Entrega de vírus de CRISPR guias de próstata murino para alteração do Gene

Resumo

Este protocolo descreve um método recentemente estabelecido para a entrega do vírus para a próstata murino. Usando tecnologia CRISPR/Cas9, superexpressão do gene ou entrega de recombinase Cre, a técnica permite ortotópico alteração da expressão gênica e implementa um modelo de romance do rato para câncer de próstata.

Resumo

Com um aumento da incidência de câncer de próstata, identificação de novos drivers de tumor ou moduladores é crucial. Modelos de rato geneticamente modificados (GEMM) para câncer de próstata são dificultados pela heterogeneidade do tumor e sua dinâmica complexa de microevolução. Câncer de próstata tradicional rato modelos incluem, entre outros, da linha germinal e condicionais nocautes, transgénico expressão de oncogenes e modelos de enxerto. Geração de mutações de novo nesses modelos é complexa, demorada e dispendiosa. Além disso, a maioria dos modelos tradicionais alvo a maioria do epitélio da próstata, Considerando que o câncer de próstata humano é bem conhecido a evoluir como um evento isolado em apenas um pequeno subconjunto de células. Modelos valiosos precisa simular não só a iniciação do câncer de próstata, mas também progressão de doença avançada.

Aqui nós descrevemos um método para algumas células no epitélio da próstata por transducing células-alvo por partículas virais. A entrega de um vírus projetado para a próstata murino permite a alteração da expressão gênica no epitélio da próstata. Quantidade e tipo de vírus pelo presente irão definir o número de células alvo para a alteração do gene por transducing algumas células para iniciação de cancro e muitas células para a terapia de gene. Através de injeção com base em cirurgia no lóbulo anterior, distal da trilha urinária, o tumor neste modelo pode expandir sem prejudicar a função urinária do animal. Além disso, pela segmentação apenas um subconjunto de células epiteliais da próstata a técnica permite a expansão clonal do tumor e, portanto, imita a iniciação de tumor humano, progressão, bem como a invasão através da membrana basal.

Esta nova técnica fornece um modelo poderoso câncer de próstata com maior relevância fisiológica. Sofrimento dos animais é limitado, e desde que a procriação não adicional for necessária, contagem global animal é reduzida. Ao mesmo tempo, análise de novos genes candidatos e caminhos é acelerada, que, por sua vez, é mais custo eficiente.

Introdução

Detecção e tratamento do câncer de próstata têm melhorado significativamente na última década. Ainda assim, a incidência de câncer de próstata está aumentando, seguindo a expectativa de vida. Com um estimado 1,1 milhões de novos casos em todo o mundo, está entre as causas mais comuns de morte por cancro em homens ¹. Câncer de próstata é lento em seu desenvolvimento, mas quando o câncer progrediu para um estado metastático avançado, o prognóstico é pobre devido a opções de tratamento limitado. Até agora, apenas alguns genes têm sido identificados como os drivers comuns nesse tipo de câncer, e sua heterogeneidade e multifocality impede a deteção ....

Protocolo

Este protocolo envolve um procedimento cirúrgico em ratos de laboratório. Todas as experiências em animais devem ser revisadas e aprovadas por um cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) individualmente. Como a abordagem é baseada na sobrevivência e recuperação animal, certifique-se de anestesia adequada, controle da dor e um ambiente cirúrgico asséptico em todos os tempos. Use uma almofada de aquecimento para evitar a hipotermia durante a cirurgia e até a recuperação da anestesia.

1. considerações de partida

1. Dependendo o vírus usado, podem aplicar os requisitos de título diferente; Dilua o vírus em conform....

Resultados

Para avaliar a entrega do vírus para a próstata murino, as amostras foram analisadas três meses após a cirurgia. O Rosa26-LSL-Cas9-EGFP ratos¹² express GFP nas células que foram expostas à proteína Cre expressa pelo vírus. As amostras da próstata foram examinadas com uma microscopia de fluorescência para identificar áreas com sinal GFP (Figura 2A). O sinal GFP indica atividade Cre no epitélio da próstata, mas não se gene edição tem sid.......

Discussão

Neste protocolo, descrevemos um método para alterar a expressão do gene no lóbulo anterior da próstata murino pela injeção do vírus, criando um novo modelo de rato poderoso para câncer de próstata (Figura 2). A administração bem sucedida de um adenovírus foi primeiramente descrita por Leow et al . em 2005⁸. Anteriormente mostramos como um adenovírus que codifica para uma proteína de recombinase Cre pode substituir demorado cruzamento de um alelo Cre para excl.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Equipamento
B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J camundongos	The Jackson Laboratory	26175
0,5 ml U-100 seringa de insulina	BD	324825	para injeção de vírus
ml seringa	BD	300013	para injeção de anestesia
30 G 1/2' ' agulha	BD	304000	para injeção de anestesia
6-0 Polysorb Sutura	Medtronic	GL889	para fechar o peritônio
Cirurgia esterilizada descartável drapejar	vários fornecedores
Almofada de aquecimento	vários fornecedores
Almofada de preparação de iodo de povidona	Fisher Scientific	06-669-70
Aparar máquina	Aesculap	GT415	para raspar o abdômen
Fórceps Dumont	FST	11252-00
Halsey Micro Porta-agulhas	FST	12500-12
Tesoura de íris	FST	14094-11
Fórceps de padrão estreito	FST	11002-12
Pinça de anel	FST	11106-09
Alça do Sistema de Clipe de Ferida incl. Clipes	FST	12030-01	para fechar a pele
Removedor de Sistema de Clipe de Ferida	FST	12030-04
Microscópio	Leica		diferentes modelos foram usados
Reagentes
1x PBS	Gibco	10010-023
Antisedan			obtido do biotério
Butorfanol			obtido do biotério
Medetomidina clorido			obtido do biotério
Midazolam			obtido do biotério
100% Etanol	Fisher Scientific	22-032-103
Pomada para os olhos	Takeda	7242
Vírus (AAV, AV)	vários fornecedores		vírus usado neste protocolo é um
anticorpo pAKT	CST	4060	usado 1:200 dillution
GFP anitbody	CST	2956	usado 1:100 dillution

1 de produção interna