Identificar Sites de Factor de transcrição Olig2 vinculação genômica em agudamente purificado PDGFRα + células por imunoprecipitação da cromatina Low-célula sequenciamento análise

É importante estudar a proteína (ou complexo proteico) ligações de DNA e as marcas epigenéticas para construir redes de regulação transcricionais envolvida em vários processos biológicos. Particularmente, as associações de fatores de transcrição com o DNA genômico podem desempenhar um papel importante no Regulamento do gene, a diferenciação celular e o desenvolvimento de tecido. Uma poderosa ferramenta para estudar a regulação transcricional e mecanismos epigenéticos é imunoprecipitação da cromatina (ChIP). Devido aos avanços rápidos na próxima geração de tecnologia de sequenciamento, ChIP, juntamente com o sequenciamento de DNA do elevado-throughput (ChIP-seq) é usado para as análises de associações de proteína-ADN e marcas epigenéticas¹. No entanto, um protocolo padrão de ChIP-seq requer aproximadamente 20 milhões de células por reação, o que dificulta a aplicação desta técnica, quando o número de células é limitado, tais como células primárias isoladas e populações de células raras.

Células de linhagem oligodendrocyte incluindo células precursoras de oligodendrocyte (OPCs) e oligodendrócitos são amplamente distribuídas por todo o cérebro e são essenciais para o desenvolvimento e a função do cérebro. Como um tipo de células precursoras, OPCs são capazes de auto-renovação e diferenciação. OPCs não só servem como progenitoras de oligodendrócitos, mas também desempenham um papel importante na propagação de sinalização neuronal, comunicando-se com outros tipos de células de cérebro². Estudos anteriores sugeriram que o desenvolvimento do oligodendrocyte é regulamentado por fatores de transcrição de linhagem-específicos tais como Olig2 e Sox10^3,4. Estes fatores de transcrição foram encontrados para ligar as regiões promotor ou potenciador de alguns genes cruciais para influenciar sua expressão durante oligodendrocyte especificação e diferenciação. No entanto, é difícil identificar DNA-ligando da proteína (ou complexo proteico) de interesse em OPCs primárias aguda purificadas com um número muito limitado de células.

Este protocolo descreve como investigar sistematicamente a immunoprecipitated DNA genômico pela Olig2 no rato purificada OPCs no genoma-larga escala usando a técnica de ChIP-seq. OPCs de cérebro de rato aguda foram purificados por immunopanning e usados em um experimento de ChIP sem proliferação in vitro. Um número limitado de OPCs pode ser obtido por immunopanning e é insuficiente para experimentos de ChIP-seq padrão. Neste documento, um protocolo de ChIP-seq baixo-célula com tão baixo quanto 20 mil células por reação de ChIP para fatores de transcrição é descrito. Em breve, reticuladas células foram lysed e lisadas por um dispositivo sonication de cisalhamento a cromatina. A cromatina cortada foi incubada com anticorpo Olig2, bem como proteína grânulos revestidos A para precipitar Olig2 anticorpo ligado DNA genômico. Após a eluição de grânulos de proteína A-revestido e cross-linking reversa, DNA genômico precipitado pelo anticorpo Olig2 foi purificado por extração fenol-clorofórmio. O produto resultante foi quantificado e submetido a T-tailing, primeira demão recozimento modelo de comutação e de extensão, a adição de adaptadores e amplificação, seleção de tamanho de biblioteca e purificação passos para construção de biblioteca de ChIP-seq.

Após o sequenciamento, foi analisada a qualidade do cru diz tanto a amostra preparada com anticorpos de factor de transcrição Olig2 e a amostra de controle. Pares de base de baixa qualidade e adaptador contendo leram fragmentos foram aparados. Próximo, aparadas leituras estavam alinhadas para o genoma de referência de rato. As regiões genômicas que foram significativamente enriquecidas para leituras de ChIP, em comparação com as amostras de controlo, foram detectadas como picos. Picos significativos, representando potenciais locais de ligação de fator de transcrição, foram filtrados e visualizados em um navegador de genoma.

Notavelmente, o método descrito neste protocolo pode ser amplamente utilizado para ChIP-seq de outros factores de transcrição com qualquer tipo de célula do número limitado.

Todos os animal uso e protocolos experimentais foram efectuados de acordo com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório e aprovados pelo Comitê de biossegurança institucional e Comissão de bem-estar Animal no Health Science Center da Universidade do Texas, no Houston.

