Todas as espécies de Leishmania patogênicas residem e replicam no interior de macrófagos de seus hospedeiros vertebrados. Aqui, apresentamos um protocolo para infectar murino macrófagos derivados da medula óssea em cultura com Leishmania, seguido por quantificação exacta da cinética de crescimento intracelular. Esse método é útil para estudar os fatores individuais que influenciam a interação patógeno-hospedeiro e virulência de Leishmania .
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Artigo de método
Quantificação de crescimento intracelular dentro de macrófagos é um rápido e confiável método para avaliar a virulência de Leishmania parasitas
Neste artigo
Resumo
Resumo
O ciclo de vida de Leishmania, o agente causador da leishmaniose, alterna-se entre as fases amazonensis e amastigotas no interior do inseto e hospedeiros vertebrados, respectivamente. Enquanto patogénicos sintomas da leishmaniose podem variar amplamente, de lesões cutâneas benignas para formas altamente fatal doença visceral, dependendo da espécie infecciosa, todas as espécies de Leishmania residem no interior de macrófagos do hospedeiro durante a fase de vertebrados de seu ciclo de vida. Infectividade de Leishmania , portanto, está diretamente relacionada à sua capacidade de invadir, sobreviver e replicar dentro parasitophorous vacúolos (PVs) dentro de macrófagos. Assim, avaliar a capacidade do parasita para replicar intracelular serve como um método confiável para determinar a virulência. Estudar o desenvolvimento de leishmaniose usando modelos animais é demorado, fastidioso e muitas vezes difícil, especialmente com as formas viscerais pathogenically importantes. Aqui descrevemos uma metodologia para acompanhar o desenvolvimento intracelular de Leishmania na medula óssea-derivada de macrófagos (BMMs). Parasita intracelular números são determinados em intervalos de 24 h para 72-96 h após a infecção. Este método permite uma determinação confiável dos efeitos de diferentes fatores genéticos na virulência de Leishmania . Como exemplo, mostramos como uma exclusão de único alelo do gene transportador de ferro mitocondrial Leishmania (LMIT1) prejudica a capacidade da estirpe mutante de Leishmania têm LMIT1/ΔLmit1 para crescer dentro BMMs, refletindo uma redução drástica na virulência em relação ao tipo selvagem. Este ensaio também permite um controle preciso das condições experimentais, que podem ser manipulados individualmente para analisar a influência de vários fatores (nutrientes, espécies reativas de oxigênio, etc.) sobre a interação patógeno-hospedeiro. Portanto, a execução adequada e quantificação dos estudos de infecção BMM fornecem uma alternativa não-invasiva, rápida, econômica, segura e confiável para estudos de modelo animal convencional.
Introdução
Leishmaniose refere-se a um amplo espectro de doenças humanas causadas por espécies de parasitas protozoários do gênero Leishmania. Atualmente, cerca de 12 milhões de pessoas estão infectados com Leishmania em todo o mundo, e mais de 350 milhões estão em risco. A patologia da doença depende da espécie de Leishmania e fatores do hospedeiro, e sintomas variam de lesões de pele de auto-recuperação inócuo para formas visceralizing letais. Se leishmaniose visceral, não tratada é fatal, classificação somente depois da malária, como a doença mais mortal humana causada pela infecção por um protozoário parasita1. Apesar das di....
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Protocolo
Todos os procedimentos experimentais foram conduzidos em conformidade com as recomendações do guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório por institutos nacionais de saúde e foram aprovados pela Universidade de Maryland IACUC. Todos os passos descritos nas seções 1 a 4 devem ser efectuados em condições assépticas dentro dos armários biológica de fluxo laminar. Proteção pessoal deve ser usada, e o cuidado deve ser exercitado durante a manipulação de parasitas de Leishmania ao vivo durante todas as fases de experimentação.
1. isolamento e diferenciação de macrófagos derivados da medula óssea (BMMs)8
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Resultados
Leishmania tem duas formas infectantes - metacyclic promastigotas que diferenciam de promastigotas procyclic na fase estacionária da cultura e amastigotes, quais são os estágios intracelulares (Figura 1). Em algumas espécies de Leishmania , tais como L. têm, amastigotes também podem ser diferenciados na cultura axénica deslocando as células amazonensis para abaixar o pH (4.5) e temperatura elevada (32 ° C), condições similares àquel.......
