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Artigo de método

Microinjeção de Western milho repele, Diabrotica virgifera virgifera, embriões de transformação da linha germinal, ou edição de genoma CRISPR/Cas9

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DOI:

10.3791/57497

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27 de abril de 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology and Plant Pathology, North Carolina State University

Neste artigo

Resumo

Aqui nós apresentamos protocolos para coletando e microinjecting precellular milho ocidental embriões repele com a finalidade de realizar ensaios funcionais-genômica como germline transformação e edição de CRISPR/Cas9-genoma.

Resumo

Repele o milho (RPT) é uma importante praga do milho e é conhecida por sua capacidade de rapidamente se adaptar às estratégias de manejo de pragas. Embora o RNA de interferência (RNAi) provou para ser uma poderosa ferramenta para estudar Biologia WCR, tem suas limitações. Especificamente, RNAi em si é transitório (ou seja, não resulta em longo prazo mendeliana do fenótipo associado), e exige saber a sequência de DNA do gene alvo. Este último pode ser um fator limitante se o fenótipo de interesse é controlado por genes mal conservados, ou mesmo romance, porque identificar alvos úteis ia ser um desafio, se não impossível. Portanto, o número de ferramentas caixa de ferramentas genômicas do WCR deve ser expandido pelo desenvolvimento de métodos que pode ser usada para criar cepas mutantes estáveis e permitir pesquisas independentes de sequência do genoma WCR. Neste documento, detalhamos os métodos usados para coletar e microinjeção precellular WCR os embriões com ácidos nucleicos. Enquanto os protocolos descritos visam a criação de transgénico WCR, edição de CRISPR/Cas9-genoma poderia também ser realizada utilizando os mesmos protocolos, com a única diferença é a composição da solução injetada os embriões.

Introdução

Repele do milho ocidental (RPT), Diabrotica virgifera virgifera, é uma praga importante do milho1. Curiosamente, WCR aparece superar o controle mede mais rapidamente do que as pragas mais agrícolas, desde que eles não só se adaptar fisiologicamente mas também comportamentalmente2,3,4,5, 6. na última década, o RNA de interferência (RNAi), uma poderosa ferramenta de genômica funcional, foi investigado como um método de controle potencial para WCR7,8e também tem sido usado como um meio para o estudo de função do gene9. No entanto, enquanto RNAi é frequentemente realizada por microinjeção de RNA double-stranded (dsRNA) em outras espécies, baseado na injeção de RNAi é raro em WCR. Na verdade, existem apenas alguns relatos de RNAi através de microinjeção de dsRNA em WCR9. A razão é que WCR pode atingir alto-níveis de gene "knockdown" através de ingestão de dsRNA7,10, mesmo permitindo o estudo dos efeitos embrionários alimentando dsRNA para a mãe11. Enquanto este método torna WCR um excelente assunto para análise genômica funcional via RNAi,-retardou o progresso no desenvolvimento de metodologias para o embrionário microinjection nesta espécie.

Apesar do poder de RNAi, existem alguns inconvenientes. Por exemplo, nem todos os genes respondem igualmente a RNAi. Esta variabilidade pode fazer a interpretação dos resultados de um ensaio de genómica funcional mais difícil. Além disso, RNAi é transitória e não gera mutações hereditárias. Por outro lado, a transformação da linha germinal, outra ferramenta genômica funcional, pode gerar mutações hereditárias através de inserção de um elemento marcado transponíveis no genoma12,13. Isto faz a transformação do germline uma excelente ferramenta para a criação de cepas mutantes para uso em estudos de genéticos a longo prazo. Transformação também pode ser usada para resgatar uma mutação, entregando uma cópia funcional do gene de um genoma mutante14. Além disso, a transformação do germline é a pedra angular de uma grande variedade de técnicas de genéticas moleculares. Além de bater para fora e/ou resgatar a função do gene, germline transformação pode ser usada para realçador de armadilhagem15, gene armadilhagem16, expressão ectópica baseada em Gal417e mutagênese genoma-largo18.

