Summary
O receptor transitório potencial vanilloide tipo 1 (TRPV1) na região supraspinal tem sido sugerido para desempenhar alguns papéis na função cerebral. Descrito aqui é um protocolo para injeção intracerebroventricular de resiniferatoxina para dessensibilização trpv1 supraspinal em camundongos. Procedimentos para alguns exames de dor também são apresentados.
Abstract
O receptor transitório potencial vanilloide tipo 1 (TRPV1), um canal termosensível de ção, é conhecido por desencadear dor nos nervos periféricos. Além de sua função periférica, seu envolvimento em funções cerebrais também tem sido sugerido. A resiniferatoxina (RTX), um agonista ultrapotente TRPV1, é conhecida por induzir a dessensibilização a longo prazo do TRPV1, e essa dessensibilização tem sido uma abordagem alternativa para investigar a relevância fisiológica das células que expressam TRPV1. Aqui descrevemos um protocolo para tratamento intracerebroventricular (i.c.v.) com RTX em camundongos. Os procedimentos são descritos para testar a nocicepção à estimulação TRPV1 periférica (teste RTX) e à estimulação mecânica (teste de pressão da cauda) seguida. Embora as respostas nociceptivas dos camundongos que tinham sido administrados RTX i.c.v. fossem comparáveis às dos grupos de controle, os camundongos administrados pela RTX-i.c.v. eram insensíveis ao efeito analgésico do acetaminofeno, sugerindo que o tratamento RTX pode induzir a dessensibilização TRPV1 extraicional-seletiva. Este modelo de mouse pode ser usado como um sistema experimental conveniente para estudar o papel do TRPV1 na função cérebro/supraspinal. Essas técnicas também podem ser aplicadas a estudos das ações centrais de outras drogas.
Introduction
Os animais recebem vários estímulos físicos e químicos de seu ambiente através de sensores nos nervos periféricos. O receptor transitório potencial vanilloide tipo 1 (TRPV1) é um dos canais de cáção termosensíveis e não seletivos que atuam como sensores de calor1,,2, e ativação e/ou modulação do TRPV1 é conhecido por ser um passo fundamental para a nocicepção em contextos normais e inflamatórios3. Embora o padrão geral de expressão seja controverso, a expressão do TRPV1 também tem sido sugerida em regiões supraspinais, estando envolvida em diversas atividades cerebrais (incluindo nocicepção4, termoregulação5,ansiedade6,transtorno do déficit de atenção hiperatividade7e epilepsia8). Além disso, recentemente foi sugerido que o acetaminofeno, um analgésico amplamente utilizado, media a ativação do TRPV1 central para provocar sua ação analgésico9,,10.
A administração do agonista TRPV1 em excesso, incluindo capsaicina e resiniferatoxina (RTX) em animais, leva à morte de neurônios trpv1 positivos e à dessensibilização de longa duração aos agonistas TRPV111,12. Combinada com a aplicação local (intrathecal13,14, intracisternal15,16,17e intraganglional18), esta abordagem de ablação química forneceu uma maneira alternativa de investigar as funções fisiológicas do TRPV1. Recentemente, relatamos que a injeção intracerebroventricular (i.c.v.) de RTX inibe o efeito analgésico do acetaminofeno em camundongos, sugerindo dessensibilização TRPV1 extra-seletiva supraspinal19. Neste manuscrito, apresentamos o protocolo preciso para injeção i.c.v. e testes subsequentes de dor.
A injeção direta de drogas nos ventrículos do cérebro torna possível estudar seus efeitos centrais enquanto minimiza quaisquer efeitos periféricos. O procedimento de injeção i.c.v. apresentado aqui é uma modificação do método relatado por Haley e McCormick20. Este método é simples envolvendo a inserção de uma agulha de injeção nos ventrículos laterais através da sutura coronal e não requer nenhum equipamento especial ou procedimentos cirúrgicos para a cannulação.
A aplicação local periférica de agonistas TRPV1 evoca uma sensação de dor ardente e inflamação neurogênica. Camundongos que são tratados sistematicamente com RTX, e camundongos TRPV1-KO, são insensíveis a esta estimulação13. Realizamos injeção intraplantar de RTX (teste RTX) para confirmar a preservação do TRPV1 periférico em RTX-i.c.v. Ratos. Este método é uma modificação do teste de formalina convencional21.
Foi relatado que camundongos tratados sistematicamente com camundongos RTX e TRPV1-KO mostram um limiar normal para estímulos mecânicos11,,13,22. Aqui apresentamos um procedimento para o teste de pressão da cauda para testar alterações no efeito analgésico do acetaminofeno.
Todos esses procedimentos são ortodoxos e versáteis, e podem ser aplicados em estudos de outras drogas.
