Culturas primárias do (DRG) os gânglios das raízes dorsais são frequentemente usadas para estudar as funções fisiológicas ou eventos relacionados à patologia em neurônios sensoriais. Aqui, vamos mostrar o uso de culturas DRG lombares para detectar a liberação de neurotransmissores, depois neuropeptídio FF receptor tipo 2 estimulação com um agonista seletivo.
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Artigo de método
Isolamento de gânglios das raízes dorsais e cultura primária para estudar a liberação de neurotransmissores
Neste artigo
Resumo
Resumo
Gânglios da raiz dorsal (DRG) contêm os corpos celulares dos neurônios sensoriais. Este tipo de neurônio é pseudo unipolar, com dois axônios que inervam tecidos periféricos, tais como pele, músculos e órgãos viscerais, bem como o corno dorsal da coluna vertebral do sistema nervoso central. Neurônios sensoriais transmitem sensação somática, incluindo dor, toque, sensações térmicas e proprioceptivas. Portanto, culturas primárias de DRG são amplamente utilizadas para estudar os mecanismos celulares de nocicepção, funções fisiológicas de neurônios sensoriais e desenvolvimento neural. Os neurônios cultivados podem ser aplicados em estudos envolvendo a eletrofisiologia, transdução de sinal, liberação de neurotransmissores ou imagem de cálcio. Com culturas primárias de DRG, os cientistas podem cultura dissociada DRG neurônios para monitorar as alterações bioquímicas no single ou várias células, superando muitas das limitações associadas com experiências na vivo . Em comparação com comercialmente disponíveis linhas de células de hibridoma-DRG ou imortalizado DRG célula neuronal linhas, da composição e propriedades das células primárias são muito mais semelhantes a neurônios sensoriais no tecido. No entanto, devido ao número limitado de culturas de células primárias DRG que pode ser isolado de um único animal, é difícil de executar telas de alto rendimento para drogas como alvo de estudos. No artigo atual, são descritos os procedimentos para a recolha de DRG e cultura. Além disso, vamos demonstrar o tratamento de pilhas cultivadas DRG com um agonista do neuropeptídio FF do receptor tipo 2 (NPFFR2) para induzir a liberação de neurotransmissores de peptídeo ((CRGP) peptídeo relacionados ao gene da calcitonina e substância P (SP)).
Introdução
Os corpos celulares dos neurônios sensoriais estão contidos DRG. Estes neurônios são pseudo unipolares e inervam tanto tecidos periféricos e sistema nervoso central. As terminações de nervos periféricos de neurônios sensoriais encontram-se em músculo, pele, órgãos viscerais e osso, entre outros tecidos. Eles transmitem sinais periféricos sensação nervo terminações no Corno dorsal da coluna vertebral e os sinais são então transmitidas para o cérebro através de diferentes percursos ascendentes da sensação somática1,2. Sensação somática permite o corpo a sentir (ou seja, toque, dor e sensações t....
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Protocolo
Todos os métodos descritos neste documento que usam animais experimentais foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e usar Comité (IACUC) de Chang Gung University (CGU 13-014).
1. colete lombar DRG de ratos experimentais
- Use 2 a 3 ratos Sprague-Dawley (SD) de semanas para coleção de DRG lombar.
Nota: Os neurônios DRG coletados de ratos durante 4 semanas de idade não crescem bem sob as condições de cultura aqui descritas. - Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos em uma autoclave.
- Anestesiar o rato com uma mistura 1:1 de tiletamina e eficiente (20 mg/kg; injeção intraperitoneal (IP)) e aguarde at....
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Resultados
Neurônios DRG lombares rato, cultivados em uma placa de 24, foram cultivados em meio de cultura com Ara-C adicional para inibir a proliferação das células gliais e NGF para apoiar o crescimento neuronal. A morfologia de vida observou-se células DRG. Como mostrado na Figura 3, o corpo celular de um único neurônio foi anexado no fundo de um prato no dia 1 e selecionado para observação. Crescimento do axônio foi monitorado desde dia 1 – 3. As células gliais dupl.......
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Discussão
No presente artigo, demonstramos a coleção, enzima-dissociação e cultura de lombar rato DRG. Com o apoio de neurotrophic de NGF, os axônios dos neurônios DRG estendido dentro de 3 dias após a semeadura da célula. Os axônios estendidos foram claramente observáveis após células foram coradas para proteína CGRP, o qual é sintetizada no soma de célula e transportada ao longo das fibras de axônio. Os processos de células satélites também estendidos, permitindo que estas células gliais divisórias cercar os neurônios dentro de .......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos o Dr. M. Calkins para edição inglesa. Este trabalho foi apoiado pelo Chang Gung Memorial Hospital (CMRPD1F0482), Chang Gung University, centro de pesquisa de envelhecimento saudável (EMRPD1G0171) e Ministério da ciência e tecnologia (105-2320-B-182-012-MY2).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Mistura de tiletamina e zolazepam (Zoletil) | Virbac | Zoletil 50 | anestésico |
| Soro bovino fetal | Biological Industries | 04-001-1 | Meio de cultura |
| piruvato de sódio | Sigma | S8636 | Meio de cultura |
| penicilina/estreptomicina | Biological Industries | 03-033-1 | Meio de cultura |
| DMEM-F12 | Invitrogen | 12400024 | Meio de Cultura |
| Poli-l-lisina | Sigma | P9011 | Placa de revestimento |
| Colagenase IA | Sigma | 9001-12-1 | Digestão enzimática |
| Solução salina balanceada de Hank | Invitrogen | 14170-112 | Meio de cultura |
| Tripsina EDTA | Biological Industries | 03-051-5 | Digestão enzimática |
| Pasteur pipeta | Hilgenberg | 3150102 | Trituração de células |
| Citarabina (Ara-C) | Sigma | C6645 | Meio de cultura |
| NGF | Millipore | NC011 | Meio de cultura |
| NPFFR2 siRNA | Dharmacon | L-099691-02-0005 | Transfecção |
| SiRNA não direcionado | Dharmacon | L-001810-10-05 | Transfecção |
| NeuroPORTER Reagente | Genlantis | T400150 | Reagente de transfecção |
| dNPA | Genemed Synthesis | N/A | NPFFR2 agonista |
| CGRP ELISA | Cayman | 589001 | EIA |
| SP ELISA | Cayman | 583751 | anticorpo EIA |
| CGRP | Calbiochem | PC205L | IHC |
| DAPI | Roche | 10236276001 | IHC |
Referências
- Bear, M. F., Connors, B. W., Paradiso, M. A. Neuroscience: exploring the brain. , 3 edn, Lippincott Williams & Wilkins. (2007).
- Hunt, S. P., Mantyh, P. W. The molecular dynamics of pain control. Nat Rev Neurosci. 2 (2), 83-91 (2001).
- Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M.
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Reimpressões e permissões
