faloidina é um phallotoxin, uma família de venenoso bicíclico heptapeptides do cogumelo Amanita phalloidese tem alta afinidade para actina filamentosa (F-Actina), que está presente em microvilli que forma a fronteira escova intestinal 11. faloidina reproducibly e proeminente marca a fronteira de escova espessado que corresponde a uma massa de raízes, estendendo-se desde o topete1. Assim, a localização co consistente de sinais pY1798 (soma em forma de carretel, sinal de condensação na ponta lumenal) com a borda proeminentemente espessada escova faloidina positivo demonstra que este protocolo identifica com êxito TCs independentemente de Se eles estão localizados em das vilosidades (,Figura 2A) , ou em uma cripta de (,Figura 2B).

Recuperação do antígeno de baixa temperatura é eficaz para coloração de seções flutuantes

Recuperação de calor-baseado do antígeno a 95-99 ° C é amplamente utilizada para análise de secções de parafina e cryosections slide-montado. Porém, é difícil a aplicação desta abordagem para seções flutuantes sem causar danos porque tais seções são geralmente mais frágeis do que seções slide-montado que são compatíveis com o slide12. Desde a recuperação do antígeno de baixa temperatura (50 ° C por 3 h) usar um banho de água não afetou a morfologia das seções flutuantes jejuno em experimentos preliminares, avaliamos a eficácia objetiva da recuperação do antígeno de um cego de teste, que Estatisticamente, confirmaram a eficácia da recuperação do antígeno de baixa temperatura (Figura 3).

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Figura 1: Enchimento de gelatina de jejuno seções para preservação morfológica de cryosections
(A) fotografias dos processos de enchimento intraluminal de rato jejuno com gelatina. (A1) A ponta chanfrada de uma agulha reta 18 foi removida para evitar perfuração da parede do intestino. (A2) Solução tamponada de formalina neutra (10%) foi injetada em uma extremidade do jejuno recortado para liberar o conteúdo intestinal e corrigir a superfície de lúmen do intestino. (A3) Jejuno recortado cheio de gelatina líquida e ambas as extremidades ligadas usando um de sutura nylon 6-0 (setas pretas). (A4) Quatro mais sutura knots (setas brancas) colocado entre a pré-existente sutura knots (setas pretas) rendeu três peças mais curtas. O tecido em seguida será separado em três pedaços de salsicha, como à duas posições indicadas (setas brancas). (B) efeitos benéficos da gelatina-enchimento na morfologia de cryosection flutuante. Sem enchimento de gelatina, seções tendem a torcer, permitindo que as vilosidades facilmente balançar para trás (esquerda); com recheio de gelatina, uma seção de 30 µm de espessura mantém uma forma de disco e a posição vertical das vilosidades é preservada (à direita). Imagens foram fotografadas usando contraste de interferência diferencial Nomarski. Escala de barras, 1 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Imagens de fluorescência representativa das células intestinais tufo de rato
Imagens de fluorescência confocal de TCs em um das vilosidades (A) ou em uma cripta (B), nas seções de jejuno flutuantes do mouse manchado com site-specific e anticorpos específicos fosforilação-estatuto contra girdin fosforilado em tirosina (1798 pY1798, verde, excitação/emissão ideal comprimentos de onda de 490/525 nm), faloidina (vermelho, 590/617 nm), 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, azul, 358/461 nm). A área delimitada por caixas brancas nas imagens de baixa ampliação (escala de barras, 50 µm) é expandida à direita (escala de barras, 10 µm). pY1798 anticorpos reproducibly mancham TCs, independentemente da localização (em das vilosidades (A), ou em uma cripta (B)), com coloração presentes na ponta lumenal (setas), membrana e citoplasma da soma de TC em forma de carretel. Uma borda de escova proeminentemente espessada em faloidina coloração (setas) é um outro sinal distintivo de TCs. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Recuperação do antígeno de baixa temperatura aumenta pY1798 imunofluorescência
Dois grupos de procedimentos experimentais foram comparados para confirmar a eficácia da recuperação do antígeno de baixa temperatura. Seções de jejuno flutuantes (30 µm e espessura, n = 13) de um único bloco congelado foram divididos em dois grupos e seções de cada grupo foram coradas seguindo o protocolo completo ou o mesmo protocolo de falta de recuperação de antígeno de baixa temperatura (etapa 4.2.2). Depois da coloração, as seções foram montadas em slides individuais marcadas com números de grupo e a rotulagem em cada slide estava coberta com fita adesiva. Todos os slides foram baralhados, rotulados com novos números na fita e observados sob microscopia de fluorescência através de um filtro FITC. Contagem total de visíveis pY1798-positivo TCs eram em média em cada grupo e foram exibidas em um gráfico de barras (média ± desvio-padrão). Realizou-se um teste t bicaudal para comparar as contagens médias entre os dois grupos. P-valores abaixo de 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Recuperação do antígeno de baixa temperatura melhorou significativamente a eficácia do pY1798-imunofluorescência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Este protocolo foi projetado para permitir que os pesquisadores sem experiência de histologia obter imagens confiáveis de células de topete (TCs). Este protocolo tem três pontos críticos: 1) o uso do site - e fosforilação estatuto específico coelho Anticorpos policlonais contra humano girdin fosforilado em tirosina 1798 (anticorpos pY1798) que foram obtidos de uma empresa específica ( Laboratórios Immuno-Biological = empresa X); 2) enchimento de gelatina do jejuno; e 3) recuperação do antígeno de baixa temperatura. Em sentido lato, anticorpos específicos estado de fosforilação podem ser categorizados como modificação específica anticorpos que reconhecem um tipo específico de modificação pós-traducional (por exemplo, acetilação, metilação ou fosforilação) de um proteína em um resíduo de aminoácido específico. Et al . Omori e empresa X conjuntamente gerados anticorpos pY1798 por imunizar coelhos com peptídeo fosforilado e purificando os anticorpos resultantes usando cromatografia de fase sólida com um peptídeo unphosphorylated seguindo método9, do Goto 10. pY1798 anticorpos intensamente foram validados com em vitro fosforilação ensaios usando vetores da expressão girdin humanos completos com/sem um ponto de mutação em tirosina 17989. Posteriormente, Kuga et al encontraram que pY1798 anticorpos da empresa X são um marcador específico e sensível de intestinal TCs1. Assim, a inclusão de anticorpos pY1798 da empresa X é um ponto crítico neste protocolo.

