Summary
Il potenziale vanilloide di tipo 1 (TRPV1) nella regione sovraspinale è stato suggerito di svolgere alcuni ruoli nella funzione cerebrale. Descritto qui è un protocollo per l'iniezione intracerebroventricolare di resiniferatoxin per la desecizione trPV1 sovraspinale nei topi. Vengono inoltre presentate le procedure per alcuni esami del dolore.
Abstract
Il recettore transitorio potenziale vanilloide di tipo 1 (TRPV1), un canale termosensibile, è noto per innescare dolore nei nervi periferici. Oltre alla sua funzione periferica, è stato suggerito anche il suo coinvolgimento nelle funzioni cerebrali. Resiniferatoxin (RTX), un agonista TRPV1 ultrapotente, è stato conosciuto per indurre la dese riesensibilità a lungo termine di TRPV1, e questa desesensibilità è stato un approccio alternativo per studiare la rilevanza fisiologica delle cellule che esprimono TRPV1. Qui descriviamo un protocollo per il trattamento intracerebroventricolare (i.c.v.) con RTX nei topi. Le procedure sono descritte per il test della stimolazione TRPV1 periferica (test RTX) e la stimolazione meccanica (test di pressione della coda) quindi seguire. Anche se le risposte nocicettive dei topi che erano stati somministrati RTX i.c.v. erano paragonabili a quelle dei gruppi di controllo, i topi somministrati da RTX-i.c.v. erano insensibili all'effetto analgesico dell'acetaminofene, suggerendo che il trattamento i.c.v. RTX può indurre la desensitizzazione trPV1 sovraspinal-selettiva. Questo modello murino può essere utilizzato come un comodo sistema sperimentale per studiare il ruolo di TRPV1 nella funzione cerebrale/sovraspinale. Queste tecniche possono anche essere applicate agli studi sulle azioni centrali di altri farmaci.
Introduction
Gli animali ricevono vari stimoli fisici e chimici dal loro ambiente attraverso sensori sui nervi periferici. Il recettore transitorio potenziale vanilloide di tipo 1 (TRPV1) è uno dei canali termosensibili, non selezionativi che agiscono come sensori di calore1,2e l'attivazione e/o modulazione di TRPV1 è noto per essere un passo chiave per la nociception in entrambi i contesti normali e infiammatori3. Anche se il modello di espressione generale è controverso, l'espressione di TRPV1 è stata suggerita anche nelle regioni sovraspinali, essendo coinvolta in varie attività cerebrali (tra cui nocezione4, termoregolazione5,ansia 6, disordine di iperattività di deficitdi attenzione 7e epilessia8). Inoltre, è stato recentemente suggerito che l'acetaminofene, un antidolorifico ampiamente usato, media l'attivazione del TRPV1 centrale per suscitare la sua azione analgesica9,10.
La somministrazione di agonisti TRPV1 in eccesso, tra cui capsaicina e resiniferatoxin (RTX) agli animali porta alla morte di neuroni TRPV1-positivi e desecizione di lunga durata a TRPV1 agonisti11,12. In combinazione con l'applicazione locale (intrathecal13,14, intracisternale15,16,17e intraganglional18), questo approccio di ablazione chimica ha fornito un modo alternativo per indagare le funzioni fisiologiche di TRPV1. Recentemente abbiamo riferito che l'iniezione intracerebroventricolare (i.c.v.) di RTX inibisce l'effetto analgesico dell'acetaminofene nei topi, suggerendo la desegnibilità TRPV1 sovraspinale-selettiva19. In questo manoscritto, presentiamo il protocollo preciso per l'iniezione i.c.v. e i successivi test del dolore.
L'iniezione diretta di farmaci nei ventricoli del cervello permette di studiare i loro effetti centrali, minimizzando eventuali effetti periferici. La procedura di iniezione i.c.v. presentata qui è una modifica del metodo riportato da Haley e McCormick20. Questo metodo è semplice che comporta l'inserimento di un ago di iniezione nei ventricoli successivi attraverso la sutura coronale e non richiede alcuna attrezzatura speciale o procedure chirurgiche per la cannulation.
L'applicazione locale periferica degli agonisti TRPV1 evoca una sensazione di dolore bruciante e infiammazione neurogenica. I topi trattati sistemicamente con RTX e topi TRPV1-KO sono insensibili a questa stimolazione13. Abbiamo eseguito l'iniezione intraplantar di RTX (test RTX) per confermare la conservazione della periferica TRPV1 in RTX-i.c.v. Topi. Questo metodo è una modifica del test formalina convenzionale21.
