O Lambda selecione cII sistema de deteção de mutação

Summary

Descreveremos um protocolo detalhado para o ensaio de mutação de cII Lambda selecione em culturas de células de roedores transgênicos ou correspondentes animais tratados com um agente químico/físico de interesse. Esta abordagem tem sido amplamente utilizada para testes de mutagenicidade de substâncias cancerígenas em células de mamíferos.

Abstract

Um número de modelos de animais transgênicos e sistemas de deteção de mutação foram desenvolvido para testes de mutagenicidade de substâncias cancerígenas em células de mamíferos. Destes, ratos transgénicos e o Lambda (λ) Select cII sistema de deteção de mutação têm sido empregadas para experimentos de mutagenicidade por muitos grupos de pesquisa em todo o mundo. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para o ensaio de mutação de cII selecione Lambda, que pode ser aplicado às células cultivadas de mouses/ratos transgénicos ou os correspondentes animais tratados com um agente químico/físico de interesse. O protocolo consiste das seguintes etapas: (1) isolamento do DNA genômico das células ou tecidos/órgãos de animais transgénicos trataram em vitro ou na vivo, respectivamente, com um composto de teste; (2) recuperação do vetor shuttle lambda carreg um gene repórter mutacional (ou seja, cII transgene) partir do DNA genômico; (3) embalagem dos vetores resgatados em bacteriófagos infecciosas; (4) infectar uma bactéria de acolhimento e cultivo seletivo condições para permitir a propagação das mutações induzidas cII ; e (5) marcando a cII-mutantes e DNA sequência análise para determinar a frequência de mutação cII e espectro de mutação, respectivamente.

Introduction

Uma ampla gama de modelos de animais transgênicos e sistemas de deteção de mutação foram desenvolvidos para testes de mutagenicidade de substâncias cancerígenas em células de mamíferos. Destes, ratos transgénicos Big Blue (referido daqui em diante como BB) e o λ Select cII sistema de deteção de mutação têm sido empregadas para experimentos de mutagenicidade por este grupo e muitos outros pesquisa grupos em todo o mundo^{1,2, 3,4,5,6,7}

Protocol

1. isolamento do DNA genômica de fibroblastos embrionários de Mouse

Nota: Fibroblastos embrionários de mouse principal são isolados de embriões derivados de ratos transgénicos BB com fundo genético C57BL/6, de acordo com o protocolo publicado⁵³. A matéria-prima para este protocolo consiste de 1 x 10⁶ a 1 x 10⁷ células de fibroblasto embrionário tratados com um teste composto versus controle. A colheita e a contagem destas células usando os métodos padrão são descritos em referências^10,54,55.

....

Results

Dependendo da distribuição de dados, testes paramétricos ou não-paramétricos são usados para determinar a importância da diferença na frequência de mutação a cII entre os grupos tratamento e controle (ou seja, induzida contra frequências mutantes espontâneas) . Comparação das frequências induzidas cII mutante entre grupos diferentes de tratamento é feita por vários (emparelhada) testes estatísticos, conforme aplicável. Teste de Adams e Skopek hipergeométrica é c.......

Discussion

O ensaio de Select cII λ é usado para detecção de mutações no transgene cII recuperadas o DNA genômico de células derivadas de tecidos/órgãos de roedores de BB³. O genoma destes animais transgénicos contém várias cópias em tandem do vetor cromossomicamente integrado λLIZ shuttle, que transporta a cII (294 bp) e Laureano (1.080 bp) transgenes, como o repórter mutacional genes^{1, 2 ,}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
	Ágar MO Bio Laboratórios, Inc.	12112-05
Kit de sequenciamento de ciclo BigDye Terminator v3.1	Thermo Fisher Scientific	4337455	Nenhum
Peptona de caseína	Alfa Aesar	H26557	Nenhum
Gelatina	J. T. Baker	2124-01	Glicerol em pó
	Fisher Scientific	BP 229-1 / M-13750	Nenhum
LB Agar	Fisher Scientific	BP 9724-500	Nenhum
Kit de purificação de PCR QIAquick	Qiagen	8104	50 reações de purificação de PCR
Acetato de Sódio Trihidratado	Fisher Scientific	M-15756	Nenhum
Taq5000 DNA Polimerase	Qiagen	201207	None
Cloridrato de tiamina	Macron Fine Chemicals	2722-57	Nenhum
Extrato de embalagem Transpack	Stratagene Corp., Adquirida pela BioReliance | Sigma-Aldrich Corp.	200223	50 reações de embalagem
Tris Base	Fisher Scientific	BP 152-1 / EC 201-064-4	Nenhuma
Trypton	Biosciences	RC-110	Nenhuma