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Artigo de método

Identificar Sites de Factor de transcrição Olig2 vinculação genômica em agudamente purificado PDGFRα + células por imunoprecipitação da cromatina Low-célula sequenciamento análise

8.4K vistas

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DOI:

10.3791/57547

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16 de abril de 2018

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1The Vivian L. Smith Department of Neurosurgery, Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Texas Health Science Center

Neste artigo

Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo que visa analisar todo o genoma ligação do factor de transcrição do oligodendrocyte 2 (Olig2) em agudamente purificada oligodendrocyte precursor as células do cérebro (OPCs) através da realização de imunoprecipitação da cromatina de baixo-celular (ChIP) , preparação de biblioteca, elevado-throughput sequenciamento e análise de dados de bioinformatic.

Resumo

Em células de mamíferos, a transcrição do gene é regulada de maneira específica de tipo de célula pelas interações dos fatores transcricionais com DNA genômico. Fatores de transcrição de linhagem-específicos são considerados desempenham um papel essencial na especificação de célula e diferenciação durante o desenvolvimento. ChIP, juntamente com o sequenciamento de DNA do elevado-throughput (ChIP-seq) é amplamente utilizado para analisar os locais obrigatórios de todo o genoma de fatores de transcrição (ou seu complexo associado) de DNA genômico. No entanto, um grande número de células é necessário para uma reação de ChIP padrão, que torna difícil estudar o número limitado de células primárias isoladas ou populações de células raras. Para entender o mecanismo regulatório de transcrição de linhagem específica oligodendrocyte fator Olig2 no rato agudamente purificado OPCs, um método detalhado usando ChIP-seq para identificar os sítios de ligação de todo o genoma de Olig2 (ou Olig2 complexo) é mostrado. Primeiro, o protocolo explica como purificar a alfa do receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFRα) OPCs positivos de cérebro de rato. Em seguida, Olig2 anticorpo mediada ChIP e construção de biblioteca são executadas. A última parte descreve o software de bioinformatic e procedimentos utilizados para análise de Olig2 ChIP-seq. Em resumo, este trabalho relata um método para analisar as ligações de todo o genoma do fator transcricional Olig2 no cérebro agudamente purificado OPCs.

Introdução

É importante estudar a proteína (ou complexo proteico) ligações de DNA e as marcas epigenéticas para construir redes de regulação transcricionais envolvida em vários processos biológicos. Particularmente, as associações de fatores de transcrição com o DNA genômico podem desempenhar um papel importante no Regulamento do gene, a diferenciação celular e o desenvolvimento de tecido. Uma poderosa ferramenta para estudar a regulação transcricional e mecanismos epigenéticos é imunoprecipitação da cromatina (ChIP). Devido aos avanços rápidos na próxima geração de tecnologia de sequenciamento, ChIP, juntamente com o sequenciamento de DNA do elevado-throughput (ChIP-seq) é usado para as análises de associações de proteína-ADN e marcas epigenéticas1. No entanto, um protocolo padrão de ChIP-seq requer aproximadamente 20 milhões de células por reação, o que dificulta a aplicação desta técnica, quando o número de células é limitado, tais como células primárias isoladas e populações de células raras.

Células de linhagem oligodendrocyte incluindo células precursoras de oligodendrocyte (OPCs) e oligodendrócitos são amplamente distribuídas por todo o cérebro e são essenciais para o desenvolvimento e a função do cérebro. Como um tipo de células precursoras, OPCs são capazes de auto-renovação e diferenciação. OPCs não só servem como progenitoras de oligodendrócitos, mas também desempenham um papel importante na propagação de sinalização neuronal, comunicando-se com outros tipos de células de cérebro2. Estudos anteriores sugeriram que o desenvolvimento do oligodendrocyte é regulamentado por fatores de transcrição de linhagem-específicos tais como Olig2 e Sox103,4. Estes fatores de transcrição foram encontrados para ligar as regiões promotor ou potenciador de alguns genes cruciais para influenciar sua expressão durante oligodendrocyte especificação e diferenciação. No entanto, é difícil identificar DNA-ligando da proteína (ou complexo proteico) de interesse em OPCs primárias aguda purificadas com um número muito limitado de células.

