Toeprinting visa medir a capacidade de in vitro transcrito de RNA para formar complexos de iniciação de tradução com ribossomas sob uma variedade de condições. Este protocolo descreve um método para mamíferos RNA toeprinting e pode ser usado para estudar a tradução tanto cap-dependente e IRES-driven.
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Artigo de método
Análise de Toeprinting de formação do complexo iniciação tradução de mRNAs mamíferos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Iniciação da tradução é a etapa limitante da síntese de proteínas e representa um ponto-chave na qual células regulam a produção de proteína. Regulação da síntese de proteínas é a chave para a resposta de estresse celular e desregulação é central para muitos Estados de doença, como o câncer. Por exemplo, embora o estresse celular leva para a inibição da tradução global pela atenuante cap-dependente iniciação, certas proteínas de estresse-resposta seletivamente são traduzidas em uma forma independente de cap. Discreto do RNA dos elementos reguladores, tais como sites de entrada celular Ribossoma interno (IRESes), permitem a tradução destes mRNAs específicos. Identificação de tais mRNAs e a caracterização dos seus mecanismos reguladores, tem sido uma área-chave em biologia molecular. Toeprinting é um método para o estudo da estrutura do RNA e função no que tange a iniciação da tradução. O objetivo do toeprinting é avaliar a capacidade do in vitro transcrito de RNA para formar complexos estáveis com ribossomas sob uma variedade de condições, a fim de determinar quais sequências, elementos estruturais ou acessórios fatores estão envolvidos no Ribossoma ligação — um pré-cursor para a iniciação da tradução eficiente. Ao lado de outras técnicas, tais como análise ocidental e polysome de perfil, toeprinting permite uma caracterização robusta de mecanismos para a regulação da iniciação da tradução.
Introdução
Como tradução consome energia mais celular, faz sentido que a tradução é fortemente regulamentado1. Por outro lado, a desregulação da tradução- e as consequentes alterações na saída de proteína-é frequentemente observada nos Estados-resposta ao estresse e doenças, como câncer,1,2. Uma grande vantagem do controle de translação é a velocidade com que as células podem alterar sua saída de proteína para responder a vários estímulos3. Regulamento de tradução, portanto, representa um importante mecanismo que pode influenciar a sobrevivência da pilha e morte
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Protocolo
Nota: O RNA é altamente suscetível à degradação por ribonucleases (RNases). Tome precauções padrão para manter o RNA intacto. Luvas mudam com frequência. Utilize pontas de pipetas filtrada, plasticware nuclease-free e livre de nuclease produtos químicos em todas as etapas do protocolo. Utilização livre de nuclease ou pyrocarbonate de dietilo (DEPC)-tratamento de água para todas as soluções.
1. preparação de soluções
- Preparar o tampão de Toeprinting: 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), KOAc, 2.5 mM Mg(OAc)2, 5% (p/v) de sacarose, espermidina ditiotreitol (DTT) e 0,5 mM de 2 mM a 100 mM.
- Loja TDT e espermidina em alíquotas d....
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Resultados
Descrevemos anteriormente a capacidade da IRES XIAP para apoiar a iniciação de tradução tampão-independente em vitro8,10. Toeprinting foi a chave técnica para interrogar os detalhes mecanicistas da iniciação XIAP IRES complexo. Uma construção de DNA codificação um mRNA contendo o XIAP IRES (Figura 1A) estava em vitro transcritas e submetidas a análise de toeprinting........
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Discussão
Toeprinting é uma técnica poderosa para medir diretamente a capacidade de um RNA de interesse para apoiar a formação de complexos de iniciação da tradução em circunstâncias altamente controlados. Este protocolo descreve uma técnica simplificada para toeprinting mamíferos RNAs. Reticulócito coelho lisado (RRL) é usado como uma fonte conveniente de ribossomos, eIFs, iniciador tRNA e IRES trans-agindo fatores (ITAFs). O experimentador fornece seu RNA de escolha e também pode complementar a reação de toeprinting com.......
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Divulgações
Os autores não têm nenhum conflito de interesse de divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por um ciências naturais e engenharia Conselho de Canadá-Discovery bolsa de investigação (05463-RGPIN-2017), a Fundação de Canadá para inovação-John R. Evans líderes fundo (35017), o programa inova do Campus Alberta e Ministério de Alberta Comércio e desenvolvimento econômico.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| DEPC (Dietil pirocarbonato) | Sigma | D5758-100ML | |
| TRIS base, Ultrapure | JT Baker | 4109-01 | |
| KOAc (acetato de potássio) | Bio Basic | PB0438 | |
| Mg (OAc) < sub > 2< / sub> (acetato de magnésio tetrahidratado) | Bio Basic | MB0326 | |
| Sacarose, grau de biologia molecular | Calbiochem | 573113-1KG | |
| Spermidine | Sigma | 85558 | |
| GMP-PNP (Guanosina 5′-[β,&gama;-imido]trifosfato trissódico hidratado) 0,1 M solução | Sigma | G0635 | |
| ATP (Adenosina 5′-trifosfato) sal dissódico, solução 100 mM | Sigma | A6559 | |
| 19:1 Acrilamida: bis-acrilamida, 40% | Bio Basic | A0006 | |
| Urea | Bio Basic | UB0148 | |
| , 0,2 µ m | Sarstedt | 83.1823.101 | |
| Formamida | Sigma | F9037-100ML | |
| EDTA (sal dissódico, di-hidratado) | Bio Basic | EB0185 | |
| SDS | Bio Basic | SB0485 | |
| Azul de bromofenol | Bio Basic | BDB0001 | |
| xileno cianol FF | Bio Basic | XB0005 | |
| MEGAshortscript T7 kit de transcrição | Ambion | AM1354 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 kit de transcrição | Ambion | AM1344 | |
| Ácido Fenol:Clorofórmio (5:1) | Ambion | AM9722 | |
| 25:24:1 Fenol:Clorofórmio:Álcool Isoamílico | Invitrogen | 15593-049 | |
| Lisado de Reticulócitos de Coelho (RRL). NÃO deve ser tratado com nuclease. | Green Hectares, EUA | Entre em contato com a Green Hectares, peça 1:1 RRL:água | |
| RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µ L) | Thermo Fisher | E00382 | |
| 100 mM dNTPs | Invitrogen | 56172, 56173, 56174, 56175 | Misture partes iguais para um estoque de 25 mM cada. |
| AMV-RT, 10 U/µ L | Promega | M5101 | |
| Sequenase Versão 2.0 Kit de Sequenciamento de | DNA Thermo Fisher | 707701KT | |
| Modelo 4200 IR2 Analisador de DNA | LI-COR | O produto foi descontinuado | |
| APS (Persulfato de Amônio) | Bio Basic | AB0072 | |
| TEMED | Bio Basic | TB0508 | |
| Phusion Polimerase de Alta Fidelidade | Novo Garrafa Térmica Turbo Fisher Biolabs | M0530 | |
| AM2238 |
Referências
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer. Cell Mol Life Sci. 74
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Reimpressões e permissões
