Artigo de método

Análise de Toeprinting de formação do complexo iniciação tradução de mRNAs mamíferos

DOI:

10.3791/57519

⸱

10 de maio de 2018

 , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, Alberta RNA Research and Training Institute, University of Lethbridge, 2Department of Neuroscience and the Canadian Centre for Behavioral Neuroscience (CCBN), University of Lethbridge, 3Arnie Charbonneau Cancer Institute, University of Calgary

Neste artigo

Resumo

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Toeprinting visa medir a capacidade de in vitro transcrito de RNA para formar complexos de iniciação de tradução com ribossomas sob uma variedade de condições. Este protocolo descreve um método para mamíferos RNA toeprinting e pode ser usado para estudar a tradução tanto cap-dependente e IRES-driven.

Resumo

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Iniciação da tradução é a etapa limitante da síntese de proteínas e representa um ponto-chave na qual células regulam a produção de proteína. Regulação da síntese de proteínas é a chave para a resposta de estresse celular e desregulação é central para muitos Estados de doença, como o câncer. Por exemplo, embora o estresse celular leva para a inibição da tradução global pela atenuante cap-dependente iniciação, certas proteínas de estresse-resposta seletivamente são traduzidas em uma forma independente de cap. Discreto do RNA dos elementos reguladores, tais como sites de entrada celular Ribossoma interno (IRESes), permitem a tradução destes mRNAs específicos. Identificação de tais mRNAs e a caracterização dos seus mecanismos reguladores, tem sido uma área-chave em biologia molecular. Toeprinting é um método para o estudo da estrutura do RNA e função no que tange a iniciação da tradução. O objetivo do toeprinting é avaliar a capacidade do in vitro transcrito de RNA para formar complexos estáveis com ribossomas sob uma variedade de condições, a fim de determinar quais sequências, elementos estruturais ou acessórios fatores estão envolvidos no Ribossoma ligação — um pré-cursor para a iniciação da tradução eficiente. Ao lado de outras técnicas, tais como análise ocidental e polysome de perfil, toeprinting permite uma caracterização robusta de mecanismos para a regulação da iniciação da tradução.

Introdução

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Como tradução consome energia mais celular, faz sentido que a tradução é fortemente regulamentado1. Por outro lado, a desregulação da tradução- e as consequentes alterações na saída de proteína-é frequentemente observada nos Estados-resposta ao estresse e doenças, como câncer,1,2. Uma grande vantagem do controle de translação é a velocidade com que as células podem alterar sua saída de proteína para responder a vários estímulos3. Regulamento de tradução, portanto, representa um importante mecanismo que pode influenciar a sobrevivência da pilha e morte1,2,3. As etapas da tradução, a iniciação é o mais altamente regulamentado e complexo3. Brevemente, mais eucarióticos mRNAs contêm uma 5' m7G tampa que quase sempre é essencial para a sua tradução. Cap-dependente iniciação requer iniciação eucariótico fatores eIF4E, eIF4A e eIF4G (o complexo cap-reconhecimento) para interagir com a extremidade 5' do mRNA. 43S preinitiation ribosome complexo, que contém o limite eIF2 iniciador tRNA e eIF3, é recrutado à extremidade 5' do mRNA através de uma interação de eIF4G com eIF3. A complexo de pré-iniciação é pensada para fazer a varredura do mRNA, auxiliado por eIF4A (um RNA helicase) até que o códon de início (AUG) está localizado. A complexo de iniciação 48S posteriormente é formada e tRNA é entregue para o P-site do ribosome. Finalmente, as subunidades 60S e 40S do Ribossoma são Unidas para formar o início dos anos 80 complexo, seguido de tradução alongamento1,3,4. Em contraste, sites de entrada interno Ribossoma (IRESes) contornar a exigência de uma 5' cap, recrutando a subunidade ribossomal 40S diretamente para o codão de iniciação3. Condições de estresse fisiológico atenuam global tradução de mRNA devido a modificações dos fatores chave geral iniciação eucariótico (eIFs). No entanto, mecanismos de iniciação da tradução não-canônicos permitam tradução seletiva de certos mRNAs que muitas vezes codificam proteínas de estresse-resposta, e desregulação da iniciação da tradução não-canônicos está implicada em doenças como o câncer 1 , 2. elementos reguladores de RNA discreto, tais como IRESes celular, permitam a tradução de tais mRNAs2,3.

