Isolamento de gânglios das raízes dorsais e cultura primária para estudar a liberação de neurotransmissores

Os corpos celulares dos neurônios sensoriais estão contidos DRG. Estes neurônios são pseudo unipolares e inervam tanto tecidos periféricos e sistema nervoso central. As terminações de nervos periféricos de neurônios sensoriais encontram-se em músculo, pele, órgãos viscerais e osso, entre outros tecidos. Eles transmitem sinais periféricos sensação nervo terminações no Corno dorsal da coluna vertebral e os sinais são então transmitidas para o cérebro através de diferentes percursos ascendentes da sensação somática^1,2. Sensação somática permite o corpo a sentir (ou seja, toque, dor e sensações térmicas) e perceber o movimento e orientação espacial (sensações proprioceptivas)^1,3. Existem quatro subclasses de axônios aferentes primários, incluindo grupo I fibras (Aα) que respondem a propriocepção dos músculos esqueléticos, fibras de grupo II (Aβ) que respondem a mecanorreceptores da pele, e grupo III (Aδ) e fibras de V (C) do grupo que respondem à dor e temperatura. Somente as fibras C são amielínicas, enquanto o resto são mielinizadas de diferentes graus.

Os nociceptores são neurônios sensoriais primários, que são ativados por estímulos nocivos (estimulação mecânica, térmica e química) que carregam o potencial de dano tecidual. Estes neurônios são compostos de fibras mielinizadas de Aδ e amielínicas C fibras^1,4. As fibras Aδ expressam os receptores para fator de crescimento do nervo (NGF, trkA receptor), CGRP e SP. As fibras C são classificadas como peptidérgicos ou não-peptidérgicos fibras C. Por outro lado, fibras C não-peptidérgicos expressam os receptores para fator neurotrófico derivado de glia (GDNF, RET e GFR receptores), isolectin IB4 e iônicos ATP canal subtipo (P2X3)^5,6,7. Os nociceptores podem ser distinguidos pela expressão de canais iônicos e ativados por fatores neurotróficos, citocinas, neuropeptídeos, ATP ou outros químicos, compostos de⁸. Estimulação, neurotransmissores, incluindo CGRP, SP e glutamato podem ser liberados da terminais do neurônio sensorial no Corno dorsal da coluna vertebral para transmitir sinais nociceptivos². DRG não são apenas composto de neurônios, mas também contêm células gliais do satélite. Células satélites envolvem os neurônios sensoriais e fornecer apoio mecânico e metabólica^9,10. Curiosamente, há um crescente corpo de evidências que indicam que células gliais satélite em DRG podem estar envolvidas na regulação da dor sensação¹¹.

Neurônios sensoriais foram relatados para ser o mais frequentemente usado células neuronais primários¹² e têm sido utilizado para estudos de liberação do neurotransmissor, transdução de sinal e Eletrofisiologia. Eles também são comumente usados para explorar os mecanismos celulares de desenvolvimento neuronal dor inflamatória, dor neuropática, sensação de pele (como coceira) e axônio consequência^12,13,14,15. Culturas primárias de DRG podem ser cultivadas como neurônios dissociados para avaliar as alterações bioquímicas em uma ou várias células, permitindo que os cientistas realizar estudos que não podem ser executados em disciplinas experimentais. Recentemente, o DRG foram cultivadas com sucesso de doadores de órgãos humanos que podem beneficiar muito a pesquisa translacional¹⁶. Por outro lado, os neurônios sensoriais também podem ser cultivados como DRG explants. Os explantes DRG preservar a arquitetura original do tecido dos neurônios, incluindo células de Schwann e células gliais do satélite e são especialmente úteis para estudar as interações entre as células neuronais e não-neuronal¹⁷. Culturas primárias de DRG podem ser facilmente preparadas dentro de 2,5 h. A composição celular e propriedades são altamente reflexivas da fonte DRG, e como tal, DRG específico (DRG lombar ou torácica) pode ser recolhido de acordo com demandas experimentais. Culturas de neurônios DRG embrionários e Neonatais requerem NGF sobreviver e induzir a consequência natural do axônio, mas culturas de neurônios adultos não necessitam da adição de fatores neurotróficos para a mídia^12,17. Existem também linhas de células de hibridoma-DRG comercialmente disponíveis como ND7/23 e F11, que não exigem o uso de animais experimentais. No entanto, a falta de cátion potencial transiente do receptor canal membro da subfamília V 1 (TRPV1) expressão (um importante marcador para pequenos neurônios nociceptivos sensoriais) e perfis de expressão de gene incongruentes limitam seus aplicativos¹⁸. Recentemente, imortalizada célula neuronal DRG linhas foram derivadas de rato (50B11)¹⁹ e rato (MED17.11)²⁰, que são apropriados para usam em telas de alta produtividade para drogas como alvo de estudos. No entanto, a expressão gênica profiling para estas linhas de célula ainda tem de ser realizada. Assim, os experimentos de validação comparando estas células imortalizadas de neurônios sensoriais ainda estão em andamento.

