Um modelo de Mouse quimérico fígado humano de hipercolesterolemia familiar usando hepatócitos de derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar um modelo de rato quimérico fígado humano de hipercolesterolemia familiar, usando hepatócitos de células-tronco derivadas de humanas pluripotentes induzidas. Este é um modelo valioso para testar novas terapias para hipercolesterolemia.

Resumo

Hipercolesterolemia familiar (FH) é principalmente causada por mutações do receptor (LDLR) de lipoproteína de baixa densidade e resulta em um aumento do risco de doença cardiovascular precoce devido à marcada elevação de LDL colesterol (LDL-C) no sangue. As estatinas são a primeira linha de drogas hipolipemiantes para tratamento de FH e outros tipos de hipercolesterolemia, mas estão surgindo novas abordagens, em particular PCSK9 anticorpos, que agora estão sendo testados em ensaios clínicos. Para explorar novas abordagens terapêuticas para FH, novas drogas ou novas formulações, nós precisamos apropriado na vivo de modelos. No entanto, diferenças nos perfis metabólicos lipídios em comparação com os seres humanos são dos principais problemas dos modelos animais disponíveis de FH. Para resolver esse problema, geraram um modelo de rato quimérico fígado humano usando células-tronco pluripotentes FH induzida (iPSC)-derivado de hepatócitos (iHeps). Utilizamos camundongos/Ldlr^{- / -}/Rag2^{- / -}/Il2rg^{- / -} (LRG) para evitar rejeição imune de células humanas transplantadas e avaliar o efeito do LDLR-iHeps deficientes em um LDLR nulo de plano de fundo. Transplantado FH iHeps poderíamos repovoar a 5-10% do fígado do rato LRG baseado na coloração de albumina humana. Além disso, o iHeps engrafted respondeu às drogas hipolipemiantes e recapitulada observações clínicas de maior eficácia de anticorpos PCSK9 comparado com estatinas. Nosso modelo de fígado humano quimérico, portanto, poderia ser útil para testes pré-clínicos de novas terapias para FH. Usando o mesmo protocolo, semelhantes humanos fígados quiméricoes ratos para outras variantes genéticas de FH, ou mutações correspondente a outras doenças hereditárias do fígado, também pode ser gerado.

Introdução

Receptor da lipoproteína de baixa densidade (LDLR) capta o colesterol LDL (LDL-C) no sangue de modular a síntese de colesterol no fígado. Mutações no gene LDLR são a causa mais frequente de hipercolesterolemia familiar (FH)¹. As estatinas têm sido, tradicionalmente, a primeira linha de medicação para tratar a FH e outros tipos de hipercolesterolemia (herdada ou adquirida). As estatinas inibem a 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A redutase para reduzir a síntese de colesterol no fígado². Além disso, as estatinas aumentam os níveis de LDLR na superfície do hepatócito para promover plasma apuramento de LDL-C. No entanto, uma ressalva importante do tratamento com estatinas é que simultaneamente induzem a expressão de proprotein convertase subtilisina/hexin 9 (PCSK9), uma enzima que se liga ao LDLR para promover sua degradação³. Este efeito é responsável para a resposta insuficiente ou mesmo nula de estatinas observadas em muitos pacientes. Estudar este mecanismo, inesperadamente, levou à descoberta de uma forma alternativa para tratar a hipercolesterolemia. Anticorpos PCSK9 recentemente aprovados pela FDA estão sendo usados atualmente em ensaios clínicos e mostram maior eficácia e melhor tolerância do que as estatinas⁴. O sucesso de anticorpos PCSK9 implica também que pode haver outras possibilidades terapêuticas para modular a via de degradação de LDLR (além de PCSK9) em pacientes com hipercolesterolemia. Da mesma forma, não há interesse em desenvolver novos inibidores de PCSK9 diferente de anticorpos, por exemplo, siRNA oligos⁵.