Um aspecto particularmente interessante de controle de translação é compreender os mecanismos da canonical versus não-canônicos tradução de um mRNA determinado. Toeprinting é uma técnica que permite o estudo detalhado e mecanicista de iniciação da tradução de RNAs específicos in vitro. O objectivo geral de toeprinting é para avaliar a capacidade de um RNA de interesse de nucleada a formação de um início de tradução complexa com o ribossoma sob uma variedade de condições, a fim de determinar quais sequências, elementos estruturais ou acessório fatores são necessários para a iniciação da tradução eficiente. Por exemplo, recrutamento de Ribossoma pode ser prejudicado na ausência de um cap 5' mas estimulado pela presença de um IRES.

O princípio da técnica é in vitro transcrever um RNA de interesse, incube-lo na presença de extratos celulares contendo componentes de tradução (ou os componentes purificados) para permitir que transcrevem complexos de iniciação ao formulário e para reverter o RNA com um primer específico. Complexos estáveis de RNA-Ribossoma causará a transcrição reversa de empatar na extremidade 3' do Ribossoma, o so-called 'toeprint'5,6,7.

No presente protocolo, subunidades ribossomais, eIFs, os tRNAs e IRES trans-fatores de atuação (ITAFs) são convenientemente contribuídos por Reticulócito coelho lisado (RRL). Outra vantagem deste protocolo é o uso de um primer fluorescente-etiquetadas e Imageador de fluorescência com base em gel, ao invés de um primer radiolabeled. Isso elimina etapas extras, incluindo radioativos o primer, bem como a secagem do gel e expô-lo a uma intensificação da tela. As bandas fluorescentes são registadas em tempo real, como a execução de gel, permitindo a maior resolução. Destampada ligada ao X inibidor da apoptose RNA de IRES de proteína (XIAP) é usado como exemplo aqui, apesar de mRNAs tampados também podem ser analisados por esta técnica8.

Ao contrário da análise ocidental, que mede a saída final do processo de tradução em lisados celulares, toeprinting é uma abordagem in vitro para medir a formação do complexo tradução iniciação em um RNA. Esta abordagem reducionista permite o estudo altamente detalhado de substratos ou fatores que regulam a iniciação da tradução (EG., tampadas ou un-tampado mRNA, IRES estrutura, presença ou ausência de cauda poli-A, disposição de fatores específicos da proteína, etc.). Daí, toeprinting pode ser usado para estudar os diferentes modos de tradução8 ou os efeitos das estruturas de mRNA, tais como IRESes, na síntese de proteína9,10.

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Protocolo

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Nota: O RNA é altamente suscetível à degradação por ribonucleases (RNases). Tome precauções padrão para manter o RNA intacto. Luvas mudam com frequência. Utilize pontas de pipetas filtrada, plasticware nuclease-free e livre de nuclease produtos químicos em todas as etapas do protocolo. Utilização livre de nuclease ou pyrocarbonate de dietilo (DEPC)-tratamento de água para todas as soluções.

1. preparação de soluções

  1. Preparar o tampão de Toeprinting: 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), KOAc, 2.5 mM Mg(OAc)2, 5% (p/v) de sacarose, espermidina ditiotreitol (DTT) e 0,5 mM de 2 mM a 100 mM.
    1. Loja TDT e espermidina em alíquotas de uso único, a-20 ° C para evitar ciclos repetidos de congelamento-descongelamento.
      Nota: TDT e espermidina devem ser adicionados para o buffer de toeprinting, imediatamente antes do uso. Uma solução sem TDT e espermidina pode ser armazenada a-20 ° C.
  2. Prepare alíquotas de 85 mM 5'-guanylyl imidodiphosphate (GMP-PNP) e 91 mM trifosfato de adenosina (ATP). Armazenar as alíquotas a-20 ° C.
  3. Preparar 450 mL de mistura de gel de 6% poliacrilamida - 7m ureia: 67,5 mL de acrylamide:bis de 40%-acrilamida (19:1), 189 g de ureia, 112,5 mL de 5 x TBE (Tris/borato/thylenediaminetetraacetic ácido (EDTA)) e 120 mL de água. Dissolva a ureia por aquecimento em banho maria a 37 ° C ou em um prato quente com agitação. Filtrar a solução (por exemplo., 0,2 μm filtro de vácuo de nitrocelulose).
    Nota: A solução pode ser armazenada a 4 ° C, durante pelo menos um mês.
    Cuidado: Acrilamida monomérica é uma neurotoxina que pode ser absorvida através da pele. Tome muito cuidado para evitar o contacto com a pele (i. e., um jaleco, luvas e proteção do olho). Poliacrilamida também deve ser manipulada com cuidado, como polimerização não pode proceder à realização de 100%.
  4. Preparar o formamide tintura de carregamento: 95% formamida, 18 mM EDTA, 0.025% (p/v) Dodecil sulfato de sódio (SDS), 0.025% (p/v) de azul de bromofenol, xileno cianol de 0.025% (p/v). Loja a-20 ° C.
  5. Dissolva 1 nmol de primer (5' CTCGATATGTGCATCTGTA; 5' fim-etiquetadas com 800 IRDye) em 100 μL de água para uma concentração de trabalho de 10 pmol/μL. Armazenar a-20 ° C em alíquotas de uso único (cerca de 10 µ l), protegido da luz.