Este protocolo descreve como investigar sistematicamente a immunoprecipitated DNA genômico pela Olig2 no rato purificada OPCs no genoma-larga escala usando a técnica de ChIP-seq. OPCs de cérebro de rato aguda foram purificados por immunopanning e usados em um experimento de ChIP sem proliferação in vitro. Um número limitado de OPCs pode ser obtido por immunopanning e é insuficiente para experimentos de ChIP-seq padrão. Neste documento, um protocolo de ChIP-seq baixo-célula com tão baixo quanto 20 mil células por reação de ChIP para fatores de transcrição é descrito. Em breve, reticuladas células foram lysed e lisadas por um dispositivo sonication de cisalhamento a cromatina. A cromatina cortada foi incubada com anticorpo Olig2, bem como proteína grânulos revestidos A para precipitar Olig2 anticorpo ligado DNA genômico. Após a eluição de grânulos de proteína A-revestido e cross-linking reversa, DNA genômico precipitado pelo anticorpo Olig2 foi purificado por extração fenol-clorofórmio. O produto resultante foi quantificado e submetido a T-tailing, primeira demão recozimento modelo de comutação e de extensão, a adição de adaptadores e amplificação, seleção de tamanho de biblioteca e purificação passos para construção de biblioteca de ChIP-seq.

Após o sequenciamento, foi analisada a qualidade do cru diz tanto a amostra preparada com anticorpos de factor de transcrição Olig2 e a amostra de controle. Pares de base de baixa qualidade e adaptador contendo leram fragmentos foram aparados. Próximo, aparadas leituras estavam alinhadas para o genoma de referência de rato. As regiões genômicas que foram significativamente enriquecidas para leituras de ChIP, em comparação com as amostras de controlo, foram detectadas como picos. Picos significativos, representando potenciais locais de ligação de fator de transcrição, foram filtrados e visualizados em um navegador de genoma.

Notavelmente, o método descrito neste protocolo pode ser amplamente utilizado para ChIP-seq de outros factores de transcrição com qualquer tipo de célula do número limitado.

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Protocolo

Todos os animal uso e protocolos experimentais foram efectuados de acordo com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório e aprovados pelo Comitê de biossegurança institucional e Comissão de bem-estar Animal no Health Science Center da Universidade do Texas, no Houston.

1. purificação de células positivas PDGFRα da linhagem do Oligodendrocyte de cérebro de rato (modificado de immunopanning descrito anteriormente protocolos5,6,7)