Para testar novas terapias para FH e em geral qualquer outro tipo de hipercolesterolemia, modelos apropriados na vivo são necessários. Um grande problema do atual na vivo modelos, principalmente de ratos⁶ e⁷, de coelhos são suas diferenças fisiológicas com seres humanos. Crucialmente, esses problemas incluem um perfil metabólico diferente de lipídios. A geração de animais quimérico fígado humano⁸ pode ajudar a superar esta ressalva. O mouse quimérico fígado humano é um tipo de mouse "humanizado", com seu fígado repovoado com hepatócitos humanos, por exemplo, de hepatócitos humanos primários (pHH)⁹. Um problema com poeira é que não podem ser expandidos ex vivo, rapidamente perdem sua função após o isolamento, e são uma fonte limitada. Uma alternativa a poeira é o uso de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC)-derivado de hepatócitos (iHeps)¹⁰. Nomeadamente, iPSCs são específicas do paciente e podem ser cultivadas indefinidamente, então iHeps podem ser produzidos sob demanda, que é uma vantagem significativa sobre pHH fresco. Além disso, iPSCs pode também ser facilmente alterado geneticamente com nucleases desenhador para corrigir ou introduzir mutações em um plano isogénicas para permitir mais fiel comparações¹¹.

Humano rato quimérico fígado com poeira engrafted mostrar semelhanças aos seres humanos no fígado perfis metabólicos, respostas de droga e susceptibilidade à hepatite vírus infecção¹². Isso os torna um bom modelo para estudar hiperlipidemia na vivo. Os modelos do rato mais utilizados baseiam-se o rato/Fah^{- / -}/Rag2^{- / -}/Il2rg^{- / -} (FRG)¹³ e a uPA rato transgénico⁸, em que até 95% do mouse o fígado pode ser substituído por poeira. Curiosamente, um relatório recente descreveu um humano FH fígado quimérico mouse (baseado no mouse FRG) com poeira de um paciente carregando um homozigoto para a mutação LDLR ¹⁴. Neste modelo, os hepatócitos humanos repovoados não tinham nenhum LDLR funcional, mas os hepatócitos de rato residual, reduzindo assim o utilitário para a realização na vivo testes de drogas que depender da via LDLR.

Aqui, nós relatamos um protocolo detalhado, baseado em nosso trabalho recentemente publicado¹⁵ para engrafting FH iHeps no fígado do rato/Ldlr^{- / -}/Rag2^{- / -}/Il2rg^{- / -} (LRG). Este rato quimérico fígado humano é útil para a modelagem de FH e realizando testes de droga in vivo.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui que envolvem a utilização de animais foram aprovados pelo Comité sobre o uso de animais vivos no ensino e pesquisa (CULATR) da Universidade de Hong Kong.

1. preparação e testes fenotípicos de rato

1. Geração de ratos de nocaute (KO) Ldlr imunodeficientes.
   1. Use os ratos cepas Ldlr^{- / -}, Rag2^{- / -}e Il2rg^{- / -} (ver Tabela de materiais).
   2. Cruz Rag2^{- / -} ratos com Il2rg^{- / -} ratos para gerar Rag2^{- / -}/ Il2rg^{- / -} ratos, então cruzar Ldlr^{- / -} ratos com Rag2^{- / -} / Il2rg^{- / -} ratos para gerar de camundongos/Ldlr^{- / -}/Rag2^{- / -}/Il2rg^{- / -} (LRG)¹⁵. Com a idade de 3 a 4 semanas, colete DNA genômico de orelha para determinar o genótipo por PCR e sequenciamento.
   3. Com a idade de 8 a 12 semanas, use camundongos machos LRG como destinatários para iHeps para gerar ratos quiméricoes fígados humanos.
2. Alimente os ratos com uma dieta de alto teor de gordura e colesterol (HFHC) 7 dias antes do transplante iHep para ajudá-los a desenvolver a hipercolesterolemia.
3. Para induzir a lesão hepática, o que facilita a proliferação de engrafted iHeps no fígado, coloque o rato em um recipiente estéril e irradiá-los usando um irradiador gama com raios-γ na dose de 3 Gy 24 h antes da enxertia. Em seguida, retorne os ratos para suas gaiolas de habitação. O status Íntegro destes ratos irradiados podem ser monitorado pela medição do seu peso.  Vão ser sacrificados, ratos com perda de peso de 20% ou mais.

2. iHep diferenciação e dissociação

LDLR KO heterozigoto (+ /-) ou homozigotos iPSCs humana de KO (- / -) ou paciente FH-iPSCs com mutações heterozigotas LDLR (FH iPSCs) são usados para produzir iHeps. A geração de LDLR + ou- / - iPSCs e iPSCs FH é descrito no nosso anterior relatório¹⁵.

