Culturas organotypic tridimensional do utrículo murino e cóclea em opticamente clara colágeno eu geles preservar tecido inata morfologia, permitam a estimulação mecânica através do ajuste da rigidez da matriz e permitam a entrega de genes mediada por vírus.
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Artigo de método
Culturas Organotypic tridimensional de órgãos sensoriais auditivas e vestibulares
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os órgãos sensoriais do ouvido interno estão desafiando a estudar em mamíferos devido a sua inacessibilidade à óptica observação e manipulação experimental. Além disso, apesar de técnicas de cultura existentes permitem que as perturbações bioquímicas, esses métodos não fornecem um meio para estudar os efeitos da força mecânica e a rigidez do tecido durante o desenvolvimento dos órgãos sensoriais ouvido interno. Aqui nós descrevemos um método para a cultura de organotypic tridimensionais da cóclea que supera essas limitações e utrículo murino intacto. A técnica para o ajuste de uma rigidez de matriz tridimensional descrita aqui permite a manipulação da força elástica contra o crescimento do tecido. Portanto, esse método pode ser usado para estudar o papel das forças mecânicas durante o desenvolvimento do ouvido interno. Além disso, as culturas permitem a entrega de genes mediada por vírus, que pode ser usada para experiências de ganho e perda-de-função. Este método de cultura preserva inata de células ciliadas e apoiar as células e serve como uma alternativa potencialmente superior à tradicional cultura bidimensional de órgãos sensoriais auditivas e vestibulares.
Introdução
O estudo de quase todos os aspectos de desenvolvimento de mamíferos órgão tem sido facilitado pelos sistemas em vitro . Dois métodos principais são usados agora para a cultura de órgãos sensoriais vestibulares: flutuante1 e aderente2 preparações. Ambos os métodos permitem a investigação de cabelo célula vulnerabilidades3 e regeneração1,4 em vitro. Além disso, as funções do desenvolvimento do entalhe5,6, Wnt7,8<....
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Protocolo
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado Animal e uso comissões da Rockefeller University e da University of Southern California.
1. (opcional) preparação de colágeno solução de tendões Mouse-tail
Nota: Colágeno soluções estão disponíveis comercialmente. Siga as instruções do fabricante para preparação do gel.
- Eutanásia em 5-10 ratos de jovem adulto (3-5 semanas de idade) de qualquer estirpe de tipo selvagem com dióxido de carbono em conformidade com o protocolo aprovado pelo institucional Cuidado Animal e Comissão de utilização relevantes16. ....
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Resultados
Órgãos sensoriais vestibulares e auditivos de orelhas embrionárias, cultivadas em 40-Pa colágeno géis imitando rigidez baixa condições embrionárias11, reter relativamente normais estruturas tridimensionais (Figura 1) e manter as células ciliadas e apoiar as células (Figura 2 e Figura 3). Embora apoiando a densidade celular diminui por mais de 30% (teste t deStudent: n.......
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Discussão
Os sinais moleculares que crescimento mediato e diferenciação na orelha interna durante o desenvolvimento foram extensivamente estudaram5,6,7,8,9,10. No entanto, evidências obtidas a partir do sistema modelo utricular sugerem que pistas mecânicas, sentidas-se através de cruzamentos de celular e a ativação da sinalização de hi.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos o Dr. A. Jacobo, Dr. J. Salvi e r. Petelski por suas contribuições para a pesquisa original em que se baseia este protocolo. Agradecemos também J. lhamas e W. Makmura para assistência técnica e criação de animais. Reconhecemos o subsídio de formação NIDCD T32 DC009975, NIDCD conceder R01DC015530, fundo de desenvolvimento terapêutico Robertson e Fundação da família Caruso para financiamento. Finalmente, reconhecemos o apoio do Howard Hughes Medical Institute, da qual Dr. Hudspeth é um investigador.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| #10 Lâminas Cirúrgicas | Miltex | 4-110 | |
| #5 Fórceps | Dumont | 11252-20 | |
| Placa de Petri de 100 mm | Sigma | P5856-500EA | |
| 250 uL pontas de pipeta de orifício grande | USA Scientific | 1011-8406 | |
| Placa de Petri com fundo de vidro de 30 mm | Matsunami Glass USA Corporation | D35-14-1.5-U | |
| 4 poços placa | Thermo Fisher Scientific | 176740 | |
| 4-Hidroxitamoxifeno | Sigma | H7904 | |
| 60 mm Placa de Petri | Thermo Fisher Scientific | 123TS1 | |
| Ácido acético | Sigma | 537020 | |
| Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Anti-GFP, fração IgY de frango | Invitrogen | A10262 | |
| Anti-Myo7A | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Anticorpo Anti-SOX2 (Y-17) | Santa Cruz | sc-17320 | |
| Ensaio de ácido bicinchonínico | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Kit de imagem | Thermo Fisher Scientific | C10340 | |
| Colagenase I | Gibco | 17100017 | |
| D-glicose | Sigma | G8270 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| Fator de crescimento epidérmico | Sigma | E9644 | |
| Soro Fetal Bovino (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | |
| Fator de crescimento de fibroblastos | Sigma | F5392 | |
| Flaming/Brown Micropipeta Extrator | Sutter Instrumento | P-97 | |
| Glutamina | Sigma | G8540 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| Hemocitômetro | Daigger | EF16034F | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Insulina | Sigma | I3536 | |
| Zepf Instrumentos Médicos | 08-1201-10 | ||
| Microinjetor | Narishige | IM-6 | |
| Nicotinamida | Sigma | N0636 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Gibco | 70011044 | |
| PBS (1X), pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Fenol Vermelho indicador de pH | Sigma | P4633 | |
| Etanol Puro, 200 Provas | Decon Labs | 2716 | |
| RFP anticorpo | ChromoTek | 5F8 | |
| Bicarbonato de sódio | Sigma | S5761 | |
| Hidróxido de sódio | Sigma | S8045 | |
| Selenito de sódio | Sigma | S5261 | |
| Vórtice de mesa | VWR | 97043-562 | |
| Transferrin | Sigma | T8158 | |
| Azul Trypan | Sigma | T6146 |
Referências
- Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hear Res. 70 (1), 85-108 (1993).
- Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proli....
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