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Isolamento e caracterização de vesículas extracelulares de adultos Schistosoma japonicum

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DOI:

10.3791/57514

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22 de maio de 2018

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1Shanghai Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Animal Parasitology, Ministry of Agriculture, 2Tianjin Agricultural University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para descrever o isolamento de vesículas extracelulares (EVs) em vitro culta médio de adultos Schistosoma japonicum.

Resumo

Vesículas extracelulares (EVs) são vesículas membranosas lançadas por uma variedade de células no microambiente extracelular. SVE representa uma população de vesículas heterogêneas, cujo intervalo de tamanho entre 40 e 1.000 nm. Evidências acumuladas indicaram que EVs desempenham importantes funções reguladoras em interações patógeno-hospedeiro. Uma compreensão profunda da esquistossomíase EVs deve fornecer insights sobre os mecanismos subjacentes interações esquistossomíase-host, permitindo o desenvolvimento de novas estratégias contra a esquistossomose. Aqui, pretendemos estudar mais EVs funções em schistosomes apresentando um protocolo para o isolamento e caracterização de EVs de adultos Schistosoma japonicum (S. japonicum). SVE foram isolados em vitro o meio de cultura usando centrifugação combinada com um kit de isolamento exossomo comercial. Os isolados de S. japonicum EVs (SjEVs) normalmente possuem um diâmetro de 100-400 nm e são caracterizadas por microscopia eletrônica de transmissão e mancha ocidental. O uso de PKH67 SjEVs de tingir-etiquetados demonstrou que SjEVs são internalizados pelas células destinatários. No geral, o nosso protocolo fornece um método alternativo para isolar EVs de schistosomes adultos; o SjEVs isolado pode ser adequado para análise funcional.

Introdução

Vesículas extracelulares (EVs) são uma população de pequenas vesículas de membrana-limite encapsulado com várias proteínas, lípidos e ácidos nucleicos. Estudos recentes demonstraram que EVs desempenham um papel crucial na comunicação célula-célula e estão envolvidos na regulação de numerosos processos fisiológicos, incluindo desenvolvimento de célula, regulamento imune, angiogênese e da migração celular2, 3,4,5. Acumular evidências indica que EVs, circulando exosomes e sua carga de miRNA representa potenciais biomarcadores de determinadas doenças6.

Vários protozoários como Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruzie Leishmania spp., foram mostrados para ser capaz de secretar EVs; Além disso foram encontrados helmintos de secretar EVs em vivo hospeda7. EVs parasitárias foram mostrados para ser envolvido na manutenção da infecção, patogenicidade8e imune regra9. Recentes estudos em schistosomes ambos Schistosoma mansoni (S. mansoni) 10,11 e S. japonicum12 têm indicado que adultos schistosomes secretam exossomo como vesículas que podem ser envolvidos na regulamentação funcional de processos biológicos específicos.

Até à data, vários métodos têm sido utilizados para isolar vesículas extracelulares, tais como ultracentrifugação, ultrafiltração13, o uso de reagentes baseado em polímero, cromatografia de exclusão-tamanho e isolamento de immunoaffinity. Esses métodos diferentes possuem suas próprias vantagens e limitações de14. Geralmente, a ultracentrifugação é considerada o método padrão-ouro para isolamento de vesículas. No entanto, este método sofre a limitação do potencial de agregação de EV14.

Em schistosomes, foram relatados alguns métodos para isolamento de EV: Estes incluem ultracentrifugação11,12,10 e o uso de comerciais EV isolamento kit16 para vários estágios (ovos16, schistosomula11, schistosomes adulto10,12,17). Dado que aumentada é de uma vasta gama de tamanho de várias centenas de nanômetros a mil nanômetros, desenvolvemos um método alternativo que combina com o uso de centrífuga de bancada e um kit de isolamento comercial EV para isolar o SVE de ultrafiltração adultos de Schistosoma japonicum. O SVE isolado normalmente possuía um diâmetro de 100-400 nm e com êxito foram internalizado pelas células destinatários.

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Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de ética local do Instituto de investigação veterinária de Shanghai, Academia Chinesa de Ciências agrárias (número de licença: SHVRIAU-14-0101).

1. cultura in Vitro de Schistosomes

Nota: Schistosomes representam um risco biológico. Os trabalhadores devem usar luvas de látex vezes quando manipulação vermes, suspensões esquistossomóticos ou outros relacionados com materiais biológicos. Nova Zelândia coelhos foram infectados com cercárias ~ 2.000 via abdominal exposição. Schistosomes na fase hepática foram coletados de coelhos infectados com cercárias de S. japonicum a pós-infecção 28 dias por perfusão de fígado e veias mesentéricas. Os procedimentos de coleta de verme tem sido referenciados em publicações anteriores, relatórios de estudos em ratos18.