  1. Elaboração de um prato de immunopanning de seleção de célula positiva PDGFRα e 2 placas para depleção de células endoteliais e microglia.
    Nota: Por favor, note que pratos de Petri mas não os pratos de cultura celular funcionam para experimento de immunopanning; Se as células purificadas serão usadas para cultivo, immunopanning passos devem efectuar-se no gabinete da Biossegurança
    1. Revestir um cm 10 placa de Petri com 30 µ l cabra anti-rato IgG em 10 mL de pH 9.5, 50 mM Tris-HCl durante a noite a 4 ° C. Agite a placa para certificar-se de que as superfícies das placas são uniformemente e inteiramente cobertas pela solução de revestimento.
    2. Prepare solução de anticorpo PDGFRα µ l 40 diluição do anticorpo anti-PDGFRα de rato com 12 mL de fosfato salino de Dulbecco (DPBS) contendo 0,2% de BSA.
    3. Após 3 lavagens da placa IgG revestido com 10 mL 1 x DPBS cada, incubar a placa IgG-revestida com solução de anticorpo PDGFRα à temperatura ambiente durante 4 h.
    4. Lave o prato de anticorpo revestido anti-PDGFRα rato 3 vezes com 10 mL 1 x DPBS cada. Delicadamente, adicionar solução DPBS ao longo da parede do lado da placa e não perturbe as superfícies revestidas.
    5. Casaco 2 novas placas de Petri 15 cm para depleção de células endoteliais e microglia com 20 mL de DPBS contendo 2,3 µ g/mL de Banderiaea simplicifolia lectina 1 (BSL-1) por 2 h.
    6. Lavagem que a BSL-1 revestido placas 3 vezes com 20 mL de 1 x DPBS. Delicadamente, adicionar solução DPBS ao longo da parede lateral das placas e não perturbe as superfícies revestidas.
  2. Purificação de PDGFRα células de linhagem oligodendrocyte positivo é modificado de métodos anteriormente publicados6 , 7 , 8.
    1. Dissecar os tecidos corticais de 2 pós-Natal dia 7 (P7) cérebro de rato anteriormente de acordo com protocolos publicados5,6.
    2. Dissocia os tecidos para gerar uma suspensão de célula única com dissociação de tecido neural Kit (P) de acordo com as instruções detalhadas do fabricante.
    3. Brevemente, corte os tecidos corticais dissecados em pedaços com um bisturi e sujeitá-los à digestão enzimática a 37 ° C. Depois da digestão, manualmente dissocia as peças com vidro polido fogo que pipetas de Pasteur em uma suspensão de célula única.
    4. Centrifugar a suspensão de célula única 300 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente e suspender centrifugado usando 15 mL de tampão de immunopanning (immunopanning buffer é DPBS com 0,02% de BSA e 5 µ g/mL insulina).
    5. Incube a suspensão de célula única de 2 cérebro de rato sequencialmente em 2 placas de BSL-1 revestido por 15 min em temperatura ambiente com agitação suave da placa cada 5min para garantir uma melhor depleção da micróglia e células endoteliais.
    6. Agite suavemente a placa para coletar as células não-aderentes na suspensão de célula e incube-os na placa de anticorpo-revestido de rato-PDGFRα por 45 min à temperatura ambiente.
    7. Após a incubação da suspensão celular na placa de anticorpo-revestido de rato-PDGFRα, suavemente redemoinho a placa para coletar a suspensão de células e lave a placa 8 vezes com DPBS para livrar-se de células não-aderentes. Acrescente solução de lavagem ao longo da parede do lado da placa e agitar a placa várias vezes para se livrar de células não-aderentes.
    8. Separar as células da placa de anticorpo revestido de rato-PDGFRα usando um 4 mL de tratamento da solução celular destacamento durante 10 minutos a 37 ° C. Agite a placa para desalojar as células aderentes.
    9. Recolher os OPCs purificadas por centrifugação a 300 x g à temperatura ambiente, suspender o centrifugado com meio de cultura celular 2ml OPC e contar as células usando trypan azul e um hemocytometer (meio de cultura celular de 500 mL é meio DMEM/F12 contendo 5 mL solução de penicilina-estreptomicina (P/S), 5 mL de N2, 10ml B27, 5 µ g/mL insulina, 0,1% BSA, 20 ng/mL bFGF e 10 ng/mL PDGFRα).
  3. Validação da pureza de OPCs após immunopanning.
    1. A fim de avaliar o enriquecimento de OPCs após immunopanning, use os OPCs purificados para extração de RNA com uma extração de tiocianato com base guanidium de acordo com as instruções do fabricante.
    2. Execute qRT-PCR usando mestre mistura corante verde fluorescente para verificar o enriquecimento da expressão PDGFRα em OPCs purificadas em comparação com as células do cérebro dissociada de acordo com o material previamente publicado4.
    3. Além disso, sementes de alguns OPCs purificadas em poli-D-lisina revestido 24 placas bem por imunocoloração com anti-NG2 sulfato de condroitina proteoglycan (NG2) Anticorpo como anteriormente publicado materiais9.