Mais recentemente, foram desenvolvidas ferramentas que permitem a edição sofisticada do genoma. Essas ferramentas incluem transcrição Activator-Like Effector Nucleases (TALEN) e o sistema CRISPR/Cas9-nuclease19,20. A vantagem dessas novas ferramentas é que eles oferecem a capacidade de induzir uma quebra de DNA dupla-hélice em quase qualquer local dentro de quase qualquer genoma para pesquisadores. Uma vez que induzida, estas quebras podem ser reparadas através das extremidades não-homóloga juntar-se, que podem apresentar deleções ou inserções no gene alvo, ou através de reparação homologia-dirigido, que na presença de uma construção projetada, pode catalisar a substituição de genes inteiras ou regiões genéticas21,22. No entanto, esses métodos exigem microinjeção de DNA, RNA e/ou proteína em embriões muito jovens.

Importante, ao contrário do dsRNAs usado para RNAi, os ácidos nucleicos e proteínas usadas para germline transformação e edição de genoma não podem facilmente cruzar as membranas celulares. Portanto, microinjeção de DNAs plasmideo, mRNAs e/ou proteínas deve ser efectuada durante a fase de Drosophila sincicial (ou seja, antes do embrião inseto cellularizes). Isso faz com que o timing de injeções um fator crítico. Por exemplo, em Drosophila melanogaster, embriões precisam ser injetado dentro de duas horas depois de ovo colocar12. Portanto, desenvolvimento de um protocolo bem sucedido microinjeção embrionárias para WCR deve levar em conta as melhores condições para a colocação de óvulo feminino, assim como o melhor método para coletar uma quantidade suficiente de embriões precellular.

Um esforço para trazer uma ampla gama de ferramentas de genéticas moleculares sobre Biologia WCR requer desenvolver métodos de recolha e microinjecting precellular embriões WCR. Aqui nós fornecemos instruções detalhadas, juntamente com dicas e truques, para ajudar os outros a usar técnicas baseadas em transformação na pesquisa WCR. Além de estender as tecnologias transgênicas para WCR para uso em estudos de genômicos funcionais, estas técnicas também permitem poderosas novas estratégias de controle de pragas tais como gene unidade23,24 a ser testado neste economicamente importante pragas.

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Protocolo

1. nível de colônia de criação dos adultos WCR

  1. Obter uma quantidade suficiente de adultos WCR (500-1.000) de um laboratório confiável de empresa ou de pesquisa (ver Tabela de materiais para obter um exemplo) e coloque em uma gaiola de3 30 cm.
    Nota: O uso de uma cepa não-diapausing é altamente recomendado.
  2. Preparar a dieta artificial WCR, seguindo o protocolo do fabricante e despeje uma camada de 1 cm de espessura em um recipiente de 38 oz (ver Tabela de materiais). Após a mistura, armazene dieta não utilizada a 4 ° C por até 2 meses.
  3. Colocar uma placa de Petri (100 x 15 mm) com dieta adulta (10-15 g) em uma gaiola de3 30 cm. Adicione mais dieta quando a comida é baixo ou seco.
  4. Colocar um balão (300 mL) com água, coberta com uma bola de algodão, que é usada para segurar no lugar de um rolo de algodão (6 "x 3/8"), para servir como uma fonte de água. Mude a água quando ele é executado baixo.
  5. Manter WCR a 26 ° C, com 60% de humidade e um 14:10 luz do ciclo em um inseto incubadora de criação.