1. Diferenciação dirigida de iPSCs em iHeps
   Nota: O método para diferenciação de iPSCs humana em iHeps é modificado de uma anterior relatório¹⁶.
   1. Três dias antes da diferenciação (dia -3), sementes de iPSCs sobre matriz extracelular revestido placas 6-bem (ver Tabela de materiais) com uma densidade de 300.000 células/poço em 1,5 mL (também adiante) do meio de manutenção de iPSC humana (veja tabela de materiais ) suplementado com inibidor ROCK 5 µM (Y27632). Cultura de células a 37 ° C numa incubadora umidificado 5% CO₂ . Normalmente, o iHeps de uma placa de 6 são suficientes para engraft 5 ratos.
   2. 24 horas depois (dia -2) e 48 h depois (dia -1), mudar o meio a meio de manutenção de iPSC humano fresco sem inibidor ROCK.
      Nota: iPSCs antes de diferenciação deve expressar altos níveis de OCT4 e NANOG, que pode ser examinada por RT-PCR quantitativo, imunofluorescência ou citometria de fluxo.
   3. No dia 0 de diferenciação, lave as células com RPMI 1640 uma vez e adicione RPMI 1640 suplementado com Activin A de 100 ng/mL e 25 ng/mL WNT3a.
   4. No dia 1 e dia 2 de diferenciação, mudar o meio para RPMI 1640 suplementado com 100 ng/mL Activin A.
      Nota: Se há muita morte celular nesta fase (dias 0-3), até 0,5% de soro fetal bovino (FBS) pode ser adicionado ao meio para melhorar a viabilidade celular. No entanto, recomendamos que teste a quantidade mínima de FBS a ser adicionado para cada linha de iPSC específicas, como FBS em excesso também pode afetar a diferenciação.
   5. No dia 3, lavar as células com DMEM uma vez e então mudar para 2 médias de palco^nd (substituição de 20% de soro, 1 x não aminoácidos essenciais, 2 M L-glutamina, 0,1 M beta-Mercaptoetanol e dimetilsulfóxido 1% em meio DMEM). Altere o meio de todos os outros dias até o dia 10.
      Nota: No dia 7, as células devem chegaram a confluência e exibir bordas claras. Pode haver algumas áreas indiferenciadas que aparecem nesta fase; ignoro se a percentagem dessas áreas é pequena. Se a porcentagem é alta, reduzir a confluência de iPSCs no dia 0 e reduzir a quantidade de FBS usado no primeiro estágio de diferenciação.
   6. No dia 10, lave as células com o meio basal de hepatócitos uma vez e alterne para o hepatócito cultura suplementado com 20 ng/mL hepática fator de crescimento humano e 20 ng/mL oncostatin M para promover maturação iHep. Altere o meio de todos os outros dias.
      Nota: na presente fase, > 90% das células deve ser positivo para HNF4A, de acordo com citometria de fluxo ou coloração de imunofluorescência.
   7. Dia 15 – 17, as células estão prontas para enxertia. Opcionalmente, o sobrenadante da cultura de pilha pode ser coletado e armazenado a-80 ° C para quantificar a secretado albumina (ALB) por iHeps.
      Nota: na presente fase, > 80% iHeps deve ser positivo para HNF4A, ALB e α1-antitripsina (AAT), de acordo com a mancha da imunofluorescência. Cerca 60 – 70% do dia 17 iHeps deve ser positivo para ASGPR, como mostrado por citometria de fluxo. Em nossas mãos, iHeps neste período tem capacidade ideal para repovoar o fígado de rato; iHeps pode secretam níveis mais elevados de ALB in vitro, mas também tornam-se senescentes se a enxertia é adiada.
2. Dissociação e carregamento de iHeps em uma seringa de insulina
   1. Prepare os reagentes necessários e materiais:
      1. 24 h antes da enxertia, descongele a quantidade necessária (V = 40 µ l * número de ratos) da matriz extracelular em um gelo em uma sala fria da caixa e coloque a seringa de insulina e uma caixa de 200 Dicas µ l em um frigorífico de 4 ° C.