2. Low-celular ChIP preparação e construção de biblioteca de ChIP para arranjar em sequência do elevado-Throughput

  1. Preparação de ChIP de celular Low Olig2 com um sistema de sonication comercialmente disponíveis e um número de celular baixa disponível comercialmente ChIP kit (veja a tabela de materiais), seguindo os procedimentos padrão detalhados de instruções do fabricante.
    1. Após desanexação do rato anti-PDGFRα placa revestida de anticorpo e a célula contando com trypan azul e um hemocytometer colocam 20.000 OPCs purificadas em meio de cultura celular 1ml OPC para cada reação do ChIP.
    2. Adicione 27 µ l de 36,5% de formaldeído para consertar a suspensão de células para 10 min à temperatura ambiente.
      Atenção: Por favor, note que o formol deve ser usado na coifa química por razões de segurança.
    3. Pare de ADN-proteína cross-linking com glicina de 2,5 M 50 µ l por 5 min à temperatura ambiente.
      Nota: Todas as etapas devem ser realizadas no gelo ou no quarto frio de 4 ° C a partir deste ponto.
    4. Lave as pelotas de célula reticulado com 1 mL de gelado Hanks equilibrado sal solução (HBSS) com inibidor de protease cocktail e obter células peletizadas por uma centrífuga previamente arrefecida a 300 x g a 4 ° C.
    5. Lyse o centrifugado em 25 µ l completa Lise para 5 min no gelo.
      Nota: Agite o tubo para suspender as células em tampão de Lise.
    6. A célula lisado com 75 µ l gelada HBSS contendo cisalhamento e inibidor da protease cocktail a cromatina da célula lisada por pre-refrigeração sistema sonication com 5 ciclos de 30 ON s e 30 s OFF programa de suplemento. Sempre proceda à sonicação 6 tubos juntos e certifique-se que os tubos de equilíbrio contêm 100 µ l água.
    7. Após a tosquia, centrifugar a 14.000 x g durante 10 minutos 4 ° C e recolher o sobrenadante em um novo tubo após a centrifugação.
    8. Dilua 100 µ l de cromatina cortada com o volume igual de gelada Buffer completo do ChIP com o inibidor de protease.
    9. Salve 20 µ l da cromatina cortada diluída como exemplo de controle de entrada.
      Nota: Exemplo de controle de entrada também é necessário como a comparação com amostra de immunoprecipitated Olig2 para identificar Olig2 anticorpo immunoprecipitated DNA.
    10. Adicionar 1 µ l de anticorpo anti-olig2 180 µ l do diluídos distorcido da cromatina e incubar o tubo de reação em uma roda rotativa a 40 rpm para 16 h a 4 ° C.
      Nota: Execute esta etapa em uma sala fria.
    11. Para cada reação de ChIP, lave 11 µ l proteína magnético revestido A grânulos com 55 µ l tampão de lavagem de contas e colocar o grânulo de pelotas em 11 µ l de tampão de lavagem do grânulo após 2 lavagens.
      Nota: Execute esta etapa em uma sala fria.
    12. Para cada reação de ChIP, adicione 10 µ l de grânulos revestidos à proteína pre-lavados para tubo de reação de ChIP. Execute esta etapa em uma sala fria.
    13. Incube o tubo de reação de ChIP a 4 ° C para outro h 2 em uma roda giratória.
    14. Coloque o tubo de reação de ChIP na prateleira magnética por 1 min.
      Nota: Execute esta etapa em uma sala fria.
    15. Remover o sobrenadante e não desalojar a pelota do grânulo.
    16. Lave a pelota do grânulo com 100 µ l de cada um dos 4 buffers de lavagem respectivamente por 4 min em uma roda rotativa a 4 ° C.
    17. Após lavagens, adicionar 200 µ l de tampão de eluição para a pelota do grânulo e incubar o tubo de reação de ChIP a 65 ° C por 4 h inverter as ligações cruzadas proteína-ADN.
    18. Além disso, adicionar 180 µ l de tampão de eluição para 20 µ l da amostra controle entrada e incubar a 65 ° C por 4 h inverter as ligações cruzadas proteína-ADN também.
    19. Adicione a mistura de 25:24:1 (v/v) 200 µ l de álcool isoamílico, clorofórmio e fenol a cada tubo de reação de ChIP.
    20. Vórtice vigorosamente durante 1 min e centrifugar a 13.000 x g durante 15 minutos à temperatura ambiente. Transferi a fase superior para um novo tubo.
    21. Adicionar a solução de acetato de sódio de 3 M 40 µ l, 1.000 µ l de etanol 100% e 2 µ l de glicogênio precipitado covalentemente ligado a um corante azul para cada tubo de reação de ChIP durante a noite a-20 ° C.
    22. Centrifugar a 13.000 x g por 20 min a 4 ° C.
    23. Desprezar o sobrenadante, lavar com 500 µ l 70% álcool etílico frio e centrifugar a 13.000 x g por 20 min a 4 ° C.
    24. Desprezar o sobrenadante, manter o ar de pellet seco por 10 min e dissolva a pelota com 50 água µ l.
  2. Construção de biblioteca microplaqueta para arranjar em sequência do elevado-throughput
    1. Limpar e concentrar o ChIP de DNA com um kit de limpeza de acordo com as instruções dos fabricantes.
    2. Quantificar a amostra do ChIP por um verde-pico de acordo com as instruções do fabricante.
    3. Use um kit de ChIP-seq para T-tailing, replicação e rejeito, modelo switching e extensão, a adição de adaptadores e amplificação, seleção de tamanho de biblioteca e purificação de acordo com as instruções do fabricante.
      1. Após desnaturação de dsDNA, dephosphorylate extremidade 3' do ssDNA pela fosfatase alcalina do camarão e adicione uma cauda poli (T) para o ssDNA pelo terminal deoxynucleotidyl transferase.
      2. Recoze a cartilha de DNA poli (dA) para o modelo ssDNA para a replicação do DNA e a troca de modelo.
      3. Após a mudança de modelo, amplifica a ChIP-seq biblioteca por PCR com primers para diante e reversos para indexação.
      4. Selecione o PCR amplificados ChIP-seq biblioteca com fragmentos que variam de 250 a 500 bp por grânulos paramagnéticos pela opção 2 para a seleção de tamanho duplo.
      5. Análise da qualidade da biblioteca de ChIP-seq selecionada usando um dispositivo de eletroforese capilar-microplaqueta microfluidic.