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Discussão
Os dados quantitativos produzidos por BMM infecção ensaio descrito acima, permite que os investigadores obter taxas de infecção e uma determinação confiável das mudanças nas propriedades de virulência em um período de tempo relativamente curto (máximos 2 semanas, em comparação com os 2 meses exigidos para experimentos em vivo ). Esse método depende o corante específico DNA DAPI, que especificamente manchas núcleos macrófago e parasita e permite a rápida identificação e quantificação de células infectadas. Em com.......
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Divulgações
Os autores declaram que têm sem interesses financeiros de concorrentes,
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelos institutos nacionais de subsídio de saúde RO1 AI067979 a NWA.
YK é destinatário de graduação comunhão de Howard Hughes Medical Institute/Universidade de Maryland College Park.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placa de cultura de células de 6 poços | Cellstar | 657160 | |
| Adenine | Acros Organics | AC147440250 | |
| Pontas de Tubulação de Barreira de Aerossol (100-1000 μ L) | Fisherbrand | 02-707-404 | |
| Pontas de Tubulação de Barreira de Aerossol (20-200 μ L) | Fisherbrand | 02-707-430 | |
| Ponta de Tubulação de Barreira Aerossol (2-20 μ L) | Fisherbrand | 02-707-432 | |
| Lâmina Cirúrgica de Aço Carbono Bard-Parker Rib-Back #10 | Aspen Surgical | 371110 | |
| BD Luer-Lok Tip 10 mL Seringa | Becton Dickinson (BD) | 309604 | |
| BD Precisionglide, 25G | Becton Dickinson (BD) | 305124 | |
| Placa de Cultura de Células 35 mm x 10 mm | Cellstar | 627 160 | |
| Frasco de Cultura de Células | Cellstar | 660175 | |
| Óculos de Cobertura: círculos de 12 mm | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dicloridrato) | Invitrogen | D1306 | |
| D-Biotina | J.T. Baker | C272-00 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | |
| Álcool etílico 200 prova | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm placa de Petri de poliestireno não tratada com TC | Corning | 351029 | |
| Fetal Soro Bovino | Seradigm | 1500-500 | |
| Ficoll400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
| Microscópio de fluorescência | Nikon | E200 | |
| Cabra anti-rato IgG Texas vermelho | Invitrogen | T-862 | |
| Cabra anti-coelho IgG AlexaFluor488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Hemin | Tokyo Chemical Industry Co. LTD | H0008 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Isoton II Diluente | Beckman Coulter | ||
| L-Glutamina | Gemini | 400-106 | |
| Medium 199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Na piruvato (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Paraformaldeído | Alfa Aesar | 43368 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Gemini | 400-109 | |
| Solução salina tamponada com fosfato (-/-) | ThermoFisher | 14200166 | |
| Tubos de centrífuga cônicos de poliprofilina 15 mL | Cellstar | 188 271 | |
| Tubos de centrífuga cônicos de polipropileno 50 mL | Cellstar | 227 261 | |
| Reagente antidesbotamento ProLong Gold | ThermoFisher | P36930 | |
| Anticorpo anti-rato de rato Lamp-1 | Estudos de desenvolvimento Banco de hibridoma | 1D4B | |
| Recombinante Humano M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| Reichert Bright-Line Hemocitômetro | Hausser Scientific | 1492 | |
| RPMI Médio 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Triton X-100 Surfactante | Millipore Sigma | TX1568-1 | |
| Trypan Blue Tesoura | Delicada Sigma Aldrich | T8154 | |
| , 4 1/2" | VWR | 82027-582 | |
| Pinça de Dissecação, Ponta Fina | VWR | 82027-386 | |
| Lâminas de microscópio | VWR | 16004-368 | |
| Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold | Beckman Coulter | 6605699 |
Referências
- WHO. Control of the leishmaniases. World Health Organ Tech Rep Ser. (949), (2010).
- Naderer, T., McConville, M. J. Intracellular growth and pathogenesis of Leishmania parasites. Essays Biochem. 51, 81-95 (2011).
- Rosenzweig, D., et al.
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Reimpressões e permissões