È stato riferito che i topi trattati sistemicamente con topi RTX e TRPV1-KO mostrano una soglia normale agli stimoli meccanici11,13,22. Qui presentiamo una procedura per il test di pressione della coda per testare i cambiamenti nell'effetto analgesico dell'acetaminofene.
Tutte queste procedure sono ortodosse e versatili, e possono essere applicate agli studi di altri farmaci.
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Protocol
Tutti i protocolli sperimentali qui utilizzati sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Musashino. I topi maschi ddY (SLC, Shizuoka, Giappone) sono stati tenuti per almeno 7 giorni in un ciclo di 12-h luce/scuro prima di esperimenti con acqua e cibo ad libitum. Per gli esperimenti sono stati utilizzati topi di 5 o 6 settimane.
1. Preparazione dei farmaci
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Rtx
NOTA: La soluzione alcolica RTX può causare gravi ustioni cutanee e danni agli occhi. Assicurarsi di utilizzare guanti di gomma e occhiali per la protezione durante la manipolazione. Questa soluzione stock può essere utilizzata per 6 mesi.- Aggiungere 500 L di etanolo a 1 mg di RTX.
- Aggiungere 500 l di poliossietilene (20) monooleato sorbitano alla soluzione di cui sopra e vortice bene.
- Aggiungere 4 mL di salina fisiologica alla miscela e vortice bene.
- Aliquot 40 L della soluzione in tubi a vite da 1,5 mL e conservarli a -40 gradi centigradi.
-
Acetaminofene
- Aggiungere la soluzione propyleneglycol 20% w/v all'acetaminofene ad una concentrazione di 30 mg/mL e sciogliere con un sonicatore. Poiché l'acetaminofene può precipitare a temperatura ambiente diverse ore dopo la dissoluzione, preparare appena prima dell'uso o mantenere la soluzione calda fino all'uso.
2. Iniezione sottocutanea o intracerebroventricolare di RTX
- Scongelare la soluzione stoccata preparata in 1.1. sopra e diluirlo a 20 g/mL in liquido cerebrospinale salino o artificiale (ACSF) costituito da (in mM): 119 NaCl, 2.5 KCl, 1 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 11 glucosio, 1.3 MgSO4, 2.5 CaCl2 equilibrato con 95% O2 e 5% CO2 (pH 7.2).
- Anestesizzare i topi con sale di sodio pentobarbitale (60 mg/kg, intraperitonealmente) e verificare la perdita del riflesso di destra.
- Per il trattamento con s.c., iniettare RTX (20 g/mL) nella parte posteriore del collo ad un volume di 0,1 mL/10 g di peso corporeo. Per il gruppo di controllo, iniettare il veicolo (10% etanolo, 10% di poliossilene (20) monooleato sorbitano e 80% salino) allo stesso modo.
- Per il trattamento con i.c.v., iniettare 5 L di RTX (20 g/mL) nel ventricolo laterale destro. Per il gruppo di controllo, iniettare il veicolo (10% etanolo, 10% di poliossilene (20) monooleato sorbitano e 80% ACSF) nello stesso modo.
- Passare un ago usa e getta da 27 G attraverso un tubo metallico (0,8 mm I.D.) per esporre la punta dell'ago da 3,0 a 3,5 mm (Figura 1A).
- Disinfettare la testa del topo con il 70% di alcol e tenere saldamente con le dita le ossa squamosali del mouse (Figura 1B).
NOTA: Prestare attenzione alle posizioni delle sporgenze squamosali, poiché queste sporgenze serviranno come punti di riferimento per l'iniezione. - Spostare l'ago lateralmente sul cuoio capelluto e trovare la sutura sagittale mentre la punta dell'ago è agganciata alla sutura.
- Spostare la punta di circa 1 mm a destra, quindi spostare la punta in modo rostrale e trovare la sutura coronale come con 2.4.3. (Figura 1B).
- Inserire l'ago lentamente e verticalmente, iniettare la soluzione RTX in circa 10 secondi e tenerlo premuto per circa 10 secondi.
- Ritirare l'ago lentamente e riportare il mouse nella sua gabbia di casa. Il sanguinamento è di solito minimo o assente. Se si verifica un sanguinamento importante, l'uso di un altro topo deve essere considerato.
- Assegnare i topi pretrattati come soggetti per il test RTX o il test di pressione della coda (rispettivamente i passaggi 3 e 4).
3. Test RTX
NOTA: il test viene eseguito tra le 10:00 e le 17:00. La sala prove è mantenuta a 200 lux e 24-26 gradi centigradi.
- Una settimana dopo i pretrattamenti con RTX (fase 2.), trasferire i topi nella sala prove almeno 60 minuti prima di iniziare il test.