2. alinhamento e colheita de embriões

  1. Fazer uma câmara de coleta de ovos usando ágar de 1% em água estéril 100 x 15 mm2 placa de Petri. Armazenar a 4 ° C, após o ágar solidifies.
  2. Para coletar ovos recém-estabelecidas, coloque uma camada de papel de filtro, seguido de 4 camadas de gaze (cada corte ao tamanho) na superfície do ágar (figura 1A).
    Nota: Gaze pode ser reutilizado, depois de ser lavado em água sanitária e esterilizada, mas não é necessário fazer isso para a primeira utilização. Papel de filtro não deve ser reutilizado e não precisa ser esterilizado.
  3. Coloque a placa de coleção de ovo na gaiola WCR mais tarde no dia possível (final do dia de trabalho) e cobrir com uma tenda de papel alumínio. Deixe durante a noite.
    Nota: Tendo as luzes de 10:00 a postura de ovos 12 A.M. (14 h) atrasos, facilitando assim a recolha dos ovos mais jovens para o microinjection sem a necessidade de pessoal de laboratório colocar a câmara de recolha na gaiola à noite.
  4. Remova a câmara de recolha de ovos em torno de 8 ou 09:00
  5. Use fórceps para pegar 1 camada de gaze em tempo e lugar num copo (500 mL) de água. Lave os ovos de gaze agitando suavemente (figura 1B e 1C).
  6. Use uma pipeta de bulbo para transferir os ovos para outro copo (500 mL) de água. Repita 2-3 x para limpar os ovos.
  7. Use a pipeta de bulbo para transferir ovos em papel de filtro (Figura 1), minimizando a quantidade de transferência de água.
  8. Corte papel filtro preto em tiras tão largas como uma lâmina de vidro e a fita firmemente para o slide para certificar-se o papel fixa plana (Figura 2A).
    Nota: Papel filtro preto ajuda a melhorar a visibilidade sob o microscópio, reduzindo a quantidade de luz refletida.
  9. Aplicar a cola não-tóxica (ver Tabela de materiais para obter um exemplo) para o papel de filtro em linhas finas (Figura 2B). Manter as linhas de cola mais fino do que o diâmetro de um ovo de modo a evitar os ovos revestidos em cola.
  10. Use um pincel fino para mover suavemente WCR os ovos um a um de seu papel de filtro para a linha de cola. Para colocar os ovos na cola antes de secar para fora e tentar manter distância de pelo menos um ovo entre cada ovo.
  11. Maximize a eficiência de injeção, colocando várias linhas de ovos no slide um papel de filtro (Figura 3).
  12. Depois que todos os ovos para fora o papel de filtro, espere até que toda a cola secar antes de microinjeção.
    Nota: Para transformação do germline e genoma CRISPR/Cas9-mediada edição, injete todos os embriões do meio-dia (12:00) para que o embrião mais velho é velho não mais de 19 h. No entanto, para RNAi, não há nenhuma limitação de tempo porque, em WCR, dsRNA pode mover entre as células. Na verdade, para RNAi, embriões de envelhecimento podem resultar em melhores taxas de sobrevivência.

3. preparação de DNAs plasmideo e agulhas de injeção

  1. Prepare-se alta qualidade supercoiled Plasmídeo usando um comercial livre de endotoxinas kit (veja a Tabela de materiais para obter um exemplo).
  2. Para preparar a solução de injeção, verifique a concentração de cada plasmídeo e então combinar auxiliar do plasmídeo (concentração final de 250 ng / µ l), doador do plasmídeo (concentração final de 750 ng / µ l) e buffer de vermelho de fenol (20% de concentração final). Vórtice brevemente a solução e centrifugar para 3 min na velocidade máxima para precipitar partículas que podem entupir a agulha.
  3. Puxe agulhas de vidro de borosilicato (O.D. 1 mm, identificação 0,58 mm, comprimento de 10 cm) usando um extrator de micropipeta tipo flamejante/marrom. Para armazenamento, secure agulhas puxadas na fita adesiva dupla-face em uma placa de Petri ou outro recipiente transparente.
    Nota: Para o sistema extrator de micropipeta, as configurações usadas foram: calor = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100.
  4. Aterramento a agulha de injeção, usando um microcarregador de ponta (ver Tabela de materiais) para pipetar 0,5 - 1,0 µ l para baixo dentro da agulha, perto da extremidade pontiaguda. Remova as bolhas da ponta da agulha se ocorrer qualquer um.
  5. Introduza o suporte da agulha, a agulha de injeção.
  6. Abra a ponta da agulha suavemente rompendo com um belo par de pinças, ou suavemente tocar/arrastando a ponta no slide lamela ou vidro.
    Nota: O objetivo é ter a menor abertura que ainda permite a combinação de injeção para sair (aberturas menores geralmente requerem maior pressão de injeção). Agulhas chanfradas não exigem este passo desde já estão abertas.

