Method Article

Microinjeção de Western milho repele, Diabrotica virgifera virgifera, embriões de transformação da linha germinal, ou edição de genoma CRISPR/Cas9

DOI:

10.3791/57497

⸱

April 27th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology and Plant Pathology, North Carolina State University

In This Article

Summary

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Aqui nós apresentamos protocolos para coletando e microinjecting precellular milho ocidental embriões repele com a finalidade de realizar ensaios funcionais-genômica como germline transformação e edição de CRISPR/Cas9-genoma.

Abstract

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Repele o milho (RPT) é uma importante praga do milho e é conhecida por sua capacidade de rapidamente se adaptar às estratégias de manejo de pragas. Embora o RNA de interferência (RNAi) provou para ser uma poderosa ferramenta para estudar Biologia WCR, tem suas limitações. Especificamente, RNAi em si é transitório (ou seja, não resulta em longo prazo mendeliana do fenótipo associado), e exige saber a sequência de DNA do gene alvo. Este último pode ser um fator limitante se o fenótipo de interesse é controlado por genes mal conservados, ou mesmo romance, porque identificar alvos úteis ia ser um desafio, se não impossível. Portanto, o número de ferramentas caixa de ferramentas genômicas do WCR deve ser expandido pelo desenvolvimento de métodos que pode ser usada para criar cepas mutantes estáveis e permitir pesquisas independentes de sequência do genoma WCR. Neste documento, detalhamos os métodos usados para coletar e microinjeção precellular WCR os embriões com ácidos nucleicos. Enquanto os protocolos descritos visam a criação de transgénico WCR, edição de CRISPR/Cas9-genoma poderia também ser realizada utilizando os mesmos protocolos, com a única diferença é a composição da solução injetada os embriões.

Introduction

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Repele do milho ocidental (RPT), Diabrotica virgifera virgifera, é uma praga importante do milho1. Curiosamente, WCR aparece superar o controle mede mais rapidamente do que as pragas mais agrícolas, desde que eles não só se adaptar fisiologicamente mas também comportamentalmente2,3,4,5, 6. na última década, o RNA de interferência (RNAi), uma poderosa ferramenta de genômica funcional, foi investigado como um método de controle potencial para WCR7....

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Protocol

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1. nível de colônia de criação dos adultos WCR

  1. Obter uma quantidade suficiente de adultos WCR (500-1.000) de um laboratório confiável de empresa ou de pesquisa (ver Tabela de materiais para obter um exemplo) e coloque em uma gaiola de3 30 cm.
    Nota: O uso de uma cepa não-diapausing é altamente recomendado.
  2. Preparar a dieta artificial WCR, seguindo o protocolo do fabricante e despeje uma camada de 1 cm de espessura em um recipiente de 38 oz (ver Tabela de materiais). Após a mistura, armazene dieta não utilizada a 4 ° C por até 2 meses.
  3. Colocar uma placa de Petri (100 x 15 mm) com dieta adulta ....

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Results

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Uma consideração importante ao desenvolver este protocolo foi palco do desenvolvimento embrionário no momento da microinjeção. Especificamente, o germline transformação requer microinjeção de DNAs antes celularização embrionária. Isso ocorre porque o DNAs facilmente não podem atravessar as membranas celulares. Tenta visualizar os estágios do desenvolvimento embrionário WCR, usando uma mancha nuclear não tiveram sucesso porque dechorionation de embriões WCR essencialmente dissolve todas as.......

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Discussion

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Embora microinjection de WCR com dsRNAs com a finalidade de RNAi tem sido relatado9, este é o primeiro protocolo para estabelecer as melhores práticas para microinjecting precellular embriões WCR, um processo crítico para a realização da linha germinal transformação e/ou CRISPR/Cas9 genoma edição nesta espécie. Sucesso microinjeção de embriões WCR é dependente de muitos fatores, como eficiência de transformação. Discutidas a seguir estão algumas das principais questões impactando o resultado do us.......

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Disclosures

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Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