NPFFR2 é sintetizado em DRG e translocados para os terminais de nervo sensorial no Corno dorsal da coluna vertebral²¹. Neste artigo, nós fornecemos um protocolo para cultivo de células DRG lombares e tratá-los com um agonista de NPFFR2 para induzir a liberação de neurotransmissores, CGRP e a SP. A dependência de NPFFR2 mais é testada usando NPFFR2 pequena interferência do RNA (siRNA), que pode transfected em culturas de células de DRG.

Todos os métodos descritos neste documento que usam animais experimentais foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e usar Comité (IACUC) de Chang Gung University (CGU 13-014).

1. colete lombar DRG de ratos experimentais

1. Use 2 a 3 ratos Sprague-Dawley (SD) de semanas para coleção de DRG lombar.
   Nota: Os neurônios DRG coletados de ratos durante 4 semanas de idade não crescem bem sob as condições de cultura aqui descritas.
2. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos em uma autoclave.
3. Anestesiar o rato com uma mistura 1:1 de tiletamina e eficiente (20 mg/kg; injeção intraperitoneal (IP)) e aguarde até que o animal não mostra nenhuma resposta retirada do pé em um teste do beliscão-dedo do pé.
   Nota: Estratégias diferentes de anestesia podem ser usadas com sucesso no presente protocolo.
4. Sacrifica o rato por decapitação com uma guilhotina comercial.
5. Use a guilhotina para isolar o tronco do corpo do rato entre o membro anterior e fêmur. Ver figura 1A para um diagrama da região para ser coletado.
   Nota: A linha de corte de caudal deve ser apenas rostral do fêmur. A lombar L6 DRG vai ser extirpado se o local de corte é muito alto na coluna vertebral.
6. Cortar ao longo do esterno e remover todos os órgãos/tecidos com a tesoura de dissecação (Fig. 2A-um).
7. Corte ao longo do lado do tronco para coletar a parte dorsal do rato e remover a pele. Ver figura 1B para uma fotografia do tronco dorsal dissecada.
8. Prepare o tecido no gelo antes de coletar DRG. Limpar a pele e o sangue de luvas e esterilizá-los com 75% de etanol antes de prosseguir para a próxima etapa.
9. Remova os músculos cobrindo a coluna lombar. Primeiro, faça dois cortes nas laterais da coluna vertebral (esquerda e direita) e um corte lateral para marcar a extensão rostral da coluna lombar. Em seguida, remova os músculos dorsais da coluna vertebral com pinças de corte do osso (Fig. 2A-b).
10. Remover a porção dorsal das vértebras com pinças de corte do osso e expor a medula espinhal.
11. Remova a medula espinhal com tesoura de dissecação (Fig. 2A-c) e a pinça (Fig. 2A-d).
12. Identifica o DRG lombar pela contagem de vértebras da última costela (13 de vértebra torácica). Ver Figura 1 para obter um diagrama das posições de vértebras.
13. Recolha o DRG lombar bilateral (L1-L6) com microtesoura (Fig. 2A-f) num prato com 2 mL gelada soro livre de meio de cultura 35mm. Retire as fibras neuronais (conforme indicado na Figura 1) conectando DRG e, em seguida, transferi-lo para o prato de cultura para melhorar a pureza das culturas.
    Nota: O DRG coletado pode ser mantido no meio no gelo por cerca de 1h. Enquanto isso, vários ratos podem ser sacrificados para criar um pool maior de DRG.

2. principal cultura de rato madeira DRG

Nota: As seguintes etapas devem ser executadas numa vizinhança de fluxo laminar.