2. preparação do mRNA

  1. Modelos de DNA para a síntese de mRNA pela reação em cadeia do polymerase (PCR) de modelos apropriados de amplificar (i. e., DNA genômico ou Plasmídeo, conforme o caso). Usar uma alta fidelidade DNA polimerase de acordo com as instruções do fabricante, com as seguintes condições de reação (35 ciclos): derreter, 98 ° C, 10 s; recoze, 53 ° C, 20 s; estender, 72 ° C, 30 s.
    Nota: O primer para a frente (5' AAGCTTAATACGACTCACTATAG) incorpora a sequência do promotor T7 para permitir a transcrição do RNA; o primer reverso (5' T51GAATTCGGATCCGACCGTGG) inclui 51 resíduos de timina para fornecer uma cauda poli-A para o RNA transcrito. Observe que o RNA também pode ser em vitro transcrito do ADN do plasmídeo.
  2. Uso um kit apropriado transcrição in vitro transcrever IRES contendo RNA ou ARN tampado partir do modelo de DNA. Siga as instruções do fabricante. Prepare a amostra de RNA em volumes de reação padrão 20 μL. Tratar o RNA recém sintetizado com 2 unidades de DNase RNase-livre por 30 min a 37 ° C.
  3. Diluir o RNA DNase-tratada para 110 µ l com água livre de nuclease adicionar ácido fenol µ l 110, vórtice 5 s e centrífuga para 3 min a 20.000 x g à temperatura ambiente. Remover a 100 µ l da fase aquosa para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, adicionar 10 µ l de acetato de sódio 3M e vórtice 2 s. Add, 3 volumes de 100% de etanol, vórtice 5 s e precipitar o RNA a-20 ° C durante a noite.
  4. Centrifugar a > 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante. Lave o pellet com 500 µ l de etanol a 70% (v/v) gelada e repita a centrifugação. Aspirar o máximo do líquido sobrenadante possível e deixe secar naturalmente a pelota para 5-10 min. tenha cuidado para não deslocar o pellet.
  5. Ressuspender o RNA no volume adequado de água livre de nuclease para produzir uma trabalho de concentração de 0.5 μg/μL. Isto pode ser armazenado a-80 ° C ou usado imediatamente.

3. Toeprinting reação

  1. Mix 15 μL de coelho lisado Reticulócito (RRL, nuclease não-tratados), 1 μL (40 unidades) de inibidor de RNase, 1 µ l de 91 mM ATP (1,82 mM final) e 1 μL de 85mm GMP-PNP (final de 1,7 mM) em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Incube a 30 ° C por 5 min.
    Nota: O RRL deve ser aliquotada para uma única utilização evitar o congelamento-descongelamento repetitiva. Um controle crítico é uma reação que falta RRL, a fim de elucidar as pausas naturais da transcrição reversa devido a estrutura secundária do RNA. Adicione toeprinting reserva para substituir RRL para este controle.
  2. Adicionar 0,5 µ g (1 µ l) de RNA e incubar a 30 ° C por 5 min.
  3. Adicione 22 µ l de tampão de Toeprinting e incubar a 30 ° C por 3 min.
  4. Adicionar 0,5 µ l (5 pmol) de primer IRDye-etiquetadas e incubar no gelo por 10 min.
  5. Adicionar 2 µ l de dNTPs 25 mM (concentração final: 1 mM cada), 2 µ l de Mg(OAc)2a 100 mM, 1 µ l de aviária Myeloblastosis vírus Transcriptase reversa (AMV-RT) e 3,5 µ l de tampão de Toeprinting. O volume final é 50 μL.
  6. Incube a reação a 30 ° C, durante 45 min.
  7. Adicionar 200 µ l de água livre de nuclease e extrair imediatamente com 250 µ l de 25:24:1 fenol: clorofórmio: isoamílico álcool (pH aproximadamente 8.0). Vórtice 5 s e centrifugar 20.000 x g por 3 min à temperatura ambiente. Retirar a fase aquosa para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, adicionar 3 volumes de 100% de etanol, vórtice 5 s e precipitar a-20 ° C durante a noite.
  8. Centrifugar a > 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante. Lave o sedimento de DNA com 500 µ l de etanol a 70% (v/v) gelada. Centrifugar a > 20.000 x g durante 15 minutos a 4 ° C. Aspirado de sobrenadante, tanto quanto possível e ar seco que a pelota de 5-10 min. tenha cuidado para não deslocar o pellet.
  9. Dissolva a pelota em 6 μL de água livre de nuclease e adicionar 3 μL de formamida tintura de carregamento.