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Protocol
Todos os protocolos experimentais utilizados aqui foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Musashino. Os ratos ddY machos (SLC, Shizuoka, Japão) foram mantidos por pelo menos 7 dias sob um ciclo claro/escuro de 12 h antes de experimentos com água e ad libitum alimentar. Camundongos de 5 ou 6 semanas foram usados para os experimentos.
1. Preparação de Drogas
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Rtx
NOTA: A solução alcoólica RTX pode causar queimaduras graves na pele e danos nos olhos. Certifique-se de usar luvas de borracha e óculos para proteção durante o manuseio. Esta solução de estoque pode ser usada por 6 meses.- Adicione 500 μL de etanol a 1 mg de RTX.
- Adicione 500 μL de monooleto de sorbitano de polioxime (20) à solução acima e bem ao vórtice.
- Adicione 4 mL de soro fisiológico à mistura e ao vórtice bem.
- Alíquota de 40 μL da solução em tubos de tampa de parafuso de 1,5 mL e armazená-los a -40 °C.
-
Acetaminofeno
- Adicione 20% de solução de propilenoglicol a acetaminofeno a uma concentração de 30 mg/mL, e dissolva-se com um sonicator. Uma vez que o acetaminofeno pode precipitar-se à temperatura ambiente várias horas após a dissolução, prepare-se um pouco antes do uso ou mantenha a solução aquecida até o uso.
2. Injeção subcutânea ou intracerebroventricular de RTX
- Descongele a solução estocada preparada em 1.1. acima e diluí-lo a 20 μg/mL em soro fisiológico ou líquido cerebrospinal artificial (ACSF) consistindo (em mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 1 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 11 glicose, 1,3 MgSO4, 2,5 CaCl2 equilibrada com 95% O2 e 5% CO2 (pH 7.2).
- Anesthetize camundongos com sal de sódio pentobarbital (60 mg/kg, intraperitoneally) e verifique se há perda do reflexo de retração.
- Para tratamento s.c., injete RTX (20 μg/mL) na parte de trás do pescoço a um volume de 0,1 mL/10 g de peso corporal. Para o grupo controle, injete o veículo (10% etanol, 10% de polioximetileno (20) monooleato de sorbitano e 80% salino) da mesma forma.
- Para tratamento i.c.v., injete 5 μL de RTX (20 μg/mL) no ventrículo lateral direito. Para o grupo controle, injete o veículo (10% etanol, 10% de polioximetileno (20) monooleato sorbitano e 80% ACSF) da mesma forma.
- Passe uma agulha descartável de 27 G através de um tubo de metal (0,8 mm de identidade) para expor a ponta de 3,0-3,5 mm da agulha(Figura 1A).
- Desinfete a cabeça do rato com 70% de álcool, e segure os ossos escamosos do camundongo firmemente com os dedos(Figura 1B).
NOTA: Preste atenção às posições das saliências esquamosais, uma vez que essas saliências servirão como marcos para injeção. - Mova a agulha lateralmente no couro cabeludo, e encontre a sutura sagital enquanto a ponta da agulha está ligada à sutura.
- Mova a ponta cerca de 1 mm para a direita, depois mova a ponta rostrally, e encontre a sutura coronal como com 2.4.3. (Figura 1B).
- Insira a agulha lentamente e verticalmente, injete a solução RTX em cerca de 10 segundos e segure-a por cerca de 10 segundos.
- Retire a agulha lentamente, e devolva o rato para sua gaiola. O sangramento geralmente é mínimo ou ausente. Se ocorrer hemorragia grave, o uso de outro rato deve ser considerado.
- Atribuam os camundongos pré-tratados como sujeitos para o teste RTX ou o teste de pressão da cauda (Passo 3 e 4, respectivamente).
3. Teste RTX
NOTA: O teste é realizado entre 10h e 17h. A sala de testes é mantida em 200 lux e 24-26 °C.
- Uma semana após os pré-tratamentos com RTX (Passo 2.), transfira ratos para a sala de testes pelo menos 60 minutos antes de iniciar o teste.
- Pesar e colocar cada rato individualmente em uma gaiola de plexiglass (29,5 × 17,5 × 13,5 cmde altura) pelo menos 30 minutos antes de iniciar o teste, a fim de permitir que ele se aclimata ao ambiente.
NOTA: A ordem dos testes deve ser contrabalançada em grupos de pré-tratamento. - Administre acetaminofeno (300 mg/kg) ao mouse intraperitoneally 20 min antes do teste.
- Segure o mouse livremente em um pequeno saco de pano e insira uma agulha de calibre 30 no calcanhar da pata traseira direita. Avance a agulha subcutâneamente para perto das almofadas de caminhada e injete 20 μL de solução RTX (0,05 μg/mL).