      2. Uma hora antes da enxertia, quente a enzima de dissociação celular suplementado com 50 µ g/mL DNase à temperatura ambiente e coloque o meio RPMI 1640 suplementado com substituição de soro 20% no gelo.
   2. Leve imagens de contraste de fase (100 X e 200x) de iHeps para registrar seus status, incluindo morfologia celular, crescimento e densidade de células.
   3. Lavar iHeps com 2ml/bem de temperatura Ca^{2 +} e Mg^{2 +}-livre PBS duas vezes e em seguida, adicione 1 mL de enzima de dissociação celular suplementado com 50 µ g/mL DNase cada poço. Colocar as células de volta em incubadora para 8 – 10 min.
      Nota: Para melhorar a dissociação celular com enzima de dissociação de célula, lave as células com Ca^{2 +} e Mg^{2 +}-livre de PBS. Para maximizar a viabilidade celular, sugerimos dissociando não mais do que 6 poços por lote de cada vez. Além disso, sugerimos que restringir o tratamento de enzima de dissociação de célula para menos de 10 minutos.
   4. Morfologia da célula monitor sob o microscópio. Quando a maioria das células se tornam redonda, adicionar um volume igual de frio RPMI 1640, suplementado com substituição de 20% de soro para cada poço, pipetar as células suavemente para desanexar da placa e a suspensão de células de transferência para um novo tubo de 15 mL.
      Nota: Este passo é essencial para a viabilidade das células colhidas. Se as células são difíceis de separar da placa, não importa se algumas células estão sobrando. Se as células desanexar como grandes praças de monocamada, depois Pipete suavemente após a centrifugação para obter uma suspensão de célula única.
   5. Repita a etapa 2.2.4 para cada bem até quase todo ligado as células são coletadas. Centrifugar a 200 x g por 3 min a 4 ° C.
   6. Remover o sobrenadante e ressuspender as células com 2 mL de PBS frio em um tubo de 15 mL. Pipetar as células delicadamente para obter uma suspensão de célula única e em seguida, adicione o PBS fria até um volume final de 1 mL * número de poços dissociados. Finalmente, passe as células através de um filtro de célula 40 µm para remover agregados.
      Nota: Normalmente 1-2 x 10⁶ células/poço podem ser colhidas após a filtragem.
   7. Alíquota 20 µ l de suspensão de células e adicionar 20 µ l de solução de azul de Tripan 0,4%, depois contar as células usando um contador de célula automatizada e gravar a concentração da suspensão de células como "C". Calcular o volume necessário (V1 = [10⁶ * (n + 1)] / C, onde n é o número de ratos a ser incorporada) de suspensão de células (1 milhão/mouse) para injeção intrasplenic.
   8. Alíquota o volume necessário de suspensão de células em tubos de 15 mL e centrifugar 200 x g por 3 min a 4 ° C.
   9. Remover o sobrenadante, Ressuspender as células no volume apropriado de PBS frio tornar-se o volume da suspensão de células (n + 1) * 55/2 µ l (n = número de ratos) e em seguida, adicione igual volume de matriz extracelular, tornar-se o volume final da suspensão de células (n + 1) * 55 µ l.
   10. Coloque a seringa de insulina de frio no gelo, desligue o pistão, transferência de 55 µ l de suspensão de células para a seringa e depois colocar o pistão de volta. Bolhas de descarga com cuidado e coloque a seringa no gelo.
   11. Repita 2.3.10 até que todas as seringas tenham sido carregadas com as células. As seringas estão agora prontas para injeção.
       Nota: Para maximizar a viabilidade celular, recomendamos manter as células no gelo depois de dissociação. Para o 2.2.4–2.2.11 de etapas acima, certifique-se de todos os reagentes são mantidos a 2 – 8 ° C antes do uso.