1. purificação de células positivas PDGFRα da linhagem do Oligodendrocyte de cérebro de rato (modificado de immunopanning descrito anteriormente protocolos^5,6,7)

1. Elaboração de um prato de immunopanning de seleção de célula positiva PDGFRα e 2 placas para depleção de células endoteliais e microglia.
   Nota: Por favor, note que pratos de Petri mas não os pratos de cultura celular funcionam para experimento de immunopanning; Se as células purificadas serão usadas para cultivo, immunopanning passos devem efectuar-se no gabinete da Biossegurança
   1. Revestir um cm 10 placa de Petri com 30 µ l cabra anti-rato IgG em 10 mL de pH 9.5, 50 mM Tris-HCl durante a noite a 4 ° C. Agite a placa para certificar-se de que as superfícies das placas são uniformemente e inteiramente cobertas pela solução de revestimento.
   2. Prepare solução de anticorpo PDGFRα µ l 40 diluição do anticorpo anti-PDGFRα de rato com 12 mL de fosfato salino de Dulbecco (DPBS) contendo 0,2% de BSA.
   3. Após 3 lavagens da placa IgG revestido com 10 mL 1 x DPBS cada, incubar a placa IgG-revestida com solução de anticorpo PDGFRα à temperatura ambiente durante 4 h.
   4. Lave o prato de anticorpo revestido anti-PDGFRα rato 3 vezes com 10 mL 1 x DPBS cada. Delicadamente, adicionar solução DPBS ao longo da parede do lado da placa e não perturbe as superfícies revestidas.
   5. Casaco 2 novas placas de Petri 15 cm para depleção de células endoteliais e microglia com 20 mL de DPBS contendo 2,3 µ g/mL de Banderiaea simplicifolia lectina 1 (BSL-1) por 2 h.
   6. Lavagem que a BSL-1 revestido placas 3 vezes com 20 mL de 1 x DPBS. Delicadamente, adicionar solução DPBS ao longo da parede lateral das placas e não perturbe as superfícies revestidas.
2. Purificação de PDGFRα células de linhagem oligodendrocyte positivo é modificado de métodos anteriormente publicados^{6 , 7 , 8}.
   1. Dissecar os tecidos corticais de 2 pós-Natal dia 7 (P7) cérebro de rato anteriormente de acordo com protocolos publicados^5,6.
   2. Dissocia os tecidos para gerar uma suspensão de célula única com dissociação de tecido neural Kit (P) de acordo com as instruções detalhadas do fabricante.
   3. Brevemente, corte os tecidos corticais dissecados em pedaços com um bisturi e sujeitá-los à digestão enzimática a 37 ° C. Depois da digestão, manualmente dissocia as peças com vidro polido fogo que pipetas de Pasteur em uma suspensão de célula única.
   4. Centrifugar a suspensão de célula única 300 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente e suspender centrifugado usando 15 mL de tampão de immunopanning (immunopanning buffer é DPBS com 0,02% de BSA e 5 µ g/mL insulina).
   5. Incube a suspensão de célula única de 2 cérebro de rato sequencialmente em 2 placas de BSL-1 revestido por 15 min em temperatura ambiente com agitação suave da placa cada 5min para garantir uma melhor depleção da micróglia e células endoteliais.
   6. Agite suavemente a placa para coletar as células não-aderentes na suspensão de célula e incube-os na placa de anticorpo-revestido de rato-PDGFRα por 45 min à temperatura ambiente.
   7. Após a incubação da suspensão celular na placa de anticorpo-revestido de rato-PDGFRα, suavemente redemoinho a placa para coletar a suspensão de células e lave a placa 8 vezes com DPBS para livrar-se de células não-aderentes. Acrescente solução de lavagem ao longo da parede do lado da placa e agitar a placa várias vezes para se livrar de células não-aderentes.
   8. Separar as células da placa de anticorpo revestido de rato-PDGFRα usando um 4 mL de tratamento da solução celular destacamento durante 10 minutos a 37 ° C. Agite a placa para desalojar as células aderentes.
   9. Recolher os OPCs purificadas por centrifugação a 300 x g à temperatura ambiente, suspender o centrifugado com meio de cultura celular 2ml OPC e contar as células usando trypan azul e um hemocytometer (meio de cultura celular de 500 mL é meio DMEM/F12 contendo 5 mL solução de penicilina-estreptomicina (P/S), 5 mL de N2, 10ml B27, 5 µ g/mL insulina, 0,1% BSA, 20 ng/mL bFGF e 10 ng/mL PDGFRα).
3. Validação da pureza de OPCs após immunopanning.
   1. A fim de avaliar o enriquecimento de OPCs após immunopanning, use os OPCs purificados para extração de RNA com uma extração de tiocianato com base guanidium de acordo com as instruções do fabricante.
   2. Execute qRT-PCR usando mestre mistura corante verde fluorescente para verificar o enriquecimento da expressão PDGFRα em OPCs purificadas em comparação com as células do cérebro dissociada de acordo com o material previamente publicado⁴.
   3. Além disso, sementes de alguns OPCs purificadas em poli-D-lisina revestido 24 placas bem por imunocoloração com anti-NG2 sulfato de condroitina proteoglycan (NG2) Anticorpo como anteriormente publicado materiais⁹.