- Pesare e posizionare ogni mouse singolarmente in una gabbia di plexiglass (29,5 x 17,5 x 13,5 cm3 altezza) almeno 30 minuti prima di iniziare la prova per consentirgli di acclimatarsi all'ambiente.
NOTA: l'ordine dei test deve essere controbilanciato tra i gruppi di pretrattamento. - Somministrare l'acetaminofene (300 mg/kg) al topo intraperitonealmente 20 min prima della prova.
- Tenere il mouse liberamente in un piccolo sacchetto di stoffa e inserire un ago da 30 calibro nel tallone della zampa posteriore destra. Far avanzare l'ago sottocutaneamente vicino alle pastiglie da passeggio e iniettare 20 L di soluzione RTX (0,05 g/mL).
- Misurare il periodo di comportamento di leccare /mordere nella regionelabosa della zampa interessata in ogni blocco di 5 minuti.
4. Test di pressione della coda
NOTA: un misuratore di pressione di tipo Randall-Selitto viene utilizzato per valutare la soglia per la nocezione meccanica acuta. Il test viene eseguito tra le 10:00 e le 17:00. La sala prove è mantenuta a 200 lux e 24-26 gradi centigradi.
- Una settimana dopo i pretrattamenti con RTX (fase 2.), trasferire i topi nella sala prove e pesare e posizionare ogni mouse singolarmente in una gabbia di plexiglass.
- Contrassegnare le macchie a 1,5 e 2,5 cm dalla base della coda.
- Tenere il mouse liberamente in un piccolo sacchetto di stoffa e applicare la pressione sulle macchie con una sonda smussata.
NOTA: Viene imposta una pressione di taglio di 250 g per evitare danni ai tessuti. - Determinare la pressione necessaria per suscitare il comportamento di fuga (sbattimento della coda, torsione e cigobramento) e calcolare la soglia di nocecettivo mediando la pressione determinata nei due punti.
- Ripetere i passaggi 4.3. al 4,4. ogni 15 min.
- Dopo aver ottenuto la linea di base, somministrare l'acetaminofene (300 mg/kg) al topo intraperitonealmente. Dopo l'amministrazione, ripetere i passaggi 4.3. e 4,4 ogni 15 minuti.
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Representative Results
I topi trattati con i.c.v. non mostrano anomalie apparenti nel loro aspetto, attività spontanee, pesocorporeo 19 e temperatura corporea del nucleo (gruppo trattato con veicolo, 38,4 x 0,3 gradi centigradi, n - 6; Gruppo trattato da RTX, 38,7 x 0,2 gradi centigradi, n - 6).
Figura 2A-B mostra la reattività dei topi trattati con s.c.- o i.c.v. all'iniezione intraplantar di RTX. Il comportamento di leccare/mordere dei topi trattati con il veicolo è stato notevole nei primi 10 min19. Anche se i topi s.c.-pretrattati non mostravano affatto un comportamento leccare/mordere, i topi pretrattati i.c.v.rispondevano normalmente all'iniezione plantare di RTX. Inoltre, come mostrato nella Figura 2B, la somministrazione intraperitoneale di acetaminofene (300 mg/kg) ha ridotto il comportamento di leccare/mordere i topi trattati con veicolo,i.c.v., ma non quello dei topi trattati con RTX-i.c.v.
La figura 2C mostra gli effetti analgesici dell'acetaminofene (300 mg/kg) nella prova di pressione della coda. L'acetaminofene ha ridotto la risposta nocicettiva dei topi pretrattati dal veicolo in entrambi i test, ma gli effetti analgesici dell'acetaminofene sono stati inibiti nei topi che sono stati pretrattati i.c.v. con RTX.