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Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do programa de pesquisa Monsanto milho Rootworm conhecimento, conceder número AG/1005 (ao MDL e YC) e fundos de start-up de MDL da NCSU. FC foi apoiado por subsídios do programa de pesquisa de conhecimento para repele de milho da Monsanto (AG/1005) e o National Science Foundation, conceda número MCB-1244772 (MDL). Os autores declaram não interesses concorrentes. FC e MDL concebido e desenhado os experimentos; FC, PW e SP realizaram os experimentos; FC e MDL analisaram os resultados; e FC, NG e MDL escreveram o manuscrito. Agradecemos a Teresa O'Leary, William Klobasa e Stephanie Gorski por sua assistência especializada em triage....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Papel de Filtro Qualitativo (Preto)Ahlstrom8613-0900Para microinjeção de ovo
Recipientes de 1 oz Talheres de Plástico Anny'sASET101Recipiente para ovos
Drosophila Agar Tipo IIApex66-103Substrato para prato de postura de ovos WCR
Fórceps Featherweight Bioquip4748Manuseio de larvas e pupas 
Clorox Regular-Bleach1Clorox44600-30770Lave milho e pratos
Trucker's Favorite YellowCoor Farm Supply502Milho para alimentação Sistema
Microinjeção WCR (Caseiro)NAPeças e instruções disponíveis mediante solicitaçãoControla a pressão de injeção (0-20 psi)
Elmer's Non-toxic GlueElmer's Products, Inc.E304Cole ovos em papel de filtro
epTIPS Microloader TipsEppendorfC2554691Pontas de carregamento de agulhas de aterro
Falcon Tissue Culture PlatesFalcon25383-103Milho germinado /150 x 25 mm
Fisherbrand  Círculos de Papel de Filtro de Grau QuantitativoFisher ScientificS47576CPrato de Fazer ágar para postura de ovos/9cm
SparkleenFisher Scientific04-320-4Lavar pratos
Lâminas de Microscópio SimplesFisher Scientific12-549-3Segurando papel de filtro e ovos para microinjeção
Verme da Raiz do Milho Ocidental sem Substituto de PólenFrontier Agricultural Sciences F9766BWCR Bolas de Algodão para Dieta Artificial para Adultos
, GrandesGenesee Scientific51-101Feche o frasco
Pipetas de Transferência de Bulbo Pequeno Globe Scientific 3.0 mLGlobe Scientific137035Colete e transfira ovos
Estereomicroscópio de Fluorescência Leica M165 FC LeicaM165 FC Triagem WCR
Conjunto de Filtros DsRed para Estereomicroscópio de FluorescênciaLeicaDSRFiltro de excitação: 510-560 nm, filtro de emissão: 590-650 nm
Filtro EGFPLeicaGFP2Filtro de excitação: 440– 520 nm, filtro de emissão: 510 nm
BugDormMegaView ScienceDP1000_5PCage para colônia adulta
Pincel de pintura miniaturaMyArtscapeMAS-102-MINILiner 2/0 
Micromanipulador de JoystickNarishigeMN-151Micromanipulador e porta-agulha
Microscópio XY StageOlympus265515Microscópio stage (adaptado para uso com estereoscópio)
Gaze de Grau 90Loja Online de TecidosCHEE90Para Egg-Lay
Filme de parafina de plástico Embalagem Plástica PechineyPM-996Selar prato de ágar após microinjeção/Tamanho do rolo 4 in. x 125 pés
IncubadoraPercival de Crescimento WCR I41VLH3C8 (incubadora de criação de insetos)
Frascos Erlenmeyer de Boca EstreitaVWR4980-300-PKRecipiente de água para colônia adulta 
Copos de Forma Baixa GriffinVWR1000-600-PKPara Lavagem
Ovos Rolos de Algodão TrançadoRichmond Dental Cotton Co.605-3599Uso no abastecimento de água para colônias de adultos 
Placas de Petri (35x10mm)SIGMACLS430588-500EAPara placas de dieta
Fenol VermelhoSigma143-78-8Tampão de microinjeção
Extrator de micropipeta baseado em laserInstrumento SutterP-2000/GExtrator de agulhas/Calor = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100
Solo superficial premiumThe Scotts Company71130758Solo para cultivo
de cronSacos com zíper Reloc Zippit 2 MilUnited States Plastic Corporation48342Saco de ágar após microinjeção/5x7
Placas de Petri (100x15m)VWR89038-968Fazendo prato de ágar para postura de ovos/ Recipientes de 100 x 15 mm
6 ozWebstaurantstore128E506WCR câmara de acoplamento de par único 
Recipientes de 38 ozWebstaurantstore128NC888Caixa de criação de larvas/38 oz
ChoiceHD 16 oz. Recipiente de plástico translúcido para micro-ondasWebstaurantstore128HRD16Caixa de criação de larvas/16 oz
Escopo de microinjeção Wild HeerbruggWILD-M8Escopo de microinjeção equipado com um estágio XY
Capilares de vidro padrãoWorld Precision Instruments1B100F-4Agulhas de microinjeção
Vermes da raiz do milho ocidentaladulto North Centeral Pesquisa aquícola LaboratórioCepa não diapaseSolicitação do laboratório do Dr. Bryan Wade French
Kit Midi de DNA de plasmídeoQiagen12143Purificação de DNAs de plasmídeo prontos para injeção
de Câmara de

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. Adaptation and Invasiveness of Western Corn Rootworm: Intensifying Research on a Worsening Pest. Annual Review of Entomology. 54, 303-321 (2009).
  2. Gassmann, A. J., Petzold-Maxwell, J. L., Keweshan, R. S., Dunbar, M. W.

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Western Corn RootwormEmbryo MicroinjectionGermline TransformationCRISPR Cas9 Genome EditingPlasmid InjectionBorosilicate NeedlesMicromanipulator TechniqueEgg Collection ProtocolEmbryo PreparationLarval Rearing

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