3. análise de dados

  1. Prepare a estrutura de diretório.
    1. Crie um diretório para realizar a análise de dados do ChIP-seq. Dentro do diretório recém-criado, criar seis subdiretórios com os seguintes nomes: raw.files, fastqc.output, bowtie.output, homer.output, macs2.output, motif.analysis e relatórios.
  2. Preparar dados e realizar a análise de controle de qualidade de dados de sequência primas.
    1. Mova para o diretório "raw.files" e baixar os arquivos de dados do ChIP-seq.
    2. Verifique se os nomes de arquivos. Se a sequência foi emparelhado-fim, haverá 4 arquivos (duas para tratamento) e duas para a entrada com nomes similares de base: PDGFRα_Olig2.read1.fastq, PDGFRα_Olig2.read2.fastq, PDGFRα_input.read1.fastq e PDGFRα_input.read2.fastq. Se os nomes dos arquivos são diferentes, renomeá-los usando o comando "mv".
    3. Mover para o diretório "fastqc.output".
    4. Obter métricas de controle de qualidade das crus leituras usando um fastq arquivo controle de qualidade de software10. Use o comando na Figura S1A para executar o processo de controle de qualidade, separadamente para cada arquivo de fastq. O software irá exibir várias métricas de controle de qualidade em um arquivo html.
    5. Abra o arquivo de controle de qualidade de html e verifique se o número de leituras, ler o comprimento, por qualidade de sequência de base, por escores de qualidade de sequência, sequência GC, níveis de duplicação de sequência, adaptador kmer teores e.
  3. Guarnição à direita leituras de baixa qualidade e conteúdo de adaptador.
    1. Observe a "por qualidade de sequência de base" e "Adaptador conteúdo" parcelas. Determine o comprimento de corte para a cabeça e a cauda de cada leitura. Um comprimento adequado para aparar é onde a base qualidade cai abaixo de 30, e há evidências de conteúdo do adaptador.
    2. Mover para o diretório "raw.files".
    3. Baixe e instale um software para aparar leituras11. Use o comando na Figura S1B para aparar o tratamento e a entrada separadamente. Parâmetro 'Lavoura' indica o comprimento de leitura restante depois de aparar as bases da extremidade e 'HEADCROP' especifica o número de bases de ser eliminados desde o início da leitura.
    4. O comando aparar também inclui o mínimo ler comprimento admitidas após a filtragem no parâmetro 'MINLEN'. Se as leituras são pelo menos 50 bp, bp uso 35 como o limite de comprimento de leitura.
    5. Mover para o diretório "fastqc.output".
    6. Realizar a análise de controle de qualidade do arquivo de fastq depois de aparelhar o lê. Verifique se que as questões de controle de qualidade foram resolvidas. Use o comando na Figura S1C para obter as métricas de controle de qualidade.
  4. Alinhe o lê ChIP-seq single-end ou emparelhado-end para o genoma de referência de rato.
    1. Mover para o diretório "bowtie.output" para o mapeamento.
    2. Baixe o genoma de referência GENCODE mm10 rato. Renomear o genoma de referência de rato mm10 como "mm10.fa".
    3. Baixe um mapeador leia12 e instalá-lo no sistema.
    4. Crie um arquivo de índice do genoma de referência baixado usando o comando no S2A figura. Seis arquivos são criados automaticamente: mm10.1.bt2, mm10.2.bt2, mm10.3.bt2, mm10.4.bt2, mm10.rev.1.bt2 e mm10.rev.2.bt2.
    5. Use o comando na Figura S2B para executar o alinhamento e ajuste o parâmetro "-p" para o número de núcleos de processamento, de acordo com as configurações do sistema. Se executar o modo emparelhado-fim, parâmetros "-1" e "-2" indicam os nomes dos arquivos fastq aparadas.
      Nota: O mapeamento é executado separadamente para as amostras de entrada e tratamento e arquivos de log de métrica de saída são criados para cada amostra.
    6. Download de um software para manipulação de arquivos em formato de SAM13 e instalá-lo no sistema. Converta o arquivo SAM alinhado em um arquivo BAM usando o comando no S2C figura.
  5. Obter métricas de controle de qualidade de leituras mapeadas antes pico chamando para ambas as amostras emparelhado-final de tratamento e controle.
    1. Dentre as métricas de controle de qualidade mais importantes para o endereço é a profundidade de sequenciamento. Abra os arquivos "log.bowtie.PDGFRα_Olig2.txt" e "log.bowtie.PDGFRα_input.txt" no diretório bowtie.output e verifique se o número de pares de leitura exclusivamente mapeadas em cada amostra é maior que 10 milhões.
    2. Mover para o diretório "homer.output".
    3. Baixar um software para a descoberta do motivo e sequenciamento de próxima geração análise14 e instalá-lo no sistema.
    4. Crie um diretório chamado "tagDir".
    5. Para verificar clonality marca, use o comando retratado na Figura S3A. O comando "makeTagDirectory" irá gerar quatro files:tagAutocorrelation.txt de saída do controle de qualidade, tagCountDistribution.txt, tagInfo.txt e tagLengthDistribution.txt.
    6. Mover para o diretório "tagDir".