4. reações de sequenciamento de

  1. Use o modelo de DNA de 2.1 e o primer IRDye-rotulado de passo 3.4 para reações de sequenciamento padrão, usando dideoxynucleotides (ddNTPs) como terminadores de cadeia. Usar um kit de sequenciamento de DNA apropriado e siga as instruções do fabricante.
  2. Mix 6 μL de cada reação de sequenciamento com 3 μL de formamida tintura de carregamento.

5. preparação do Gel e eletroforese de sequenciamento

Nota: Este protocolo usa um Imageador de fluorescência com base em gel e um 21 x 23 cm x gel de 0,2 mm, mas pode ser adaptado para outros sequenciadores ou gel-tamanhos, se necessário.

  1. Limpe cuidadosamente os espaçadores de 0,2 mm, bem como o curto (23 x 25 cm) e tempo placas de vidro (30 × 25 cm) com 100% de etanol. Secar ao ar.
  2. Misture 30 mL de gel de ureia de poliacrilamida - 7M 6% misturar com 200 μL de persulfato de amónio de 10% (p/v) (APS) e 20 μL de tempted (TEMED). Despeje o gel, com cuidado para evitar bolhas e inserir o ' tubarão ' gel de pente. Permitir que o gel polimerizar por 1h à temperatura ambiente.
  3. Montar o aparelho de sequenciamento e encher os reservatórios com 1 x TBE.
  4. Pre-executada por 15 min em 1500 V até que seja alcançada a temperatura ideal de 55 ° C.
  5. Aqueça a mistura de corante de amostra/carregamento (a partir de passos 3.9 ou 4.2) a 85 ° C por 5 min. carga 1 μL para o gel de sequenciamento.
  6. Funcione o gel em 1500 V em 8 h. A máquina vai ler as faixas em tempo real.
  7. Desmontar o aparelho e elimine-o gel do acrilamido e buffer de execução.

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Resultados

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Descrevemos anteriormente a capacidade da IRES XIAP para apoiar a iniciação de tradução tampão-independente em vitro8,10. Toeprinting foi a chave técnica para interrogar os detalhes mecanicistas da iniciação XIAP IRES complexo. Uma construção de DNA codificação um mRNA contendo o XIAP IRES (Figura 1A) estava em vitro transcritas e submetidas a análise de toeprinting....

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Discussão

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Toeprinting é uma técnica poderosa para medir diretamente a capacidade de um RNA de interesse para apoiar a formação de complexos de iniciação da tradução em circunstâncias altamente controlados. Este protocolo descreve uma técnica simplificada para toeprinting mamíferos RNAs. Reticulócito coelho lisado (RRL) é usado como uma fonte conveniente de ribossomos, eIFs, iniciador tRNA e IRES trans-agindo fatores (ITAFs). O experimentador fornece seu RNA de escolha e também pode complementar a reação de toeprinting com...