2. Low-celular ChIP preparação e construção de biblioteca de ChIP para arranjar em sequência do elevado-Throughput

1. Preparação de ChIP de celular Low Olig2 com um sistema de sonication comercialmente disponíveis e um número de celular baixa disponível comercialmente ChIP kit (veja a tabela de materiais), seguindo os procedimentos padrão detalhados de instruções do fabricante.
   1. Após desanexação do rato anti-PDGFRα placa revestida de anticorpo e a célula contando com trypan azul e um hemocytometer colocam 20.000 OPCs purificadas em meio de cultura celular 1ml OPC para cada reação do ChIP.
   2. Adicione 27 µ l de 36,5% de formaldeído para consertar a suspensão de células para 10 min à temperatura ambiente.
      Atenção: Por favor, note que o formol deve ser usado na coifa química por razões de segurança.
   3. Pare de ADN-proteína cross-linking com glicina de 2,5 M 50 µ l por 5 min à temperatura ambiente.
      Nota: Todas as etapas devem ser realizadas no gelo ou no quarto frio de 4 ° C a partir deste ponto.
   4. Lave as pelotas de célula reticulado com 1 mL de gelado Hanks equilibrado sal solução (HBSS) com inibidor de protease cocktail e obter células peletizadas por uma centrífuga previamente arrefecida a 300 x g a 4 ° C.
   5. Lyse o centrifugado em 25 µ l completa Lise para 5 min no gelo.
      Nota: Agite o tubo para suspender as células em tampão de Lise.
   6. A célula lisado com 75 µ l gelada HBSS contendo cisalhamento e inibidor da protease cocktail a cromatina da célula lisada por pre-refrigeração sistema sonication com 5 ciclos de 30 ON s e 30 s OFF programa de suplemento. Sempre proceda à sonicação 6 tubos juntos e certifique-se que os tubos de equilíbrio contêm 100 µ l água.
   7. Após a tosquia, centrifugar a 14.000 x g durante 10 minutos 4 ° C e recolher o sobrenadante em um novo tubo após a centrifugação.
   8. Dilua 100 µ l de cromatina cortada com o volume igual de gelada Buffer completo do ChIP com o inibidor de protease.
   9. Salve 20 µ l da cromatina cortada diluída como exemplo de controle de entrada.
      Nota: Exemplo de controle de entrada também é necessário como a comparação com amostra de immunoprecipitated Olig2 para identificar Olig2 anticorpo immunoprecipitated DNA.
   10. Adicionar 1 µ l de anticorpo anti-olig2 180 µ l do diluídos distorcido da cromatina e incubar o tubo de reação em uma roda rotativa a 40 rpm para 16 h a 4 ° C.
       Nota: Execute esta etapa em uma sala fria.
   11. Para cada reação de ChIP, lave 11 µ l proteína magnético revestido A grânulos com 55 µ l tampão de lavagem de contas e colocar o grânulo de pelotas em 11 µ l de tampão de lavagem do grânulo após 2 lavagens.
       Nota: Execute esta etapa em uma sala fria.
   12. Para cada reação de ChIP, adicione 10 µ l de grânulos revestidos à proteína pre-lavados para tubo de reação de ChIP. Execute esta etapa em uma sala fria.
   13. Incube o tubo de reação de ChIP a 4 ° C para outro h 2 em uma roda giratória.
   14. Coloque o tubo de reação de ChIP na prateleira magnética por 1 min.
       Nota: Execute esta etapa em uma sala fria.
   15. Remover o sobrenadante e não desalojar a pelota do grânulo.
   16. Lave a pelota do grânulo com 100 µ l de cada um dos 4 buffers de lavagem respectivamente por 4 min em uma roda rotativa a 4 ° C.
   17. Após lavagens, adicionar 200 µ l de tampão de eluição para a pelota do grânulo e incubar o tubo de reação de ChIP a 65 ° C por 4 h inverter as ligações cruzadas proteína-ADN.
   18. Além disso, adicionar 180 µ l de tampão de eluição para 20 µ l da amostra controle entrada e incubar a 65 ° C por 4 h inverter as ligações cruzadas proteína-ADN também.
   19. Adicione a mistura de 25:24:1 (v/v) 200 µ l de álcool isoamílico, clorofórmio e fenol a cada tubo de reação de ChIP.
   20. Vórtice vigorosamente durante 1 min e centrifugar a 13.000 x g durante 15 minutos à temperatura ambiente. Transferi a fase superior para um novo tubo.
   21. Adicionar a solução de acetato de sódio de 3 M 40 µ l, 1.000 µ l de etanol 100% e 2 µ l de glicogênio precipitado covalentemente ligado a um corante azul para cada tubo de reação de ChIP durante a noite a-20 ° C.
   22. Centrifugar a 13.000 x g por 20 min a 4 ° C.
   23. Desprezar o sobrenadante, lavar com 500 µ l 70% álcool etílico frio e centrifugar a 13.000 x g por 20 min a 4 ° C.
   24. Desprezar o sobrenadante, manter o ar de pellet seco por 10 min e dissolva a pelota com 50 água µ l.
2. Construção de biblioteca microplaqueta para arranjar em sequência do elevado-throughput
   1. Limpar e concentrar o ChIP de DNA com um kit de limpeza de acordo com as instruções dos fabricantes.
   2. Quantificar a amostra do ChIP por um verde-pico de acordo com as instruções do fabricante.
   3. Use um kit de ChIP-seq para T-tailing, replicação e rejeito, modelo switching e extensão, a adição de adaptadores e amplificação, seleção de tamanho de biblioteca e purificação de acordo com as instruções do fabricante.
      1. Após desnaturação de dsDNA, dephosphorylate extremidade 3' do ssDNA pela fosfatase alcalina do camarão e adicione uma cauda poli (T) para o ssDNA pelo terminal deoxynucleotidyl transferase.
      2. Recoze a cartilha de DNA poli (dA) para o modelo ssDNA para a replicação do DNA e a troca de modelo.
      3. Após a mudança de modelo, amplifica a ChIP-seq biblioteca por PCR com primers para diante e reversos para indexação.
      4. Selecione o PCR amplificados ChIP-seq biblioteca com fragmentos que variam de 250 a 500 bp por grânulos paramagnéticos pela opção 2 para a seleção de tamanho duplo.
      5. Análise da qualidade da biblioteca de ChIP-seq selecionada usando um dispositivo de eletroforese capilar-microplaqueta microfluidic.