3. intrasplenic injeção de iHeps

1. Anestesia os ratos com cetamina (100 mg/kg) e xilazina (10mg/kg) injectados intraperitonealmente. Coloque o vet pomada nos olhos de ratos para evitar o ressecamento durante o procedimento de anestesia e monitorar seus reflexos musculares para observar o efeito da anestesia e avaliar a dor.
2. Uma vez que os ratos perderam reflexo muscular à estimulação, colocá-los em posição de decúbito lateral direito. Aplica uma camada espessa de creme depilatório para a área de incisão no flanco esquerdo por 5-8 min. Em seguida, retire o creme depilatório e cabelo limpando a área com uma gaze embebida em água.
3. Esfregue o flanco esquerdo com iodo-povidona ou, alternativamente, com etanol a 70% 3 vezes seguido por um final de imersão com iodo-povidona para desinfecção.
4. Em uma armário biossegurança de nível 2, localizar a posição do baço, que pode ser visualizado de forma transparente no flanco esquerdo e então faça uma incisão da pele e a parede abdominal para 0,5-1 cm. Exteriorize o baço puxando o tecido adiposo suavemente perto usando bicudo pinça. Estabilize o baço usando um cotonete suavemente.
5. Insira a agulha da seringa insulina 3 – 4 mm o parênquima do baço e injetar aproximadamente de 50 µ l de suspensão de células suavemente. Retire a agulha e coloque um cotonete de algodão sobre o local da injeção para 1 minuto para prevenir hemorragias e derrame de material.
6. Retornar o baço no peritônio e feche a ferida com suturas de nylon 5-0. Em seguida, manter os ratos em uma câmara quente/incubadora para 3 – 16 h para devolvê-las à sua temperatura normal do corpo e para reanimá-los. Os ratos que foram submetidos a cirurgia não são retornados para a companhia de outros animais até que se recuperou totalmente.
7. Adicionar o meloxicam (26 μg/mL) para a água potável e injetar buprenorfina (50 μg/kg) por via intramuscular como anti-inflamatório e analgésico, respectivamente. Monitor cirúrgico feridas diariamente para evitar qualquer inflamação.
   Nota: Certifique-se de todos os instrumentos e fontes usadas nas etapas 4 a 7 são estéreis.

4. teste de nível de LDL-C plasmático

1. Nos dias 0, 7, 14, 21 e 28 pós enxertia, conter os ratos LRG firmemente para minimizar movimento lateral-lateral da cabeça usando o método de conter com as duas mãos e, em seguida, puncionar a veia facial usando a lanceta. Sangue começará a fluir após a remoção do "the Lancet". Colete cerca de 50 µ l de sangue em tubos de 1,5 mL contendo 1 µ l de EDTA.
   Nota: Se a alça é muito apertada, o volume de sangue coletado pode ser reduzido e os ratos podem morrer por causa da dificuldade em respirar.
2. Misture o sangue suavemente os tubos várias vezes por inversão e então centrifugar 950 x g por 15 min. recolher os sobrenadantes e armazená-los a-80 ° C, imediatamente.
3. Uma vez que todas as amostras são coletadas, descongelar o plasma à temperatura ambiente e testar o nível de LDL-C, usando um kit de deteção de LDL-C de acordo com o manual do fabricante.

5. in Vivo testar da droga em quimérico ratos Engrafted com LDLR + /- e FH iHeps

1. Para induzir a hipercolesterolémia, alimente os ratos uma dieta HFHC 7 dias antes da enxertia.
2. A enxertia pós 7 dias, tratar cada grupo de ratos com veículo (PBS, injetado por via subcutânea), 10 mg/kg/semana PCSK9 anticorpos (uma formulação de grau clínico dos anticorpos monoclonais de PCSK9, injetado por via subcutânea, também), 10 mg/kg/dia de sinvastatina (40 mg/L mg / mL na água potável), ou combinado PCSK9 anticorpos e sinvastatina.
3. Coleta de plasma de rato no pós enxertia dias 0 (o dia da enxertia), 14, 21 e 28. Armazene as amostras a-80 ° C imediatamente.
4. Uma vez que todas as amostras estão disponíveis, teste o nível de plasma LDL usando um kit de deteção de LDL-C, de acordo com o manual do fabricante.

6. teste de função endotelial

Função endotelial é afectada no início de FH e pode ser testada em nosso modelo de rato como um indicador da gravidade da doença ou para avaliar a melhora com tratamentos diferentes. Um stereomicrocope, pinça de dissecação, tesoura, um myograph de fio, hardware de aquisição (ver Tabela de materiais), e um computador são necessários para isso.