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Divulgações

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Os autores não têm nenhum conflito de interesse de divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado por um ciências naturais e engenharia Conselho de Canadá-Discovery bolsa de investigação (05463-RGPIN-2017), a Fundação de Canadá para inovação-John R. Evans líderes fundo (35017), o programa inova do Campus Alberta e Ministério de Alberta Comércio e desenvolvimento econômico.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
DEPC (Dietil pirocarbonato)SigmaD5758-100ML
TRIS base, UltrapureJT Baker4109-01
KOAc (acetato de potássio)Bio BasicPB0438
Mg (OAc) < sub > 2< / sub> (acetato de magnésio tetrahidratado)Bio BasicMB0326
Sacarose, grau de biologia molecularCalbiochem573113-1KG
SpermidineSigma85558
GMP-PNP (Guanosina 5′-[β,&gama;-imido]trifosfato trissódico hidratado) 0,1 M soluçãoSigmaG0635
ATP (Adenosina 5′-trifosfato) sal dissódico, solução 100 mMSigmaA6559
19:1 Acrilamida: bis-acrilamida, 40%Bio BasicA0006
UreaBio BasicUB0148
, 0,2 µ mSarstedt83.1823.101
FormamidaSigmaF9037-100ML
EDTA (sal dissódico, di-hidratado)Bio BasicEB0185
SDSBio BasicSB0485
Azul de bromofenolBio BasicBDB0001
xileno cianol FFBio BasicXB0005
MEGAshortscript T7 kit de transcriçãoAmbionAM1354
mMESSAGE mMACHINE T7 kit de transcriçãoAmbionAM1344
Ácido Fenol:Clorofórmio (5:1)AmbionAM9722
25:24:1 Fenol:Clorofórmio:Álcool IsoamílicoInvitrogen15593-049
Lisado de Reticulócitos de Coelho (RRL). NÃO deve ser tratado com nuclease.Green Hectares, EUAEntre em contato com a Green Hectares, peça 1:1 RRL:água
RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µ L)Thermo FisherE00382
100 mM dNTPsInvitrogen56172, 56173, 56174, 56175Misture partes iguais para um estoque de 25 mM cada.
AMV-RT, 10 U/µ LPromegaM5101
Sequenase Versão 2.0 Kit de Sequenciamento deDNA Thermo Fisher707701KT
Modelo 4200 IR2 Analisador de DNALI-CORO produto foi descontinuado
APS (Persulfato de Amônio)Bio BasicAB0072
TEMEDBio BasicTB0508
Phusion Polimerase de Alta FidelidadeNovo Garrafa Térmica Turbo Fisher BiolabsM0530
AM2238
Unidades de filtração de topo de garrafa de 500mL da Inglaterra Biolabs

Referências

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  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
  2. Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer. Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).
  3. Sharma, D. K., Bressler, K., Patel, H., Balasingam, N., Thakor, N. Role of Eukaryotic Initiation Factors during Cellular Stress and Cancer Progression. J Nucleic Acids. 2016, 8235121(2016).
  4. Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (10), 827-835 (2004).
  5. Anthony, D. D., Merrick, W. C. Analysis of 40 S and 80 S complexes with mRNA as measured by sucrose density gradients and primer extension inhibition. J Biol Chem. 267 (3), 1554-1562 (1992).
  6. Hartz, D., McPheeters, D. S., Traut, R., Gold, L. Extension inhibition analysis of translation initiation complexes. Methods Enzymol. 164, 419-425 (1988).
  7. Shirokikh, N. E., et al. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Res. 38 (3), 15(2010).
  8. Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).
  9. Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).
  10. Thakor, N., et al. Cellular mRNA recruits the ribosome via eIF3-PABP bridge to initiate internal translation. RNA Biol. , 1-15 (2016).
  11. Thoma, C., Bergamini, G., Galy, B., Hundsdoerfer, P., Hentze, M. W. Enhancement of IRES-mediated translation of the c-myc and BiP mRNAs by the poly(A) tail is independent of intact eIF4G and PABP. Mol Cell. 15 (6), 925-935 (2004).
  12. Baird, S. D., Lewis, S. M., Turcotte, M., Holcik, M. A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites. Nucleic Acids Res. 35 (14), 4664-4677 (2007).
  13. Merrick, W. C. Evidence that a single GTP is used in the formation of 80 S initiation complexes. J Biol Chem. 254 (10), 3708-3711 (1979).
  14. Arnaud, E., et al. A New 34-Kilodalton Isoform of Human Fibroblast Growth Factor 2 Is Cap Dependently Synthesized by Using a Non-AUG Start Codon and Behaves as a Survival Factor. Mol Cell Biol. 19 (1), 505-514 (1999).
  15. Dmitriev, S. E., Pisarev, A. V., Rubtsova, M. P., Dunaevsky, Y. E., Shatsky, I. N. Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting. FEBS Lett. 533 (1-3), 99-104 (2003).
  16. Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. J Vis Exp. (92), e52295(2014).
  17. Duncan, C. D. S., Mata, J. Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe. Sci Rep. 7 (1), 10331(2017).
  18. Beck, H. J., Janssen, G. R. Novel Translation Initiation Regulation Mechanism in Escherichia coli ptrB Mediated by a 5'-Terminal AUG. J Bacteriol. 199 (14), (2017).

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