  1. Recolha os parasitas em um copo de 500 mL. Lave-as e delicadamente 3 x 200 ml de pré-aquecido (37 ° C) PBS (pH 7,4).
  2. Separe pares de worm ~ 200 para cada prato de Petri de 90 mm. Então lave os parasitas e suavemente 2x com 50 mL de pré-aquecido (37 ° C) meio de cultura RPMI 1640 contendo 100 U de penicilina e 100 mg/mL de estreptomicina.
  3. Manter parasitas em 40 mL de meio de cultura RPMI-1640 pré-aquecido sem antibióticos a 37 ° C, abaixo dos 5% de CO2 em uma densidade de ~ 5 worm pares /mL para 2 h em 90 mm Petri dish.
    Notas: O meio RPMI 1640 não deve conter soro, caso contrário serão introduzida exógena vesículas extracelulares.

2. previamente tratada condição Media

  1. Recolher o meio de cultura e centrifugar o médio a 4 ° C, a 2.000 × g por 30 min remover os ovos e detritos tegmental de verme.
  2. Transferir o sobrenadante para um tubo de fresco e em seguida filtrar a solução através de um filtro de seringa 0,22 µm.
  3. Recolher a solução filtrada em um saco dializado (corte de peso molecular: 3.5kD) e em seguida Dialize a solução usando solução a 8% PEG8000 a 4 ° C durante a noite.
    Notas: Este passo é importante para enriquecer SjEVs para aumentar o rendimento de isolamento SjEVs.

3. isolamento de SjEVs

  1. Transferir a solução dializada para um novo tubo e adicione 0,5 volumes do reagente exossomo total isolamento.
  2. Misture a solução bem pela utilização do Vortex ou pipetagem para cima e para baixo para garantir a homogeneidade da solução.
  3. Incube a mistura entre 2 ° C a 8 ° C durante a noite.
  4. Centrifugue a mistura a 15.000 × g, durante 1 h, 2 ° c e 8 ° c.
  5. Aspirar e desprezar o sobrenadante.
    Notas: SVE constam o sedimento no fundo do tubo (não visível na maioria dos casos).
  6. Resuspenda o pellet EVs em 2 mL de PBS e em seguida armazenar a solução EVs a-80 ° C até uma análise mais aprofundada.

4. caracterização de EVs pela mancha ocidental

  1. Determine a concentração de proteína da amostra SjEVs, por exemplo, por meio de ensaio BCA.
  2. Prepare-se 10-20 µ g de EVs no buffer RIPA 22,5 µ l. Em seguida, adicione 7,5 µ l de 4x carregando buffer e calor durante 5 min à 95 ° C.
  3. Separe as proteínas SjEVs por gel de SDS-PAGE 12%.
  4. Transferência das proteínas à membrana PVDF e então sonda com anticorpos anti-CD63 (1:1, 000 diluição), seguidos por sondagem com IgG de coelho anti-HRP (1:5, 000 diluição).
  5. Utilizar o reagente de detecção de ECL para desenvolvimento de membrana e detectar os sinais por uma sistema de imagem de quimioluminescência.

5. caracterização de EVs por microscopia eletrônica de transmissão

  1. Adicionar 2 µ l de SjEVs isolado para 200 malha revestida formvar grades e depois deixe-o secar à temperatura ambiente.
  2. Mancha com 2% de ácido fosfotúngstico por 1 min e depois deixe-o secar à temperatura ambiente.
  3. Carregar as grades para porta-amostras de microscópio de elétron da transmissão e exposto a um feixe de elétrons 80 kV para captura de imagem.

6. SjEVs rótulo com PKH67 e ensaio de absorção de células

Notas: Todas as etapas subsequentes foram realizadas à temperatura ambiente (20-25 ° C), salvo indicação em contrário.