Gelatina contém colágeno extraído de tecidos animais e tem sido muito utilizada para incorporar amostras de tecido para estudos histoquímicos usando cryosections13. Gelatina de baixo ponto de fusão, que é gelatinizada a 4 ° C, mas derrete à temperatura ambiente, começou a ser aplicado para evitar os efeitos adversos de calor necessária para manter a gelatina em estado líquido durante14a incorporação. Neste protocolo, baixo ponto de fusão de gelatina feita de pó de gelatina que gelatinizes a 4 ° C e derrete no RT foi usada para preservar a morfologia de cryosections transversal de rato jejuno. Quando esta gelatina foi usada para preencher completamente o jejuno, as amostras foram então fixada em formol para alcançar gelatinização irreversível. Recuperação do antígeno induzida por calor é um método eficaz para expor a antígenos que são mascarados pela aldeído-contendo fixador12. No entanto, as altas temperaturas (95-99 ° C por 30 min), comumente usadas para análise de secções de parafina podem danificar a morfologia do complexa tecido/gelatina. Aqui usamos a recuperação de antígeno de baixa temperatura (50 ° C por 3 h) que permite que tanto a recuperação do antígeno e a preservação da morfologia do tecido.

pY1798 anticorpos podem rotular TCs não só no jejuno de rato, mas também em vários órgãos (estômago, íleo, cólon e vesícula biliar) de camundongos e humanos1. No entanto, porque rapidamente se degradará pY1798 sinais em tecidos não fixados de qualquer tecido, este protocolo inclui injeção de formol no lúmen do jejuno (passo 2.1.15., 1A figura2).

Existem limitações associadas com a espessura de cryosections flutuante. Embora cryosections fina pode ser vantajoso em termos de translucidez para microscopia, a magreza faz essas seções fisicamente vulneráveis. Em contraste, cryosections grossas são fisicamente resistentes, mas tem baixa permeabilidade de anticorpo para a seção. Neste protocolo, foram utilizadas 30 µm de espessura seções que foram fisicamente estável e permeável aos anticorpos. Embora este método foi projetado para pesquisadores sem vasta experiência em histologia, se falhar, o protocolo, DAPI/pY1798/villin triplo mancha de parafina seções semelhante à utilizada pelo Kuga et al pode ser realizado1. Cortes de parafina não foram utilizados aqui para evitar as dificuldades associadas a faloidina coloração de F-Actina em cortes de parafina.

Devido a conservação de sequências de aminoácidos adjacentes para girdin tirosina-1798, anticorpos pY1798 podem ser aplicados para manchar TCs em espécie além do mouse, incluindo o rato e humanos. O recheio de gelatina usado neste protocolo também pode ser aplicado para outros órgãos ocos. Com efeito, para além de pY1798 ou TC, a combinação de gelatina com recuperação do antígeno de baixa temperatura de enchimento pode ser útil para revelar notoriamente "difícil" resumos no intestino do rato e como consequência, pode ser de interesse para muitos pesquisadores.

O papel biológico de girdin e o significado de sua fosforilação em TCs não são claras. No entanto, um estudo realizado por Lin et al . sugeriu que tirosina fosforilação de girdin está associada com o grau de polimerização de actina F8. Enquanto isso, Kuga et al encontraram tão letal doses de indutores de apoptose (EG., cisplatina, radiação de raio-x) causou um grande aumento da frequência relativa dos TCs no intestino delgado do rato que a hipótese de eles podem ser associados com o possível conversão de enterócitos TCs, em sincronização com a fosforilação de girdin em microvilli1. Esta possibilidade exige investigação adicional no futuro. Três grupos recentemente observados rápidos aumentam na frequência de TC parasita infecção15,16,17a seguir. Assim, esta mancha flutuante poderia ser usado não só para analisar os tecidos do intestino humano coletado por via endoscópica, mas acumulação de TC pode também auxiliar no diagnóstico de infecção do parasita no intestino humano.