    7. Copie o arquivo "tagCountDistribution.txt" no diretório "relatórios".
    8. Mover para o diretório "relatórios".
    9. Abra o arquivo tagCountDistribution.txt usando um programa de planilha e criar um bar trama do número de marcas por posição genômica. Armazene o arquivo de histograma com o nome "tag.clonality.xlsx".
    10. Instale R programação linguagem15 no sistema.
    11. No terminal, digite 'R' e pressione ENTER para acessar o ambiente de programação de R.
    12. Baixe um pacote de R para o processamento de dados do ChIP-seq16 e instalá-lo usando o comando retratado na Figura S3B.
    13. Use o script de R na Figura S3C para plotar a vertente correlação cruzada.
  6. Deteção de picos usando um mapeador de pico.
    1. Mover para o diretório "macs2.output". Baixe e instale um mapeador de pico17 em seu sistema.
    2. Use a função "callpeak" com o tratamento e controlar arquivos BAM gerados na etapa 3.4.6.
      Nota: Outros parâmetros incluem "-f" para o formato de arquivo de entrada, "-g" para o tamanho do genoma, "-nome" para indicar o nome de base de todos os arquivos de saída, e "-B" para armazenar o engavetamento de fragmento no formato bedgraph. O pico completo chamando o comando está incluído na Figura S4A. Use BEDPE para amostras de ponta emparelhado.
    3. Verifique se que o mapeador de pico gerou seis arquivos: PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.narrowPeak, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_summits.bed, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_model.r, PDGFRα_Olig2_vs_ PDGFRα_input_control_lambda.bdg e PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_treat_pileup.bdg.
    4. Abrir o arquivo PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls para ver os picos de chamadas, localização, comprimento, posição cimeira, engavetamento e as métricas de enriquecimento de pico:-log10(pvalue), dobre o enriquecimento e - log10(q-value).
  7. Filtrar e anotar os chamados picos.
    1. Usando o arquivo aberto na etapa anterior, filtro resultando picos de acordo com o enriquecimento de dobra, o p-valor e/ou o valor de q. Para decidir os limiares de filtragem adequados, fazer um gráfico de histograma para determinar a densidade de cada métrica. Filtre valores abaixo de um limite selecionado para obter picos significativos.
    2. Baixar a lista negra mm10 (regiões são sabidas para ter sinal artificialmente elevado) e filtrar o ChIP-seq picos que estão dentro dessas regiões de artefato.
    3. Criar um arquivo de cama com picos de filtrado contendo as seguintes colunas: cromossomo, início, fim, peakID, simulação e vertente. Preencher a coluna simulada com um ponto "." uma vez que não é usado. Na coluna de vertente, definir todos os valores "+". Salve o arquivo de cama como "filtered.peakData2.bed".
    4. Copie o arquivo "filtered.peakData2.bed" no diretório "relatórios".
    5. Mover para o diretório "relatórios".
    6. Para anotar picos filtrados para uma região do gene específico, use a função "annotatePeaks" com o arquivo de cama criado na etapa anterior. O comando usado é mostrado na Figura S5A.
    7. Abra o arquivo "filtered.annotatedPeaks.txt" usando um software estatístico.
    8. Filtro resultantes picos deitado em uma região intergênica a uma distância superior a 5 kb de um TSS anotada. Use a coluna de "Distância de SST" no arquivo como a distância para filtragem. Armazene os picos filtrados em um arquivo do excel chamado "5kbup.geneBody.peakData.txt".
    9. Loja resultante filtrada picos em um arquivo bedGraph com colunas: cromossomo, início, fim e - log10(q-value). Nomeie o arquivo "5kbup.geneBody.peakData.bedGraph".
  8. Gere arquivos de figurão para visualização do navegador.
    1. Baixe e instale um software para aritmética de genoma18.
    2. Baixar uma ferramenta para converter bedgraph para graúdos e instalar no sistema. Baixe o arquivo 'mm10.chrom.sizes'.
    3. Use o comando na Figura S6A para gerar um arquivo de manda-chuva.
    4. Baixe e instale um navegador de genoma19 no sistema.
    5. Abra o navegador de genoma e carregar o arquivo "5kbup.geneBody.peakData.bigwig" para visualizar os picos significativos filtrados e sua localização em relação a genes conhecidos.
  9. Busca do motivo.
    1. Mover para o diretório "motif.analysis".
    2. Baixar um programa de enriquecimento de motivo e de novo motivo digitalização e instalá-lo em seu sistema de20.
    3. Baixe um tema abrangente banco de dados que inclui motivos de Olig2.
    4. Obter as sequências genômicas de 500 regiões de bp, centradas nas cimeiras de pico significativo. Armazene as sequências como peak.sequences.txt. Use o comando na Figura S7 para procurar motivos de Olig2 dentro de cada uma das 500 bp pico regiões.
    5. Filtrar os motivos resultantes usando um valor adequado E (padrão = 0,05).