1. Preparar o meio de cultura contendo 10% de soro fetal bovino, piruvato de sódio de 100 mM e 1 x penicilina/estreptomicina em 1 x DMEM + F12.
2. Brasão da célula-cultura tratada 24-placa com 200 µ g/mL poli-L-lisina para 2 h, em seguida, lave com água esterilizada.
3. Pre-incube o prato de cultura com 1 mL de meio de cultura numa incubadora 37 ° C CO₂ antes de usar pelo menos 30 min.
4. Transferir o prato DRG-contendo de 35 mm em uma capa laminar e lavar o DRG com meio livre de soro 3 vezes com uma pipeta.
   Nota: Fora do prato deve ser limpos com 75% de etanol, antes de se transferir ao subúrbio. O prato de 35mm pode conter DRG de um número de ratos (isso vai depender as demandas do projeto experimental).
5. Mover o DRG (de um único rato ou combinado de vários ratos) para uma nova placa de cultura de 35 milímetros, que contém 2 mL do tipo colagenase IA (1 mg/mL em meio livre de soro) com uma pinça estéril (Fig. 2A-e).
   Nota: A solução de colagenase deve ser esterilizada por passagem através de um filtro de seringa 0,22 µm.
6. Digeri o DRG na solução de colagenase em uma incubadora de 37 ° C CO₂ por 30 min.
7. Remover a solução de colagenase e lavar o DRG 3 vezes em 2 mL de Hank equilibrada solução salina (HBSS).
   Nota: Pode haver fibras residuais ou tecidos que saem da DRG na solução. Removê-los com uma pipeta com a solução de lavagem.
8. Adicione 2 mL pré aquecido 0.05% do trypsin-EDTA em DRG-contendo 35 mm prato e digerir o DRG numa incubadora 37 ° C CO₂ por 30 min.
9. A 2 mL de solução contendo DRG de transferência para um tubo de centrífuga de 15 mL com uma pipeta de vidro.
   Nota: O DRG pode grudar a pipeta de vidro para que esta etapa deve ser executada com cuidado. Perda DRG pode ser evitada mantendo a solução contendo DRG no final afilado de uma pipeta de vidro (cerca de 0,5 mL) e transferir a solução no tubo de centrífuga lentamente mas sem pausa.
10. Centrifugue a solução a 290 x g por 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e adicionar outro meio livre de soro 2 mL para Ressuspender o DRG.
11. Repita a etapa 2.10 2 vezes mas mudança o meio livre de soro ao meio de cultura previamente aquecido na última vez.
12. Manualmente, Triture DRG aproximadamente 60 vezes usando uma pipeta Pasteur polido chama (comprimento 230 mm e ponta cabeça diâmetro interno 1 mm). Ver Figura 2B para uma foto comparando o orifício de uma pipeta Pasteur polido chama para uma pipeta não polido.
    Nota: O interior diâmetro da pipeta Pasteur flama-lustrado é aproximadamente 10% menor do que a pipeta de controle e o interior da extremidade afilada deve ser mais suave. Tenha cuidado para não criar bolhas quando moer as células.
13. Retire o prato de poli-L-lisina-revestido a incubadora de CO₂ . Aspire o meio de cultura incubado do prato e as células dissociadas no prato revestido de sementes.
14. Propagar as células DRG de um rato (coleção bilateral de L1-L6, para 12 DRG total) em quatro poços de uma placa de 24; Existem aproximadamente 5 x 10⁴ células em um poço de uma placa de 24.
    Nota: Esta densidade é adequado para a detecção do CGRP lançado ou SP e também apropriado para immunostaining. Por Western blot ou extração de RNA, propagar as células DRG de um rato (bilateral L1-L6) em um poço de uma placa de 6.
15. Substituir o meio de cultura, no dia seguinte com a adição de 10 µM Citarabina (Ara-C) e 100 ng/mL NGF e refrescar o meio em dois dias depois.
    Nota: O DRG torácica também pode também ser cultivada pelo presente protocolo, se eles foram recolhidos em coluna torácica.