4. microinjection e cuidados pós-injeção

  1. Usando um pincel fino, cuidadosamente molhe a superfície de 1-3 ovos com água estéril, introduza a agulha e injetar a solução. Injete cada ovo antes que seque a superfície. Olha para a aparência uma pequena quantidade de cor vermelha dentro dos ovos durante a injeção para indicar a microinjeção de sucesso. Esmagar ou remover todos os ovos que está danificado, vazio, ou caso contrário não podem ser injetados.
    Nota: Embora a pressão de injeção varia de acordo com o tamanho de furo de agulha, 10-13 psi é um bom ponto de partida.
  2. Depois que todos os ovos são injetados, remova a lâmina de vidro o papel de filtro.
  3. Coloque o papel de filtro sobre a superfície de um prato de 1% de ágar (descrito acima).
  4. Use filme plástico parafina para selar o prato e coloque em um inseto de 26 ° C criação de incubadora durante 12 dias.
    Nota: O filme de parafina ajudará a evitar a contaminação cruzada do molde entre pratos. No entanto, qualquer outro tratamento para evitar mofo e crescimento bacteriano poderia reduzir a sobrevivência dos embriões injetados.

5. cultivo e incubação de embriões

  1. Comece a verificar injeção após 12 dias de embriões para larvas recém-eclodidas e continuar diariamente para as próximas 2 semanas.
  2. Transferência de larvas, usando um pincel fino, para uma caixa de criação com milho germinado e solo.
    Nota: Molde pode crescer no prato agar, mas as larvas eclodem ainda na maioria dos casos. Procure larvas cuidadosamente dentro do molde para pegá-los todos. Algumas larvas podem passar para a tampa do prato e podem ficar preso a condensação.
  3. Larvas a 26 ° C, seguindo o padrão WCR criação métodos25de trás.

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Resultados

Uma consideração importante ao desenvolver este protocolo foi palco do desenvolvimento embrionário no momento da microinjeção. Especificamente, o germline transformação requer microinjeção de DNAs antes celularização embrionária. Isso ocorre porque o DNAs facilmente não podem atravessar as membranas celulares. Tenta visualizar os estágios do desenvolvimento embrionário WCR, usando uma mancha nuclear não tiveram sucesso porque dechorionation de embriões WCR essencialmente dissolve todas as...