3. análise de dados

1. Prepare a estrutura de diretório.
   1. Crie um diretório para realizar a análise de dados do ChIP-seq. Dentro do diretório recém-criado, criar seis subdiretórios com os seguintes nomes: raw.files, fastqc.output, bowtie.output, homer.output, macs2.output, motif.analysis e relatórios.
2. Preparar dados e realizar a análise de controle de qualidade de dados de sequência primas.
   1. Mova para o diretório "raw.files" e baixar os arquivos de dados do ChIP-seq.
   2. Verifique se os nomes de arquivos. Se a sequência foi emparelhado-fim, haverá 4 arquivos (duas para tratamento) e duas para a entrada com nomes similares de base: PDGFRα_Olig2.read1.fastq, PDGFRα_Olig2.read2.fastq, PDGFRα_input.read1.fastq e PDGFRα_input.read2.fastq. Se os nomes dos arquivos são diferentes, renomeá-los usando o comando "mv".
   3. Mover para o diretório "fastqc.output".
   4. Obter métricas de controle de qualidade das crus leituras usando um fastq arquivo controle de qualidade de software¹⁰. Use o comando na Figura S1A para executar o processo de controle de qualidade, separadamente para cada arquivo de fastq. O software irá exibir várias métricas de controle de qualidade em um arquivo html.
   5. Abra o arquivo de controle de qualidade de html e verifique se o número de leituras, ler o comprimento, por qualidade de sequência de base, por escores de qualidade de sequência, sequência GC, níveis de duplicação de sequência, adaptador kmer teores e.
3. Guarnição à direita leituras de baixa qualidade e conteúdo de adaptador.
   1. Observe a "por qualidade de sequência de base" e "Adaptador conteúdo" parcelas. Determine o comprimento de corte para a cabeça e a cauda de cada leitura. Um comprimento adequado para aparar é onde a base qualidade cai abaixo de 30, e há evidências de conteúdo do adaptador.
   2. Mover para o diretório "raw.files".
   3. Baixe e instale um software para aparar leituras¹¹. Use o comando na Figura S1B para aparar o tratamento e a entrada separadamente. Parâmetro 'Lavoura' indica o comprimento de leitura restante depois de aparar as bases da extremidade e 'HEADCROP' especifica o número de bases de ser eliminados desde o início da leitura.
   4. O comando aparar também inclui o mínimo ler comprimento admitidas após a filtragem no parâmetro 'MINLEN'. Se as leituras são pelo menos 50 bp, bp uso 35 como o limite de comprimento de leitura.
   5. Mover para o diretório "fastqc.output".
   6. Realizar a análise de controle de qualidade do arquivo de fastq depois de aparelhar o lê. Verifique se que as questões de controle de qualidade foram resolvidas. Use o comando na Figura S1C para obter as métricas de controle de qualidade.
4. Alinhe o lê ChIP-seq single-end ou emparelhado-end para o genoma de referência de rato.
   1. Mover para o diretório "bowtie.output" para o mapeamento.
   2. Baixe o genoma de referência GENCODE mm10 rato. Renomear o genoma de referência de rato mm10 como "mm10.fa".
   3. Baixe um mapeador leia¹² e instalá-lo no sistema.
   4. Crie um arquivo de índice do genoma de referência baixado usando o comando no S2A figura. Seis arquivos são criados automaticamente: mm10.1.bt2, mm10.2.bt2, mm10.3.bt2, mm10.4.bt2, mm10.rev.1.bt2 e mm10.rev.2.bt2.
   5. Use o comando na Figura S2B para executar o alinhamento e ajuste o parâmetro "-p" para o número de núcleos de processamento, de acordo com as configurações do sistema. Se executar o modo emparelhado-fim, parâmetros "-1" e "-2" indicam os nomes dos arquivos fastq aparadas.
      Nota: O mapeamento é executado separadamente para as amostras de entrada e tratamento e arquivos de log de métrica de saída são criados para cada amostra.
   6. Download de um software para manipulação de arquivos em formato de SAM¹³ e instalá-lo no sistema. Converta o arquivo SAM alinhado em um arquivo BAM usando o comando no S2C figura.
5. Obter métricas de controle de qualidade de leituras mapeadas antes pico chamando para ambas as amostras emparelhado-final de tratamento e controle.
   1. Dentre as métricas de controle de qualidade mais importantes para o endereço é a profundidade de sequenciamento. Abra os arquivos "log.bowtie.PDGFRα_Olig2.txt" e "log.bowtie.PDGFRα_input.txt" no diretório bowtie.output e verifique se o número de pares de leitura exclusivamente mapeadas em cada amostra é maior que 10 milhões.
   2. Mover para o diretório "homer.output".
   3. Baixar um software para a descoberta do motivo e sequenciamento de próxima geração análise¹⁴ e instalá-lo no sistema.
   4. Crie um diretório chamado "tagDir".
   5. Para verificar clonality marca, use o comando retratado na Figura S3A. O comando "makeTagDirectory" irá gerar quatro files:tagAutocorrelation.txt de saída do controle de qualidade, tagCountDistribution.txt, tagInfo.txt e tagLengthDistribution.txt.