3. a transfeccao de siRNA NPFFR2 em células de DRG

1. Executar o transfeccao de siRNA NPFFR2 e controle siRNA de acordo com o protocolo do fabricante.
   Nota: O protocolo terá de ser adaptado, se o reagente de transfeccao escolhido é diferente da que usamos (consulte a Tabela de materiais).
2. No dia 3 depois de chapeamento de célula, mudar o médio a médio 0,5 mL de soro-free pre-aquecido e incubar a DRG numa incubadora 37 ° C CO₂ por 1h.
3. Adicionar 50 nM de siRNA (em 1 água livre de RNase µ l) em 12,5 µ l soro livre médio.
4. Adicione o reagente de transfeccao 2,5 µ l entram meio livre de soro, 10 µ l.
5. Misture a solução de solução de passos 3.3 e 3.4 por pipeta e incubar este misto de Transfeccao para 10 min à temperatura ambiente.
6. Adicionar a solução de transfecção em um DRG contendo 24-placa e misturar a solução com o meio por agitação suave.
   Nota: Várias soluções de transfeccao devem ser implantadas ao mesmo tempo se precisam de vários poços para transfected.
7. Incube a DRG numa incubadora 37 ° C CO₂ para 6 h.
8. Adicionar 0,5 mL/bem do meio de cultura contendo 20% de soro fetal bovino, piruvato de sódio de 100 mM e 1 x penicilina/estreptomicina em 1 x DMEM-F12, com a adição de 10 µM Ara-C e 100 ng/mL NGF, para a placa de 24.
9. Incube a DRG numa incubadora 37 ° C CO₂ para outro 66 h (atualizar o meio a 48 h).

4. a liberação de neurotransmissores de células primárias DRG

1. No dia 6 depois que as células eram chapeadas (72 h após a transfeccao siRNA), alterar o meio de cultura para meio de soro livre 200 µ l e incube as celulas em uma incubadora de 37 ° C CO₂ por 30 min.
2. Adicionar 1 µ l estimulação constituídas e misture suavemente a mídia por pipetagem. Incube o prato numa incubadora 37 ° C CO₂ para a hora marcada.
   Nota: Neste artigo, as células cultivadas foram estimuladas com o agonista NPFFR2, dNPA (D.Asn-Pro-(N-Me)Ala-Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-Phe-NH₂, 5 nmol), por 1h.
3. Colete o meio de cultura de cultura prato e centrifugar a 5.000 x g por 5 min a 4 ° C para remover quaisquer impurezas suspensas.
4. Recolher o sobrenadante da centrifugação e diluir as amostras com tampão fosfato salino (PBS), conforme necessário. Ensaio dos níveis de neurotransmissores com kits de enzima imunoensaio (EIA).
   Nota: Aqui, os sobrenadantes foram diluídas 1: 100 antes de analisar o nível de CGRP. O sobrenadante não foi diluído antes de analisar o nível de SP.

5. CGRP e EIA SP

1. Analise as amostras imediatamente de acordo com o protocolo CGRP ou SP EIA kit do fabricante.
   Nota: O protocolo pode variar dependendo do kit usado.
2. Lave os poços de CGRP EIA 5 vezes com tampão de lavagem fornecido dentro do kit.
3. Adicionar 100 amostras µ l com 100 tracer de acetilcolinesterase (dor) de anti-CGRP µ l para os CGRP EIA poços e adicionar 50 amostras µ l, 50 µ l anti-SP dor tracer e, anti-soro de anti-SP 50 µ l para os EIA SP poços.
4. Sele os CGRP e a SP poços com película plástica que é fornecido dentro os kits.
5. Incubar os poços durante a noite a 4 ° C.
6. Lavar os poços 5 vezes com CGRP ou lavar SP reserva e retire toda a solução residual dos poços.
7. Adicione o reagente de Ellman 200 µ l nos poços CGRP ou SP que é fornecido dentro os kits EIA correspondentes.
8. Incubar os poços CGRP durante 30 min à temperatura ambiente e incubar os poços de SP para 90 min à temperatura ambiente. Protege os poços de luz para ambos os ensaios.
9. Ler as placas no comprimento de onda 414 nm e calcular os resultados de acordo com o correspondente instrumento EIA.
   Nota: Evite tocar no fundo dos poços com a mão o tempo todo e limpar as manchas de água do fundo bem por limpezas antes de adicionar o reagente de Ellman de limpeza de lentes.