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Resultados

Realizou-se baixo-celular ChIP-seq e bioinformatic análises foram feitas para investigar as potenciais interações do fator transcricional Olig2 com DNA genômico no cérebro agudamente purificado OPCs. A Figura 1 mostra um fluxo de trabalho geral de ambos os experimentais e os procedimentos de análise de dados. Neste protocolo, cérebros de ratos pós-natal foram dissociados em uma suspensão de célula única. Após dissociação de tecido, immunopanning foi realizada...

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Discussão

Redes de regulamento do gene de mamíferos são muito complexas. ChIP-seq é um método poderoso para investigar interações proteína-ADN de todo o genoma. Este protocolo inclui como executar Olig2 ChIP-seq usando um número baixo de OPCs purificados de cérebro de rato (tão baixo quanto 20 mil células por reação). O primeiro passo fundamental para este protocolo é a purificação de OPCs de cérebro de rato por immunopanning com anticorpo PDGFRα. Para a selecção positiva de OPCs com placas PDGFRα revestido, OPCs frequentemente fr...

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Divulgações

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecimentos

JQW, XD, RCDD e YY foram apoiados por concessões dos institutos nacionais de saúde R01 NS088353; NIH conceder 1R21AR071583-01; a Fundação de Hermann Staman Ogilvie fundo-Memorial; a iniciativa do cérebro UTHealth e CTSA UL1 TR000371; e uma bolsa da Universidade do Texas sistema neurociência e Neurotecnologia Research Institute (Grant #362469).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagente/Equipamento
Banderiaea simplicifolia lectina 1Vector Laboratories# L-1100
Rat anti-PDGFRa anticorpoBD Bioscience# 558774
Kit de dissociação de tecido neural (P)MACS Miltenyi Biotec# 130-092-628
AccutaseTecnologiasde células-tronco# 07920
TRIzolThermo Fisher# 15596026
Anti-NG2 Sulfato de Condroitina Proteoglicano AnticorpoMillipore# AB5320
Bioruptor Pico dispositivo de sonicaçãoDiagenode# B01060001
True MicroChIP kitDiagenode# C01010130
Fenol:Clorofórmio:Álcool Isoamílico (25:24:1, v/v)Thermo Fisher# 15593031
NucleoSpin Gel e kit de limpeza de PCRMACHEREY-NAGEL# 740609
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay KitThermo Fisher# P11496
DNA SMART ChIP-Seq kitClontech Laboratories# 634865
Agencourt AMPure XPBeckman Voulter# A63880
GlycoBlueThermo Fisher# AM9516
pico-verdeThermo Fisher# P11496
D-PBSThermo Fisher# 14190-144
SYBR Green master mixBio-Rad Laboratories# 1725124
DMEM/F12Fisher Scientific# 11-320-033
Penicilina-estreptomicina (P/S)Fisher Scientific# 15140122
Suplemento N-2Fisher Scientific# 17502048
Suplemento B-27 FisherScientific# 17504044
insulinaSigma# I6634Prepare a solução de insulina 0,5 mg/ml dissolvendo 5 mg de insulina em 10 ml de água e 50 μ l de 1 N HCl.
Albumina de soro bovino, adequada para cultura de células (BSA)Sigma# A4161Prepare a solução de BSA a 4% dissolvendo 4 g de BSA em 100 ml de D-PBS e ajuste o pH para 7,4