   6. Mover para o diretório "tagDir".
   7. Copie o arquivo "tagCountDistribution.txt" no diretório "relatórios".
   8. Mover para o diretório "relatórios".
   9. Abra o arquivo tagCountDistribution.txt usando um programa de planilha e criar um bar trama do número de marcas por posição genômica. Armazene o arquivo de histograma com o nome "tag.clonality.xlsx".
   10. Instale R programação linguagem¹⁵ no sistema.
   11. No terminal, digite 'R' e pressione ENTER para acessar o ambiente de programação de R.
   12. Baixe um pacote de R para o processamento de dados do ChIP-seq¹⁶ e instalá-lo usando o comando retratado na Figura S3B.
   13. Use o script de R na Figura S3C para plotar a vertente correlação cruzada.
6. Deteção de picos usando um mapeador de pico.
   1. Mover para o diretório "macs2.output". Baixe e instale um mapeador de pico¹⁷ em seu sistema.
   2. Use a função "callpeak" com o tratamento e controlar arquivos BAM gerados na etapa 3.4.6.
      Nota: Outros parâmetros incluem "-f" para o formato de arquivo de entrada, "-g" para o tamanho do genoma, "-nome" para indicar o nome de base de todos os arquivos de saída, e "-B" para armazenar o engavetamento de fragmento no formato bedgraph. O pico completo chamando o comando está incluído na Figura S4A. Use BEDPE para amostras de ponta emparelhado.
   3. Verifique se que o mapeador de pico gerou seis arquivos: PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.narrowPeak, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_summits.bed, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_model.r, PDGFRα_Olig2_vs_ PDGFRα_input_control_lambda.bdg e PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_treat_pileup.bdg.
   4. Abrir o arquivo PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls para ver os picos de chamadas, localização, comprimento, posição cimeira, engavetamento e as métricas de enriquecimento de pico:-log10(pvalue), dobre o enriquecimento e - log10(q-value).
7. Filtrar e anotar os chamados picos.
   1. Usando o arquivo aberto na etapa anterior, filtro resultando picos de acordo com o enriquecimento de dobra, o p-valor e/ou o valor de q. Para decidir os limiares de filtragem adequados, fazer um gráfico de histograma para determinar a densidade de cada métrica. Filtre valores abaixo de um limite selecionado para obter picos significativos.
   2. Baixar a lista negra mm10 (regiões são sabidas para ter sinal artificialmente elevado) e filtrar o ChIP-seq picos que estão dentro dessas regiões de artefato.
   3. Criar um arquivo de cama com picos de filtrado contendo as seguintes colunas: cromossomo, início, fim, peakID, simulação e vertente. Preencher a coluna simulada com um ponto "." uma vez que não é usado. Na coluna de vertente, definir todos os valores "+". Salve o arquivo de cama como "filtered.peakData2.bed".
   4. Copie o arquivo "filtered.peakData2.bed" no diretório "relatórios".
   5. Mover para o diretório "relatórios".
   6. Para anotar picos filtrados para uma região do gene específico, use a função "annotatePeaks" com o arquivo de cama criado na etapa anterior. O comando usado é mostrado na Figura S5A.
   7. Abra o arquivo "filtered.annotatedPeaks.txt" usando um software estatístico.
   8. Filtro resultantes picos deitado em uma região intergênica a uma distância superior a 5 kb de um TSS anotada. Use a coluna de "Distância de SST" no arquivo como a distância para filtragem. Armazene os picos filtrados em um arquivo do excel chamado "5kbup.geneBody.peakData.txt".
   9. Loja resultante filtrada picos em um arquivo bedGraph com colunas: cromossomo, início, fim e - log10(q-value). Nomeie o arquivo "5kbup.geneBody.peakData.bedGraph".
8. Gere arquivos de figurão para visualização do navegador.
   1. Baixe e instale um software para aritmética de genoma¹⁸.
   2. Baixar uma ferramenta para converter bedgraph para graúdos e instalar no sistema. Baixe o arquivo 'mm10.chrom.sizes'.
   3. Use o comando na Figura S6A para gerar um arquivo de manda-chuva.
   4. Baixe e instale um navegador de genoma¹⁹ no sistema.
   5. Abra o navegador de genoma e carregar o arquivo "5kbup.geneBody.peakData.bigwig" para visualizar os picos significativos filtrados e sua localização em relação a genes conhecidos.
9. Busca do motivo.
   1. Mover para o diretório "motif.analysis".
   2. Baixar um programa de enriquecimento de motivo e de novo motivo digitalização e instalá-lo em seu sistema de²⁰.
   3. Baixe um tema abrangente banco de dados que inclui motivos de Olig2.
   4. Obter as sequências genômicas de 500 regiões de bp, centradas nas cimeiras de pico significativo. Armazene as sequências como peak.sequences.txt. Use o comando na Figura S7 para procurar motivos de Olig2 dentro de cada uma das 500 bp pico regiões.
   5. Filtrar os motivos resultantes usando um valor adequado E (padrão = 0,05).