  1. Transferência de 5 µ g SjEVs solução para um tubo de polipropileno de fundo cónico e ajustar o volume de 12 mL pela adição de meio RPMI 1640.
  2. Centrifugue a SjEVs a 110.000 × g por 90 min a 4 ° C para SjEVs de Pelotas.
  3. Após a centrifugação, Aspire cuidadosamente o sobrenadante.
    Nota: A tintura de etanol PKH67 não deve ser adicionada diretamente para a pelota de SjEV, pois isso iria resultar em coloração heterogênea e viabilidade celular reduzida.
  4. Preparar uma solução a suspensão EV 2x, adicionando 1 mL de diluente C ao pellet SjEV; para garantir a completa dispersão, resuspenda com suave pipetagem.
  5. Antes de coloração em diluente C, prepare um fresco 2 x tintura solução adicionando 2 µ l da solução etanólica de tintura de PKH67 para 1 mL de diluente C num tubo de centrífuga de polipropileno e mistura bem para dispersar.
  6. Adicione rapidamente a 1 mL de 2x suspensão EV (etapa 6.4) a 1 mL de 2 x solução corante (passo 6.5) e imediatamente misture a amostra por pipetagem.
  7. Incube a mistura à temperatura ambiente durante 4 min.
  8. Parar a coloração adicionando 4 mL de FBS e então incubar durante 1 min.
  9. Adicione meio RPMI1640 para ajustar o volume de 12 mL e então centrifugar a 110.000 × g a 4 ° C por 90 min.
  10. Remover o sobrenadante e adicionar meio RPMI1640 para Ressuspender o PKH67 rotulado SjEV Pelotas.
  11. Centrifugar a 110.000 × g a 4 ° C por 90 min lavar uma vez e então adicione o PBS para Ressuspender as pelotas de SjEVs.

7. ensaio de absorção de células SjEVs

  1. Células de mamíferos de semente como NCTC clonagem células 1469 ou HEK293T em placas boas 6 (2 × 105 células por poço) e cultura das células durante a noite.
  2. Adicionar 5 µ g SjEVs PKH67-rotulados e cultura então células a 37 ° C, durante 2-4 h.
  3. Após a incubação, remover o meio e lavar as células com PBS duas vezes.
  4. Consertar as células com solução de formol 4% por 15 min e lavado duas vezes mais com PBS.
  5. Mancha do núcleo de células com 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
  6. Observe as células usando microscopia de fluorescência.

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Resultados

Para quantificar o rendimento de SjEVs isolado usando o protocolo descrito, costumávamos ensaio da proteína BCA para acessar a concentração de proteína da SjEVs isolada de adultos schistosomes 28 dias. Conforme mostrado na tabela 1, a concentração de proteína SjEV variou de 208 µ g a 250 µ g por 100 mL de meio (tabela 1). O tamanho de partícula, conforme determinado pela análise de nanopartículas de Malvern, indicou que o isolado SjEVs variou de 100 nm a ...

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Discussão

Estudos recentes sobre EVs têm demonstrado que esquistossomíase que EVS desempenham um papel importante nas interações patógeno-hospedeiro3,9,12,de16. Para endereço ainda mais suas funções reguladoras, é essencial para isolar EVs de schistosomes. Aqui, descrevemos um método alternativo para SjEV isolamento. Este método produz um tamanho de ampla gama de SjEVs, de 100 nm a 400 nm, em adultos

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este estudo foi, em parte ou no todo, suporte Nacional Natural Science Foundation da China (31472187 e 31672550) e a ciência agrícola e programa de inovação de tecnologia da Academia Chinesa de Ciências agrárias.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Material
Reagente de isolamento de exossomos totais (a partir de meios de cultura de células)ThermoFisher 4478359 CIENTÍFICOPara isolar vesículas extracelulares de S. japonicum
PKH67Sigma-aldrichMINI67Para rotulagem Evs
RPMI 1640 MédioThermoFisher SCIENTIFIC11875119Para cultura de parasitas
Penicilina-EstreptomicinaThermoFisher SCIENTIFIC15140122
0.22μ Filtro de seringa MMerckSLGP033RB
SnakeSkinThermo SCIENTIFIC68035
PEG8000Sangon BiotechA100159 
RIPABeyotimeP0013B
EMD Millipore™ Imóveis&comércio; Substrato de HRP Quimioluminescente Ocidental (ECL)Fisher scientificWBKLS0100 
DAPI Cell Signaling Technology4083
BCA kitBeyotimeP0010
CD63 anticorposSangon BiotechD160973-0025
PVDFBio-Rad1704273
Formvar / Carbon 400 meshTed Pella01754-F
Ácido fosfotúngsticoTed Pella19402
clone anti-camundongo IgG-HRPCWBIOCW0102
NCTC 1469 célulasATCCATCC® CCL-9.1™
FBSHyCloneSV30087.02
Equipments
imagem de imagem de quimioluminescênciaGEImageQuant LAS4000mini
Microscopia eletrônica de transmissãoHitachiH-7600
Milli-Q águaMilli-Q Milli-QElix
Eppendor CentrífugaCentrífuga Eppendorf5804R
Zetasizer NanoMalvernZetasizer Nano ZS 
UltracentrífugaBeckmanOptima L-100 XP Incubadora de Ultracentrífuga
ESCOCCL-107B
MicroscópioZeissZeiss Axin Observer Z1
Tubo de Diálise GE sistema de

Referências

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