1. Sacrifica os ratos por injeção intraperitoneal de fenobarbital 100 mg/kg. Remova os órgãos internos para que a aorta descendente paralela à coluna é visível e pode ser dissecada para fora por tesouras, juntamente com o tecido adjacente e coração. Dissecar o aortae usando uma tesoura fina e colocá-los em solução de Krebs oxigenada fria (mM: 119 NaCl, 4.7 KCl, 2.5 CaCl₂, 1 MgCl₂, 25 NaHCO₃, 1.2 KH₂PO₄e 11 D-glicose).
2. Transferi o aortae em solução de Krebs para um prato de petri do silicone revestido. Alfinete o tecido conjuntivo para fixar a posição de aorta sem esticá-lo. Sob um estereomicroscópio, uso de fórceps bem a Primavera a tesoura e dissecar a aorta livre no tecido gordo e adventícia circundante sem danificar a parede do vaso, depois cortá-la em 1,5 a 2 mm segmentos de comprimento.
3. Cortar um aproximadamente 2 cm longo e 40 μm inoxidável fio grosso e Coloque suavemente através do lúmen da aorta. Transferi o segmento para a câmara de myograph fio preenchida com solução de Krebs oxigenada, segurando o fio.
4. Para medir o comprimento dos segmentos aortae quando estudar a contratilidade, coloque cada segmento perpendicular entre as mandíbulas e registro da leitura (D₁) sobre o micrômetro. Remover o segmento e mover as mandíbulas juntos e gravar a leitura (D.₀). O comprimento do segmento seria L = D₁-D₀.
5. Siga o guia de usuário para fixar o fio e fixe-a com a chave de fenda enquanto colocando o segmento entre as mandíbulas, mas deixá-lo unstretched.
6. Para Normalização antes do experimento, defina o myograph a zero na posição unstretched. Então, lentamente mova a mandíbula separada e observar a tensão de aorta mudar até atingir 3 mN. Depois de 15 minutos, escorra a solução da câmara de myograph e substituir com solução de Krebs fresca, esperar 15 min e ajustar a tensão a 3 mN novamente.
7. Altere a solução de Krebs padrão para 60 mM solução de Krebs contendo KCl para induzir uma contração durante pelo menos 15 min. Enxágue com solução de Krebs fresca 3 vezes.
8. Adicionar o aumento das concentrações de fenilefrina (Phe; por exemplo, de 10 nM a 100 μM). Lavar com solução de Krebs padrão e adicionar uma única concentração de Phe em ~ 70% da contração máxima da contração anterior. Quando a contração é estável, adicionar o aumento das concentrações de acetilcolina (ACh; por exemplo, de 1 ou 3 nM a 10 ou 30 µM) para induzir vasodilatação. ACh é adicionado em cerca de 2 min de intervalo.
   Nota: Em alguns segmentos da aorta com pequena contração induzida por Phe, por exemplo, menor que 30% de KCl induzida por contração, U46619 (outro vasoconstritor) numa concentração de 1 nanômetro a 30 nM pode ser usado para induzir uma contração estável que é maior que 70% dos Contração induzida por kCl.
9. Limpe o myograph de acordo com o manual do fabricante.
10. Usando o software de análise de dados (ver Tabela de materiais), registro a força (F) após cada adição de drogas. Desenhar o marcador para tensão basal (F_basal) para medição relativa, mover a seta para o ponto mais alto após Phe como F_Phee mova para o ponto mais baixo após cada adição de ACh como F_ACh. Calcular a vasodilatação endotélio-dependente induzida por ACh (EDV) pelo relaxamento % = (F_ACh-F_basal) / (F_Phe-F_basal) no eixo y. Prepare uma curva de resposta de concentração em software estatístico usando log10 valor da concentração de M no eixo x.
11. Para analisar a diferença estatística, usar a área sob a curva de cada segmento de um mouse e analisar a diferença da área sob a curva entre grupos usando ANOVA One-Way. Pontos individuais também podem ser analisados, se necessário.

