O protocolo descrito neste artigo usa o músculo levator auris longus (LAL) de rato para gravar espontânea e nervo-evocou potenciais pós-sinápticos (corrente-braçadeira) e correntes (tensão-braçadeira) na junção neuromuscular. Uso desta técnica pode fornecer insights-chave nos mecanismos de transmissão sináptica sob condições normais e doença.
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Artigo de método
Músculo levantador Auris Longus Preparação para exame da transmissão Neuromuscular mamíferos sob condições de grampo de tensão
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este protocolo descreve uma técnica para gravar transmissão sináptica da junção neuromuscular sob condições de grampo-corrente e tensão-braçadeira. Uma preparação ex vivo do levantador auris longus (LAL) é usada porque é um fino músculo que proporciona fácil visualização da junção neuromuscular por empalamento microeléctrodo do motor placa terminal. Este método permite a gravação dos potenciais de placa terminal em miniatura espontânea e correntes (pptm e mEPCs), os potenciais de placa terminal evocado-nervo e correntes (EPPs e EPCs), bem como as propriedades de membrana da placa terminal motor. Resultados obtidos com este método incluem o conteúdo quantal (QC), número de sítios de liberação de vesículas (n), a probabilidade de liberação de vesículas (prel), facilitação sináptica e depressão, bem como a constante de tempo de membrana do músculo (τ m) e resistência de entrada. Aplicação desta técnica para modelos do rato da doença humana pode destacar as principais patologias nos Estados de doença e ajudar a identificar estratégias de tratamento de novela. Apertando totalmente tensão-uma única sinapse, este método fornece uma das análises mais detalhadas da transmissão sináptica atualmente disponível.
Introdução
Estudando a transmissão sináptica na junção neuromuscular fornece insights sobre a relação dinâmica entre os sistemas musculares, nervosos e esqueléticos e é um excelente modelo para analisar a fisiologia sináptica. O músculo levantador auris longus (LAL) é um músculo fino, permitindo às junções neuromusculares ser facilmente visualizado. Relatórios anteriores descreveram a conveniência de usar o leite para examinar as toxinas e drogas sinápticas e caracterizaram as características do tipo de fibra de músculo esquelético da LAL1,2. Numerosos estudos têm usado o LAL para examinar a fisiologia neuromusc....
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Protocolo
Todos os animais procedimentos foram realizados em conformidade com o Comitê de uso de Wright State University e cuidado Animal.
1. Mouse eutanásia
- Em uma coifa, coloque o mouse em um vidro hermético anestesiar a câmara.
- Expor o mouse através de inalação de uma dose letal de isoflurano (saturando, ou ~ 25%). Deixe o mouse na câmara até respiração não pode ser observada.
- Remover o mouse da câmara e executar um deslocamento cervical como um método secundário de eutanásia.
2. remoção de pelos da superfície Dorsal da cabeça, pescoço e costas
- Use um barbeador elétrico para....
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Resultados
A Figura 8 mostra um exemplo dos pulsos de corrente (Figura 8A) e as respostas de tensão (Figura 8B) de uma fibra de leite sob corrente-braçadeira de um selvagem de 12 semanas de idade tipo R6/2 do rato. A presença de pptm indica que esses registros foram retirados do motor placa terminal. Os registros foram obtidos em soro fisiológico normal. Esses registros de corrente-braçadeira podem ser analisad.......
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Discussão
Aqui descrito é a preparação e uso do mouse músculo LAL para a medição da transmissão neuromuscular sob condições de tensão ou corrente --braçadeira. Há vários pontos importantes a considerar para a dissecar o LAL. Limpar o excesso de tecido conjuntivo das aids de músculo em empalamento de eletrodo, como os eletrodos pode snag o tecido conjuntivo quando posicionando-os por empalamento. No entanto, só remover o tecido conjuntivo que pode ser retirado facilmente para limitar as chances de danificar o músculo. O isolamento .......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos Dr. Mark M. Rich e Daniel Miranda Comentários editoriais, Ahmad Khedraki para ajudar a estabelecer essa técnica e Wright State University, para apoio financeiro (fundo de inicialização para A.A.V.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Microscópio Composto Olympus | BX51WI | ||
| 10x Objetiva | Olympus | UMPLFLN10XW | |
| 40x Objetiva | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| Vidro de Borosilicato | Sutter Instruments | BF150-86-7.5 | |
| Câmera CCD | Santa Barbara Instruments Group | ST-7XMEI | |
| Mater-9 Pulse Gerador | AMPI | ||
| Iso-flex Stimulus Isolator | AMPI | ||
| pCLAMP 10 Software de Aquisição e Análise de Dados | Molecular Devices | 1-2500-0180 | |
| Eletrodo Bipolar Concêntrico | FHC | CBDSH75 | |
| Manipulador de Junta Esférica | Narishige | ||
| Seringas não metálicas 34 Gauge | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Nikon Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | |
| No. 5 Fórceps | Fine Science Tools | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| No. 2 Fórceps | Roboz | RS-5Q41 | |
| Microdissecação Tesoura | Roboz | RS-5912SC | |
| Sylgard 184 Kit de Elastômero de Silicone | Dow Corning | 2404019862 | |
| Creme de Depilação | Nair | ||
| Grass SD9 Estimulador | Grama Modelo Médico | ||
| P-1000 Extrator de Micropipeta | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Axônio Digidata 1550 Sistema de Acuisição de Dados de Baixo Ruído | Instrumentos | ||
| Pass Bessell Filter | Warner Instrument Corp. | LPF-8 | |
| Micromanipulador Canhoto | Siskiyou Corp. | MX1641/45DL | |
| Micromanipulador destro | Siskiyou Corp. | MX1641/45DR | |
| Único Controlador de Movimento | Siskiyou Corp. | MC100e | |
| Micromanipulador de Rolos Cruzados | Siskiyou Corp. | MX1641R | Isso foi adicionado ao eixo Z dos micromanipuladores para canhotos e destros para permitir que o eixo z seja motorizado. Essa configuração personalizada é mais barata e menos volumosa do que comprar um micromanipulador motorizado de 4 eixos. Também nos permite controlar ambos os micromanipuladores com um controlador |
| Todos os produtos químicos foram encomendados da Fisher, exceto, | |||
| BTS | Toronto Research Chemicals | B315190 | |
| CTX | Alomone Labs | C-270 | |
| 4-Di-2-Asp | Molecular Probes | A Molecular Probes não é mais uma empresa. Agora encomendado através da Fisher |
Referências
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).
- Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D.
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Reimpressões e permissões