Figura 1: Visualizzazioni fotografiche e schematiche dell'iniezione i.c.v. (A) Ago utilizzato per l'iniezione i.c.v. (B) Schema del cranio del topo e il movimento della punta dell'ago. Le ossa squamosali sono mostrate in blu. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Risposte nocicettive di topi pretrattati s.c. o i.c.v. con RTX. (A) Corso di tempo (pannello sinistro) e tempo totale di leccare / mordere comportamento (pannello destro) di topi s.c.-pretrattato. RTX è stato iniettato nell'area plantare al momento zero (indicato dalla testa della freccia). (B) Corso di tempo (pannello sinistro) e tempo totale di leccare / mordere il comportamento (pannello destro) di i.c.v.-pretrattato topi. L'acetaminofene (300 mg/kg) o il suo veicolo (20% propyleneglycol) è stato somministrato intraperitonealmente 20 min prima dell'iniezione intraplantar di RTX (indicata dalla testa della freccia). (C) Soglia di dolore meccanico nella coda dei topi con i.c.v. pretrattati e l'effetto analgesico dell'acetaminofene. Tutti i dati sono stati espressi come media : SEM. Il numero di topi in ogni gruppo viene visualizzato tra parentesi. Il test U Mann-Whitney a due code è stato utilizzato per confrontare i dati per due gruppi. Le differenze in P<0.05 sono state considerate significative. AcAP, acetaminofene; PG, propyleneglycol; n.s., non significativo; i.pl., iniezione intraplantar. Queste cifre sono state modificate da Fukushima et al19. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il passo più critico in questi esperimenti è il successo dell'iniezione i.c.v. La tecnica di iniezione i.c.v. utilizzata qui è abbastanza semplice, ma richiede una certa pratica. Prima degli esperimenti, si raccomanda la pratica con coloranti (ad es. 0,5% di blu di prova in salina). Se l'iniezione viene eseguita correttamente, un segno di ago deve essere evidente sulla sutura coronale e il colorante iniettato deve essere presente nel ventricolo contralaterale e nel terzo ventricolo. Inoltre, l'inserimento forzato deve essere evitato durante l'iniezione. Se la punta dell'ago è posizionata correttamente sulla sutura coronale, l'ago dovrebbe penetrare nel cranio senza intoppi.
Questa tecnica i.c.v. può essere applicata anche a topi svegli e non anetiti, e abbiamo riportato gli effetti centrali acuti dei farmaci esaminati con questa tecnica23,24. Anche se la presente procedura è vantaggiosa in quanto non è necessaria alcuna attrezzatura speciale per la cannulation, l'iniezione i.c.v. può essere eseguita una sola volta. Se è necessaria una somministrazione ripetuta di farmaci, è necessaria la cannulation.
Il test RTX qui presentato è un approccio facile da usare per valutare la funzione della periferica TRPV13,19. Il comportamento nocivo può essere osservato più prominentemente ad una dose di 1-10 ng RTX e inibito dalla co-iniezione di capsazepine, un antagonista TRPV119,25. Nel test formalina alcuni gruppi video-tape gli esperimenti, ma l'osservazione post-hoc è spesso difficile perché i topi tendono a coprire la zampa interessata con la testa e il corpo. Pertanto, gli sperimentatori nel nostro laboratorio osservano e misurano direttamente il comportamento di leccare/mordere. In questo scenario, si dovrebbe fare attenzione a non disturbare i topi. Inoltre, nei test del dolore, è molto importante calmare sufficientemente il topo. Una presa eccessivamente forte e un ambiente rumoroso potrebbero produrre analgesia indotta dallo stress e ritardare la risposta nocicettiva.
I topi che sono i.c.v.-pretrattati con RTX mostrano una normale risposta nocicettiva nel test RTX e nel test di pressione della coda. Tuttavia, questi topi sono insensibili agli effetti analgesici dell'acetaminofene, che è stato suggerito per mediare il TRPV1centrale 9,10. Questi risultati suggeriscono che la desesiitizzazione TRPV1 supraspinal-selettiva può essere indotta in RTX-i.c.v. Topi. Anche se la desesiitizzazione TRPV1 è stata eseguita con l'applicazione locale di agonisti13,14,15,16,17,18, desetibilità sovraspinale-selettiva non è ancora stata raggiunta. Il RTX-i.c.v. i protocolli di iniezione qui presentati forniranno un comodo modello sperimentale per studiare il ruolo di TRPV1 nella funzione sovraspinale.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse per dichiarare
Acknowledgments
Nessuno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Resiniferatoxin | LKT Laboratories | R1774 | used for s.c./i.c.v. pretreatments and the RTX test |
| Acetaminophen | IWAKI SEIYAKU | gifted from IWAKI SEIYAKU | |
| Pentobarbital sodium salt | Tokyo Chemical Industry | P0776 | used for anesthesia |
| Ethanol (99.5) | Wako Pure Chemical Industries | 057-00456 | used for dissolving RTX |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monooleate | Wako Pure Chemical Industries | 161-21621 | used for dissolving RTX |
| 25 μL microsyringe | Hamilton | 1702LT | used for i.c.v. injection |
| 100 μL microsyringe | Hamilton | 1710LT | used for intraplantar injection |
| 26-gauge disposable needle | TERUMO | NN-2613S | used for i.c.v. injection |
| 30-gauge disposable needle | NIPRO | 01134 | used for intraplantar injection |
| Pressure meter | Ugo Basile | Analgesy-Meter Type 7200 | used for tail pressure test |
References
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