Realizou-se baixo-celular ChIP-seq e bioinformatic análises foram feitas para investigar as potenciais interações do fator transcricional Olig2 com DNA genômico no cérebro agudamente purificado OPCs. A Figura 1 mostra um fluxo de trabalho geral de ambos os experimentais e os procedimentos de análise de dados. Neste protocolo, cérebros de ratos pós-natal foram dissociados em uma suspensão de célula única. Após dissociação de tecido, immunopanning foi realizada para purificar OPCs usando anticorpo PDGFRα. A Figura 2 mostra o significativo enriquecimento de PDGFRα, pouca expressão do marcador neurônio Tuj1 (neurônio específico classe III beta-tubulina), marcador astrocyte GFAP (glial fibrilar ácida da proteína), microglia adaptador de ligação de cálcio ionizado de marcador molécula 1 (Iba1), microambiental maduro oligodendrócitos marcador mielina básica da proteína (Mbp) e glicoproteína mielina-oligodendrocyte (Mog) de OPCs purificadas avaliado pela RT-qPCR. Além disso, immunostaining resultado indica que a maioria das células são NG2 positivos, conforme mostrado na Figura 2. Posteriormente, 20 mil OPCs purificadas por reação foram fixados por formaldeído e cromatina foi cortada por meio de um sistema de sonication. Olig2 baixo-celular ChIP foi realizada e a biblioteca foi construída. Após a preparação de biblioteca do ChIP, a qualidade do produto gerado foi validada por um dispositivo de eletroforese capilar-microplaqueta microfluidic. A Figura 3 mostra uma exemplo de electroferograma de uma biblioteca de ChIP de celular de baixo Olig2. Um produto de biblioteca clara pico de Oligo2 que variam de 250 a 500 bp deve ser visível após a seleção do tamanho do produto PCR de biblioteca. As bibliotecas de ChIP-seq de ambos a amostra preparada com anticorpos de factor de transcrição Olig2 e as amostras de controlo foram submetidas para sequenciamento de alto rendimento para produzir emparelhado-final 50 ciclo de leituras de sequenciamento. Comprimentos mais longos leitura irão melhorar as taxas de mapeamento e reduzir a probabilidade de mapeamento multi, em detrimento dos custos de sequenciamento. Com 50 bibliotecas de bp ChIP-seq emparelhado-final sequenciamento, bons resultados são alcançados geralmente.

Após a avaliação inicial de controle de qualidade de leituras crus e aparar de adaptadores e à direita de pares de base de baixa qualidade, as parcelas de controle de qualidade são representadas na Figura 4. Aparada leituras devem ter uma base maior que 30, não há sequências de adaptador, de qualidade e têm uma taxa baixa de duplicação (Figura 4B-D). Boa qualidade aparada lê aumentará a taxa global de alinhamento. Outros parâmetros como conteúdo GC também são importantes e devem ser considerados para o aparamento.