Proteína básica do fator de crescimento de fibroblastos, recombinante humano (bFGF)EMD Millipore# GF003
HUMAN PDGF-AAVWR# 102061-188
poli-D-lisinaVWR# IC15017510Preparar 1 mg/ml de solução de poli-D-lisina dissolvendo 10 mg de poli-D-lisina em 10 ml de água e diluir 100 vezes durante a utilização.
Placas de Petri descartáveis Falcon, estéreis, Corning, 100x15mmVWR# 25373-100
Placas de Petri descartáveis Falcon, estéreis, Corning, 150x15mmVWR# 25373-187
HBSS, 10X, sem cálcio, sem magnésio, sem fenol RedFisher Scientific# 14185-052
Trypan BlueStemcell Technologies# 07050
coquetel de inibidores de proteaseSigma# 11697498001
Software
FastQC[10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/Obtenção de métricas de controle de qualidade de leituras brutas e aparadas
Trimmomatic 0.33[11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomaticCorte e filtragem de leituras brutas
GENCODE mm10ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gzGenoma de referência do camundongo
Bowtie2 2.2.4[12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtmlAlinhamento de leituras a um genoma de referência
SAMTools 1.5[13] http://samtools.sourceforge.net/Convertendo arquivo SAM para o formato BAM
HOMER 4.9.1[14] http://homer.ucsd.edu/homer/Criando um diretório de tags e anotando regiões genômicas enriquecidas com símbolos de genes
R 3.2.2[15] https://www.R-project.org/Scripts de programação e funções em execução
SPP 1.13[16] https://github.com/hms-dbmi/sppCriando um gráfico de correlação cruzada de fita
MACS2 2.2.4[17] https://github.com/taoliu/MACSEncontrando regiões de enriquecimento de ChIP sobre o controle
BEDTools 2.25[18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/aritmética do genoma
bedGraphToBigWighttp://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/Convertendo o arquivo bedGraph em bigwig
IGV browser 2.3.58[19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/Visualização e navegação de picos significativos de ChIP-seq
Microsoft ExcelSpreasheet
ENCODE https://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklistsPicos de filtragem
mm10.chrom.sizeshttp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes.Convertendo o arquivo bedGraph no
banco de dados de motivos do bigwig ENCODE[25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/Banco de dados de motivos abrangente necessário para enriquecimento de motivos
MEME-ChIP[20] http://meme-suite.org/index.htmlAnálise de enriquecimento de motivos e descoberta de motivos
Nomes de primer usados para qPCRSequências de primer usadas para qPCR
Mbp-F:CTATAAATCGGCTCACAAGG
Mbp-R:AGGCGGTTATATTAAGAAGC
Iba1-F:ACTGCCAGCCTAAGACAACC
Iba1-R:GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC
Mog-F:GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC
Mog-R:TGAATTGTCCTGCATAGCTGC
GAPDH-FATGACATCAAGAAGGTGGTG
GAPDH-RCATACCAGGAAATGAGCTTG
Tuj1-FTTTTCGTCTCTAGCCGCGTG
Tuj1-RGATGACCTCCCAGAACTTGGC
PDGFRα-FAGAGTTACACGTTTGAGCTGTC
PDGFRα-RGTCCCTCCACGGTACTCCT
Lista negra do programa

Referências

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