Neurônios DRG lombares rato, cultivados em uma placa de 24, foram cultivados em meio de cultura com Ara-C adicional para inibir a proliferação das células gliais e NGF para apoiar o crescimento neuronal. A morfologia de vida observou-se células DRG. Como mostrado na Figura 3, o corpo celular de um único neurônio foi anexado no fundo de um prato no dia 1 e selecionado para observação. Crescimento do axônio foi monitorado desde dia 1 – 3. As células gliais duplicada e estendido processos para cercar o corpo celular do neurônio sensorial. Em outra cultura, proteína CGRP foi manchada para revelar a forma de neurônios. Na Figura 4, CGRP proteína coloração aparece no citoplasma e axônios de neurônios sensoriais. As morfologias nucleares de neurônios e células gliais são distintas quando corados com DAPI. Os neurônios têm um núcleo maior e mais arredondado do que as células gliais. Em comparação, os núcleos de glia são mais oval em forma (Figura 4B).

O agonista seletivo NPFFR2, dNPA, foi usado para estimular a liberação de CGRP e a SP. Além disso, a dependência da liberação do neurotransmissor dNPA-estimulada na NPFFR2 foi testada por células transfecting com NPFFR2 siRNA. NPFFR2 siRNA ou controle siRNA foram transfectadas nas células do DRG 72 h antes do tratamento de agonista primárias. Células DRG foram tratadas com dNPA (5 nmol) por 1h e a liberação de CGRP e a SP foi medida por kits de EIA separados. A simulação de DRG com dNPA aumentou o nível de CGRP e a SP na mídia (Figura 5A, B). No entanto, apenas a liberação CGRP induzida por dNPA foi inibida pela expressão de siRNA NPFFR2 em culturas de células de DRG. Os resultados mostrados na Figura 5 , foram modificados de uma publicação anterior e são usados aqui com permissão22.

Figura 1: diagramas de processamento do tecido. DRG lombar são coletadas de 3 semanas de ratos. (A) as posições onde a guilhotina deveria ser usada para cortar o animal são indicadas por linhas pontilhadas. (B) o tronco dorsal com pele removido e (C) os locais de DRG lombar (a partir de L1-L6) são mostrados. A inserção representa o DRG e as fibras de conexão (que são indicadas pelas setas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: equipamento especial necessário para isolar culturas primárias de DRG. (A) instrumentos cirúrgicos usados na coleção de DRG. Da esquerda para a direita: ponto de (uma) tesoura de dissecação (grande), (b) osso corte pinça, tesoura de dissecação (c) (pequena), (d, e) (f) microtesoura e pinça. (B) uma pipeta de Pasteur regular e uma pipeta Pasteur flama-lustrado. "a" denota o interior diâmetro de regular pipeta Pasteur e "b" denota o interior diâmetro da pipeta Pasteur flama-lustrado. b / a ≒ 0,9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: A morfologia da vida células DRG. Células vivas de DRG foram monitoradas por microscopia. As células são mostradas (A) um dia após a semeadura, (B) dois dias após a semeadura e (C) três dias após a semeadura. As setas indicam o neurônio e setas indicam glia. Barra de escala = 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: imunocoloração de pilhas cultivadas DRG. DRG células foram immunostained com anticorpo anti-CGRP para mostrar os neurônios e 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para os núcleos dos neurônios e células gliais. (A), CGRP proteína foi expressa em corpos celulares neuronais sensoriais e fibras de axônio. (B) núcleos de neurônios e glia estavam manchados com DAPI. (C) mesclada imagine da e B. a seta indica um neurônio e a seta indica uma célula glial. Barra de escala = 30 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: A liberação de neurotransmissores de culturas de células de DRG. O agonista seletivo NPFFR2, dNPA, foi usado para estimular a liberação de CGRP e a SP de culturas DRG. A dependência da liberação do neurotransmissor na NPFFR2 foi verificada por células transfecting com NPFFR2 siRNA. (A e B) células após DRG foram transfectadas com siRNA NPFFR2 ou não-direcionamento controle siRNA (72 h), dNPA (5 nmol) foi aplicado por 1h induzir a liberação de CGRP e a SP. dados são expressos como média ± erro padrão da média (SEM) e foram analisados por t Wo-forma de análise de variância (ANOVA) com Bonferroni post hoc testes. p < 0,01, * * *p < 0,001; comparados aos controles de veículo correspondente (N = 12 por grupo). Os painéis A e B foram modificados de Lin et al . 22 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada para divulgar.