Uma vez que as amostras de sequenciamento são alinhadas, é necessário verificar a profundidade de sequenciamento. É sabido que aumentará o número dos chamados picos com uma maior profundidade de sequenciamento desde sites fracos se tornará mais estatisticamente21. É necessária uma análise de saturação para determinar uma profundidade suficiente de sequenciamento para cada fator de transcrição específicos utilizado, à custa de tempo e orçamento. Uma profundidade de sequenciamento de consenso para ligação do fator de transcrição foi sugerida pelo consórcio ENCODE sobre amostras de mamíferos: um mínimo de 10 milhões exclusivamente mapeado leituras para cada um dos biológicos de pelo menos dois Replica22. O número de leituras exclusivamente mapeadas e a taxa de alinhamento global foram calculado pelo mapeador de leitura. Um exemplo de métricas mapeamento bom é mostrado na Figura 5A. Alinhado leituras devem ser mapeadas para distintas localizações genômicas, indicando uma complexidade de biblioteca adequada, também conhecida como clonality marca. O consórcio ENCODE sugere que pelo menos 80% da 10 milhões de leituras alinhadas deve ser mapeado para diferentes regiões genômicas22. Figura 5B mostra um clonality etiqueta adequada em que mais de 90% das leituras são mapeados para apenas um local de genômico. Bibliotecas de baixa complexidade geralmente ocorrem quando não suficiente DNA é obtido, e o PCR amplificados fragmentos sequenciados repetidamente. Uma biblioteca de baixa complexidade renderá uma taxa de detecção de pico elevado de falsos.

Quando usando dados de ChIP-seq emparelhado-end, fragmentos bind em torno do fator de transcrição com uma certa distância de separação. Emparelhado-final sequenciamento permitirá uma estimação mais acurada do comprimento do fragmento média rendendo uma melhor estimativa das regiões genômicas onde ocorreram mais vinculativos. O enredo de correlação de vertente retrata um pico de enriquecimento correspondente ao comprimento de fragmento predominante. Como observado na Figura 5, o comprimento do fragmento calculado é 130 bp Considerando o comprimento de leitura é 50 bp. Um dataset de ChIP-seq, onde o comprimento do fragmento é maior que o comprimento de leitura é indicativo de alta qualidade16.

A saída da chamada de pico é uma lista de regiões genômicas prováveis em respeitar o fator de transcrição (ou seu complexo). Lista de regiões genômicas ou picos está incluída em um arquivo de "cama" que pode ser visualizado em um navegador de genoma. Para cada pico, este arquivo contém um ID de pico, a localização de genômica da Cimeira de pico e o FDR como - log10 (q-valor). Os picos significativamente enriquecidos são aqueles com maior enriquecimento de dobra e métricas de significado. Um exemplo de arquivo de pico de saída é mostrado na figura 6A. Após a seleção de picos significativos usando limiares personalizados, filtragem picos dentro lista negra23 do ENCODEe identificar picos na região de promotor de um gene (corpo de upstream e todo gene 5KB), um arquivo de "figurão" é útil para a visualização de picos em um genoma Navegador. Mais enriquecido pico regiões têm uma maior probabilidade de ligação do fator de transcrição. É importante confirmar a presença de pico em regiões reguladoras do fator da transcrição conhecida, bem como a ausência de pico nas regiões onde a ligação do fator de transcrição é improvável. Figura 6B -E mostra exemplos de regiões de gene com e sem enriquecimento de pico, bem como sua localização em relação a regiões de promotor ENCODE.

In silico métodos complementares para o experimento de ChIP-seq são análise de enriquecimento do motivo e de novo a busca do motivo. Desde que a ligação de Olig2 em OPCs não tem sido estudada antes, Olig2 ChIP-seq derivado picos em células progenitoras de neurônio motor e células-tronco embrionárias foram usadas para244,identificação do motivo de novo . Olig2 de novo identificados motivos foram adicionados para o abrangente banco de dados do motivo ENCODE25 e realizou-se análise de enriquecimento do motivo. Alto enriquecimento do novo de identificado OLIG2 motivos e motivos de (HDAC2, SP1, FOXP1, NR3C1, NFKB2/4, 3/SMAD2, PAX5 e ASCL1) de fator de transcrição conhecidos foram encontrados em ChIP-seq picos de células PDGFRα purificado. Um enriquecimento de 30 motivos de novo identificadas com um valor E < 0.05 foi descoberto. A Figura 7 mostra os motivos de novo de identificados dois principais dos Olig2. Estes dois motivos de Olig2 de novo identificados foram encontrados em > 60% dos picos do ChIP-seq obtidos de células PDGFRα purificado, além de motivos conhecidos.