7. a prova de iHep repovoamento do fígado de rato

1. No ponto de extremidade, sacrifica os ratos injetando intraperitonealmente fenobarbital 100 mg/kg.
2. Coleta de plasma por punção cardíaca. Dissecar os lóbulos do fígado usando tesouras oftálmicas, em seguida, pôr fígados um peri-tigela de 10 cm e duas lavagens com soro fisiológico. Remova a solução salina da superfície hepática com papel absorvente e, em seguida, cortar os lóbulos ao redor de 0,6 cm-comprimento de peças. Corrigi os lóbulos do fígado em formol a 10%.
3. Incorpore os fígados fixos na seção usando um tecido processamento o sistema e um micrótomo deslizante, respectivamente, de acordo com as instruções do fabricante e parafina.
4. Aqueça os slides para 60 ° C durante 1 h derreter a cera. Em seguida, mergulhe os slides em xilol por 5 min, duas vezes e Re-hidratar o tecido com etanol 100%, 90% e 70% sucessivamente.
5. Mergulhe os slides para o slide-câmara contendo cerca de 50 mL de solução de recuperação de antígeno e em seguida, colocar a câmara na panela de pressão, a 120 ° C por 1,5 min. Lave o desliza suavemente com a tubulação de água por 5 minutos.
6. Manche as seções com anticorpos primários (cerca de 100 µ l/seção) direcionamento humano ALB (hALB) e antígeno núcleos humanos (hNA). Em seguida, mancha com anticorpos secundarios conjugados com uma etiqueta fluorescente ou peroxidase de rábano (que reage com o kit de deteção de DAB).
7. Para calcular a porcentagem de hALB + áreas e células hNA +, digitalizar as lâminas coradas com anti-hALB e anti-hNA e reagiu com DAB usando um slide automatizado sistema de digitalização para obter imagens de toda seção.
   Nota: Toda a imagens digitalizadas de seção são úteis para calcular a eficiência repovoada de forma imparcial, com base em áreas hALB + ou células hNA + em fígados manchadas de imuno-histoquímica. Como um método alternativo para monitorar a eficiência de repovoamento iHep, nível de albumina humana do plasma pode ser testado usando um kit de ELISA ALB humano específico.
8. Com imagens de instantâneo para cobrir o slide inteiro usando o slide digital associado software sob 5 Vista X de visualização. Para quantificar a porcentagem de hALB + áreas, para cada imagem de instantâneo, usam o software de imagem de microscópio para qualificar a área positiva (P) e a área total (T) da imagem e usam o Image J para qualificar a área em branco (B). A porcentagem de hALB + áreas é expresso como P/(T-B) * 100%. Para cada grupo de, pelo menos 3 ratos devem ser selecionados. E para cada mouse, pelo menos 4 seções de diferentes posições do fígado devem ser seleccionadas.
9. Para quantificar a porcentagem de hNA + células, para cada imagem de instantâneo, selecionar aleatoriamente 1/16 da área com uma software de processamento de imagem e então manualmente contam o número de núcleos totais (T) e hNA + núcleos (N). A porcentagem de hNA + é expressa em N/T * 100%. Para cada grupo de, pelo menos 3 ratos devem ser selecionados. Para cada rato, pelo menos 4 seções de diferentes posições do fígado devem ser selecionadas.

Resultados

Dirigido a diferenciação de humano iPSCs em iHeps
Quando chegar a confluência de 70%, iPSCs humanos são diferenciadas em iHeps com um passo 3-Protocolo n º¹⁶ (painel superior daFigura 1 ). Após 3 dias de diferenciação de endoderme, colônias de iPSC tornam-se afrouxado e espalhar a confluência completa (painel inferior daFigura 1 ). Em seguida, com 2^nd médio de palco, hepatobl...

Discussão

Estudos anteriores usando iHeps em roedores confirmaram que eles são uma maneira eficaz de estudar doenças hepáticas hereditárias¹⁷. Ainda mais expandir o uso dessa tecnologia e modelos animais de FH atuais são suboptimal, nós engrafted FH iHeps em camundongos LRG e mostrou que o engrafted LDLR + /- ou heterozigota LDLR-mutante FH iHeps pode reduzir o nível de LDL-C de plasma de ratos e responder aos hipolipemiantes drogas na vivo.