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Discussão

Embora microinjection de WCR com dsRNAs com a finalidade de RNAi tem sido relatado9, este é o primeiro protocolo para estabelecer as melhores práticas para microinjecting precellular embriões WCR, um processo crítico para a realização da linha germinal transformação e/ou CRISPR/Cas9 genoma edição nesta espécie. Sucesso microinjeção de embriões WCR é dependente de muitos fatores, como eficiência de transformação. Discutidas a seguir estão algumas das principais questões impactando o resultado do us...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do programa de pesquisa Monsanto milho Rootworm conhecimento, conceder número AG/1005 (ao MDL e YC) e fundos de start-up de MDL da NCSU. FC foi apoiado por subsídios do programa de pesquisa de conhecimento para repele de milho da Monsanto (AG/1005) e o National Science Foundation, conceda número MCB-1244772 (MDL). Os autores declaram não interesses concorrentes. FC e MDL concebido e desenhado os experimentos; FC, PW e SP realizaram os experimentos; FC e MDL analisaram os resultados; e FC, NG e MDL escreveram o manuscrito. Agradecemos a Teresa O'Leary, William Klobasa e Stephanie Gorski por sua assistência especializada em triagem WCR. Agradecemos também o Dr. Wade French (USDA-ARS, Laboratório Central de pesquisa agrícola do Norte, Brookings, SD) para remessas de ovos para estabelecer colônias de laboratório e proporcionando a criação de protocolos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Papel de Filtro Qualitativo (Preto)Ahlstrom8613-0900Para microinjeção de ovo
Recipientes de 1 oz Talheres de Plástico Anny'sASET101Recipiente para ovos
Drosophila Agar Tipo IIApex66-103Substrato para prato de postura de ovos WCR
Fórceps Featherweight Bioquip4748Manuseio de larvas e pupas 
Clorox Regular-Bleach1Clorox44600-30770Lave milho e pratos
Trucker's Favorite YellowCoor Farm Supply502Milho para alimentação Sistema
Microinjeção WCR (Caseiro)NAPeças e instruções disponíveis mediante solicitaçãoControla a pressão de injeção (0-20 psi)
Elmer's Non-toxic GlueElmer's Products, Inc.E304Cole ovos em papel de filtro
epTIPS Microloader TipsEppendorfC2554691Pontas de carregamento de agulhas de aterro
Falcon Tissue Culture PlatesFalcon25383-103Milho germinado /150 x 25 mm
Fisherbrand  Círculos de Papel de Filtro de Grau QuantitativoFisher ScientificS47576CPrato de Fazer ágar para postura de ovos/9cm
SparkleenFisher Scientific04-320-4Lavar pratos
Lâminas de Microscópio SimplesFisher Scientific12-549-3Segurando papel de filtro e ovos para microinjeção
Verme da Raiz do Milho Ocidental sem Substituto de PólenFrontier Agricultural Sciences F9766BWCR Bolas de Algodão para Dieta Artificial para Adultos
, GrandesGenesee Scientific51-101Feche o frasco
Pipetas de Transferência de Bulbo Pequeno Globe Scientific 3.0 mLGlobe Scientific137035Colete e transfira ovos
Estereomicroscópio de Fluorescência Leica M165 FC LeicaM165 FC Triagem WCR
Conjunto de Filtros DsRed para Estereomicroscópio de FluorescênciaLeicaDSRFiltro de excitação: 510-560 nm, filtro de emissão: 590-650 nm
Filtro EGFPLeicaGFP2Filtro de excitação: 440– 520 nm, filtro de emissão: 510 nm
BugDormMegaView ScienceDP1000_5PCage para colônia adulta
Pincel de pintura miniaturaMyArtscapeMAS-102-MINILiner 2/0 
Micromanipulador de JoystickNarishigeMN-151Micromanipulador e porta-agulha
Microscópio XY StageOlympus265515Microscópio stage (adaptado para uso com estereoscópio)
Gaze de Grau 90Loja Online de TecidosCHEE90Para Egg-Lay
Filme de parafina de plástico Embalagem Plástica PechineyPM-996Selar prato de ágar após microinjeção/Tamanho do rolo 4 in. x 125 pés
IncubadoraPercival de Crescimento WCR I41VLH3C8 (incubadora de criação de insetos)
Frascos Erlenmeyer de Boca EstreitaVWR4980-300-PKRecipiente de água para colônia adulta 
Copos de Forma Baixa GriffinVWR1000-600-PKPara Lavagem
Ovos Rolos de Algodão TrançadoRichmond Dental Cotton Co.605-3599Uso no abastecimento de água para colônias de adultos 
Placas de Petri (35x10mm)SIGMACLS430588-500EAPara placas de dieta
Fenol VermelhoSigma143-78-8Tampão de microinjeção
Extrator de micropipeta baseado em laserInstrumento SutterP-2000/GExtrator de agulhas/Calor = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100
Solo superficial premiumThe Scotts Company71130758Solo para cultivo
de cronSacos com zíper Reloc Zippit 2 MilUnited States Plastic Corporation48342Saco de ágar após microinjeção/5x7
Placas de Petri (100x15m)VWR89038-968Fazendo prato de ágar para postura de ovos/ Recipientes de 100 x 15 mm
6 ozWebstaurantstore128E506WCR câmara de acoplamento de par único 
Recipientes de 38 ozWebstaurantstore128NC888Caixa de criação de larvas/38 oz
ChoiceHD 16 oz. Recipiente de plástico translúcido para micro-ondasWebstaurantstore128HRD16Caixa de criação de larvas/16 oz
Escopo de microinjeção Wild HeerbruggWILD-M8Escopo de microinjeção equipado com um estágio XY
Capilares de vidro padrãoWorld Precision Instruments1B100F-4Agulhas de microinjeção
Vermes da raiz do milho ocidentaladulto North Centeral Pesquisa aquícola LaboratórioCepa não diapaseSolicitação do laboratório do Dr. Bryan Wade French
Kit Midi de DNA de plasmídeoQiagen12143Purificação de DNAs de plasmídeo prontos para injeção
de Câmara de

Referências

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