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos Naoya Asai da Universidade de Nagoya para fornecer sugestões úteis para o desenvolvimento de recuperação de antígeno de baixa temperatura para seções flutuantes jejuno. Este trabalho foi financiado pelo Grants-in-Aid para Scientific Research (KAKENHI) (C) em 2012 (JP25460493) e (B) em 2017 (JP17H04065) da sociedade do Japão para a promoção da ciência (JSPS), um-passo concede em 2014 (AS251Z02522Q) e em 2015 (AS262Z00715Q) do Japão-ciência e tecnologia agência (JST) e um visionário Takeda pesquisa 2014 concessão da Fundação de ciência Takeda (para mestrado).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Slc:DDY camundongos fêmeas de 6 semanasChubu Kagaku ShizaiNão aplicável
Hidrogenofosfato dissódico 12-água (Na2HPO412H2O)Wako196-02835
Dihidroenfosfato de sódio Di-hidratado (NaH2PO42H2OWako199-02825
Cloreto de sódio (NaCl)Wako199-10665
Triton X-100,  Polioxietileno (10) éter octilfenílicoKatayama ChemicalNão aplicável
SacaroseWako190-00013
Solução de formalina neutra tamponada a 10%Muto Chemical20215Etapa 1.3.
Conjugado de corante fluorescente de faloidina, Alexa Fluor 594 faloidinaThermoFisher ScientificA12381
MetanolNacalai Tesque21915-35
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, dicloridrato)ThermoFisher ScientificD1306
N.N-dimetilformamida (DMF)Nacalai Tesque13015-75
Soro bovino albuminaSigmaA9647-10G
agulha reta de aço inoxidável calibre 18TerumoNN-1838R
U.S.P. 6-0, sutura de corte de nylon de 60 cm, CrownjunKono SeisakushoNão aplicável
agulha alada de calibre 22TerumoSV-22DLK
seringa TERUMO de 20 mLTerumoSS-20ES
tubo de centrífuga de 50 mLTPP91050
Tubos de centrífuga Iwaki de 15 mLIwaki2325-015
Micro tubo de ensaio de 1,5 mLStarRSV-MTT1.5
Gelatina em pó, Gelare-blancNitta Biolab2809
Composto de incorporação para amostra de tecido congelado, Composto OCT 118 mL 12 peçasSakura FineTech4583
Cryomold, CRYO DISH No. 3, 125 peças, tamanho do poço 20 x 25 x 5 (mm)Shoei Work's1101-3
IsopentaneNacalai Tesque26404-75
Placa de cultura de células Falcon 35 x 10mm Easy-GripCorning353001
Concentrado de solução de recuperação de antígeno, Solução de recuperação de alvo pH 9 10xDakoS2367Solução de recuperação de antígeno concentrada na etapa 4.2.2.
Bloco de proteínaDakoX0909Solução de bloqueio em 4.2.5.
Anticorpos Fosfo-Y1798 girdina (pY1798)Immuno-Biological Laboratories (IBL) = Empresa X28143Anticorpos fosfo-Y1798 girdina na etapa 4.2.6.
Anticorpo secundário altamente adsorvido de cabra anti-coelho IgG (H+L), Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA11034
Mídia de montagem aquosa, Prolong Gold Antifade MountantThermoFisher ScientificP36930
Coverblades, Matsunami Micro Cover Glass 22 x 22 mm 100 pcs Espessura No.1Matsunami GlassC022221
Entellan Nova mídia de montagem à base de xileno para microscopiaMerck Millipore107961
vidro de lâmina revestido com MAS brancoMatsunami GlassMI-MAS-01
Wooden Mappe KO-typeShoei Work's99-40007
Óleo de Imersão 518 F Livre de Fluorescência 20 mlZeiss444960
Pipetas, Pipetman P (P2, P20, P200, P1000)GilsonF144801, F123600, F123601, F123602
Sistema de produção de água ultrapuraLuva de plástico AdvantecGS-590
, luva de nitrilo estrelaCryostat
Leica MicrosystemsCM1950
Congelador, SANYO Ultra LowSanyoMDF-382
Frigorífico NihonFreezerNC-ME50EC
Banho-maria, Thermominder SDminiN (para dissolver a gelatina a 50 C)Taitec0068750-000
Incubadora de hibridização (para recuperação de antígenos a 50 C)TaitecHB-100
Câmara de incubação para imunocoloraçãoCosmo Bio10DO
Agitador recíproco para imuno-histoquímica (para temperatura ambiente)TaitecNR-1
Agitador recíproco para imuno-histoquímica (para 4 C)Tokyo Rika KikaiMMS-3010
(para manuseio de tecidos)MicroscópioOlympus SZ61
(para Figura 1B)Leica MicrosystemsM165FC
(para Figura 3)MicroscópioE800
ZeissLSM700
Microscópio estereoscópico estereoscópico Microscópio de fluorescência confocal de varredura a laser Nikon

Referências

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