Figura 1: visão geral do fluxo de trabalho protocolo. PDGFRα positivo OPCs foram isoladas a partir de cérebro de rato pós-natal e estavam sujeitos a Olig2 ChIP experimentar. Os fragmentos de DNA precipitados foram utilizados para a preparação de biblioteca de ChIP. Após a avaliação da qualidade da biblioteca, as amostras foram usadas para sequenciamento. Conjuntos de dados foram analisados e foram identificados picos, indicando potenciais sítios de ligação Olig2 em OPC purificado de células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: avaliação da pureza de immunopanned OPCs por qPCR e imunocoloração. Células de immunopanned (A) PDGFRα anticorpo foram semeadas e imunocoloração foi realizada com anticorpo de marcador NG2 linhagem OPC. Azul: DAPI, verde: NG2. Barra de escala = 10 µm. (B) o nível de expressão relativa do marcador do neurônio Tuj1 em purificada OPCs (PDGFRα +) e células cerebrais dissociada (mistura) foram avaliados. Tuj1 expressão em células cerebrais dissociada foi definido como 1. (C) o nível de expressão relativa de astrocyte marcador GFAP em purificada OPCs (PDGFRα +) e células cerebrais dissociada (mistura) foi avaliada. Expressão de GFAP em células cerebrais dissociada foi definido como 1. (D) o nível de expressão relativa do OPC marcador PDGFRα em purificada OPCs (PDGFRα +) e células cerebrais dissociada (mistura) foi avaliada. Expressão de PDGFRα nas células do cérebro dissociada foi definido como 1. (E) o nível de expressão relativa do marcador de oligodendrócitos maduros microambiental Mog em purificada OPCs (PDGFRα +) e células cerebrais dissociada (mistura) foi avaliada. Mog expressão nas células do cérebro dissociada foi definido como 1. (F), o nível de expressão relativa do marcador de oligodendrócitos maduros microambiental Mbp em purificada OPCs (PDGFRα +) e células cerebrais dissociada (mistura) foi avaliada. MBP expressão nas células do cérebro dissociada foi definido como 1. (G), o nível de expressão relativa de micróglia marcador Iba1 purificados OPCs (PDGFRα +) e dissociado cérebro células (mistura) foi avaliada. Iba1 expressão em células cerebrais dissociada foi definido como 1. Dados em B-G representam experimentos triplicados e barras de erro indicam o erro padrão. T-teste de análise * P < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: uma electroferograma exemplo de uma biblioteca de ChIP de celular de baixo Olig2. Após a seleção de tamanho duplo, a qualidade da biblioteca de Olig2 ChIP foi analisada por um dispositivo de eletroforese capilar-microplaqueta microfluidic. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: resultados representativos de controle de qualidade para uma amostra de ChIP-seq baixo-célula de leitura comprimento 50 bp. Quadro-resumo (A) representando o número total de leituras, o número de leituras de má qualidade, comprimento de sequência e teor total de GC. (B) parcela indicando a distribuição dos escores de qualidade de base em posições diferentes na lê. (C) enredo mostrando os possíveis conteúdos de adaptador em posições diferentes na lê. (D) linha trama indicando a porcentagem de duplicados de sequências. A maioria das leituras se originam de sequências que ocorrem somente uma vez dentro da biblioteca, por conseguinte, indicando uma taxa baixa de duplicação ou biblioteca de alta complexidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: métricas de controle de qualidade obtidos antes de chamar de pico: métricas de alinhamento bowtie2, vertente correlação cruzada e tag clonality. (A) métricas de alinhamento obtido a partir o mapeador de leitura. As métricas mais importantes são o número de pares de leitura exclusivamente mapeadas, indicada como "alinhado respondendo exatamente 1 vez" e a taxa de alinhamento global. (B) histograma mostrando o clonality marca. As barras indicam a porcentagem de genômicas posições onde etiquetas foram encontradas. (C) um exemplo de uma trama de correlação cruzada, indicando dados de boa qualidade. Linhas vermelhas mostram o comprimento Leia a 50 bps e o comprimento do fragmento predominante a 130 bps. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: regiões de pico de ChIP-seq e vistas de navegador do genoma dos picos de ChIP-seq significativas em diferentes localizações genômicas. (A) exemplo das regiões identificadas com o chamador de pico pico. (B) significativa ChIP-seq picos encontraram no corpo de Cspg4, um conhecido marcador genético da OPC gene. (B) não há picos de ChIP-seq foram encontrados nas regiões do promotor, ou no âmbito dos organismos de gene de Mbp gene, um marcador para maduros oligodendrócitos, Tubb3 (C), um marcador de célula neuronal, ou (D) GFAP, um marcador de célula de astrócitos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: altamente enriquecido de novo identificados motivos de Olig2 encontrados em picos de PDGFRα-Olig2 ChIP-seq. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura S1: preparação de conjuntos de dados do ChIP-seq. (A) definição de arquitetura de diretório. (B) calcular cru ler métricas de controle de qualidade. (C) aparamento de leituras. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura S2: alinhamento de leituras para o genoma de referência. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura S3: controle de qualidade de leituras alinhadas, para endereço vertente correlação cruzada e determinar clonality marca. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura S4: chamada pico. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura S5: anotação dos picos significativos. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura S6: conversão de formato de arquivo de bedGraph com grande para visualização de pico no navegador genoma. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura S7: enriquecimento de busca e motivo de motivo De novo . Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura S8: Flow-chart descrevendo a análise Bioinformática dos dados do ChIP-seq. Clique aqui para baixar este arquivo.

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.