Existem 3 e...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Materiais
40 µ Filtro de células m	BD	B4-VW-352340
Placa de 6 poços	Thermofisher	140675	Revestido com matriz extracelular
Accutase	Millipore	SCR005
Acetilcolina	Sigma Aldrich	A6625	Dissolver em água
Solução de recuperação de antígeno	IHC World	IW-1100-1L
Cloreto de cálcio	Sigma Aldrich	C8106	CaCl2
Enzima de dissociação celular	Thermofisher	12604-013	TrypLE
D-glicose	Sigma Aldrich	D8270
Dimetilsulfóxido Sigma	Aldrich	D5879	DMSO
DMEM	Thermofisher	10829	Nocaute DMEM
DNase I	Roche	11284932001
EDTA	USB	15694	0,5 M, PH=8,0
Matriz extracelular (para suspensão celular)	Corning	354234	Matriz extracelular
Matrigel (para diferenciação iHep)	Corning	354230	hepatócito
	Matrigel Lonza	CC-3199
Meio de cultura de hepatócitos	Lonza	CC-3198
Dieta rica em gordura e colesterol	Dieta de pesquisa	D12079B
Ativina humana A	Peprotech	120-14E
Fator de crescimento de hepatócitos humanos	Peprotech	100-39
Meio de manutenção iPSC humano	STEMCELL Technologies	5850	mTeSR1
Oncostatina humana M	Peprotech	300-10
Cetamina 10%	Alfasan	N/A
L-glutamina Kit	Thermofisher	35050
	WAKO	993-00404 e 993-00504
Magnésio  cloreto	VWR	P25108	MgCl2
Meloxicam	Boehringer Ingelheim	NADA 141-213
Fosfato monopotássico	USB	S20227	KH2PO4
Aminoácidos não essenciais	Thermofisher	11140
PBS	GE	SH30256.02	Sem cálcio e magnésio
Anticorpos PCSK9	Sanofi e Regeneron Pharmaceuticals	SAR236553/REGN727	Alirocumab
Fenobarbital	Alfamedic company	013003
Fenilefrina	RBI	P-133	Dissolver em água
Cloreto de potássio	Sigma Aldrich	P9333	KCl
Iodopovidona	Mundipharma	Betadine
Mouse recombinante Wnt3a	R& D Systems	1324-WN-500 / CF
inibidor de ROCK Y27632	Sigma Aldrich	Y0503-5MG
RPMI 1640	Thermofisher	21875
Substituição de soro	Thermofisher	10828
Placa de Petri revestida de silicone	Dow Corning	Sylgard 184 kit
Sinvastatina	Merck Sharp & Dohme	ZOCOR
Bicarbonato de sódio	Sigma Aldrich	S6297	NaHCO3
Cloreto de sódio	Sigma Aldrich	S7653	NaCl
Solução azul de tripano 0,4%	Thermofisher	15250061
U-46619	Cayman	16450	Dissolver em DMSO
Xilazina 2%	Alfasan	N / A
β -mercaptoetanol	Thermofisher	31350
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anticorpos
AAT	DAKO	A0012	1:400
ALB	Bethyl Laboratories	A80-129	1:200
ASGPR	Santa Cruz	Sc-28977	1:100
HNF4A	Santa Cruz	Sc-6557	1:35
NANOG	Stemgent	09-0020	1:200
OCT4	Stemgent	09-0023	1:200
Nome	Empresa	Catálogo Número	Comentários
Mice
Il2rg-/-	Jacson lab	003174
Ldlr-/-	Jacson lab	002077
Rag2-/-	Jacson lab	008449
Nome	Empresa<	strong>Número de catálogo	Comentários
Equipamentos
Contador de células automatizado	Invitrogen	Countess
Gamma irradiador	MDS Nordion	Seringa de insulina Gammacell 3000 Elan II
	BD	324911
Powerlab	ADInstruments	Modelo 8/30
Sistema de digitalização de lâminas	Leica biosystems	Sistema Aperio scanScope Micrótomo
deslizante	Leica biosystems	RM2125RT
Stereomicrocope	Nikon	SMZ800
Sistema de processamento de tecidos	Leica biosystems	ASP200S
Wire myograph	DMT	610M
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Softwares
Visualização digital de slides software	Leica	Aperio ImageScope Versão 12.3.2
Imagem J	NIH	Versão 1.51e
Software de processamento de imagem	Adobe	Photoshop CC Versão 2015
Software de imagem de microscópio	Carl Zeiss	AxioVision LE Versão 4.7