- Meça o período de comportamento de lambida/mordeção na região da pata afetada em cada bloco de 5 minutos.
4. Teste de pressão da cauda
NOTA: Um medidor de pressão do tipo Randall-Selitto é usado para avaliar o limiar para nocicepção mecânica aguda. O teste é realizado entre 10:00 e 17:00. A sala de testes é mantida em 200 lux e 24-26 °C.
- Uma semana após os pré-tratamentos com RTX (Passo 2.), transfira ratos para a sala de testes, e pese e coloque cada rato individualmente em uma gaiola de plexiglass.
- Marque as manchas a 1,5 e 2,5 cm da base da cauda.
- Segure o mouse livremente em um pequeno saco de pano e aplique pressão nos pontos com uma sonda sem cortes.
NOTA: Uma pressão de corte de 250 g é imposta para evitar danos teciduais. - Determine a pressão necessária para provocar o comportamento de fuga (batedor de cauda, torção e guincho), e calcule o limiar nociceptivo, com uma média da pressão determinada nos dois pontos.
- Repita os passos 4.3. para 4.4. a cada 15 minutos.
- Após obter a linha de base, administre acetaminofeno (300 mg/kg) no mouse intraperitoneally. Após a administração, repita as etapas 4.3. e 4,4 a cada 15 minutos.
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Representative Results
Os camundongos tratados com i.c.v. não apresentam anormalidades aparentes em sua aparência, atividades espontâneas, peso corporal19 e temperatura corporal do núcleo (grupo tratado com veículos, 38,4 ± 0,3 °C, n = 6; Grupo tratado com RTX, 38,7 ± 0,2 °C, n = 6).
Figura 2A-B mostram a capacidade de resposta dos camundongos tratados com s.c.- ou i.c.v.para a injeção intraplantar de RTX. O comportamento de lambida/mordeção de camundongos tratados com veículos foi notável nos primeiros 10 min19. Embora os camundongos pré-tratados não tenham exibido comportamento de lambida/mordida, os camundongos pré-tratados normalmente respondiam à injeção plantar de RTX. Além disso, como mostrado na Figura 2B, a administração intraperitoneal de acetaminofeno (300 mg/kg) reduziu o comportamento de lambida/mordeção de camundongos tratados com i.c.v., mas não o de camundongos tratados com RTX-i.c.v.
A Figura 2C mostra os efeitos analgésicos do acetaminofeno (300 mg/kg) no teste de pressão da cauda. O acetaminofeno reduziu a resposta nociceptiva de camundongos pré-tratados por veículos em ambos os testes, mas os efeitos analgésicos do acetaminofeno foram inibidos em camundongos que foram pré-tratados i.c.v. com RTX.
Figura 1: Visões fotográficas e esquemáticas da injeção i.c.v. (A) Agulha usada para injeção i.c.v. (B) Esquema do crânio do rato e do movimento da ponta da agulha. Ossos esqumosais são mostrados em azul. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Respostas nociceptivas de camundongos que foram pré-tratados s.c. ou i.c.v. com RTX. (A) Curso de tempo (painel esquerdo) e tempo total de comportamento de lambida/mordeção (painel direito) de ratos pré-tratados s.c.. RTX foi injetado na área plantar no momento zero (indicado pela cabeça de seta). (B) Curso de tempo (painel esquerdo) e tempo total de comportamento de lambida/mordeção (painel direito) de camundongos pré-tratados i.c.v.. Ou o acetaminofeno (300 mg/kg) ou seu veículo (20% propilenoglicol) foi administrado intraperitoneal 20 min antes da injeção intraplantar de RTX (indicada pela cabeça de seta). (C) Limiar de dor mecânico na cauda de camundongos pré-tratados i.c.v.-e o efeito analgésico do acetaminofeno. Todos os dados foram expressos como média ± SEM. O número de ratos em cada grupo é mostrado entre parênteses. O teste U de duas caudas de Mann-Whitney foi usado para comparar os dados de dois grupos. As diferenças em P<0,05 foram consideradas significativas. AcAP, acetaminofeno; PG, propilenoglicol; n.s., não significativo; i.pl., injeção intraplantar. Estes números foram modificados a partir de Fukushima et al19. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O passo mais crítico nesses experimentos é o sucesso da injeção i.c.v. A técnica de injeção i.c.v. usada aqui é bastante simples, mas requer alguma prática. Antes dos experimentos, recomenda-se a prática com corantes (por exemplo, 0,5% azul trypan em soro fisiológico). Se a injeção for realizada corretamente, uma marca de agulha deve ser evidente na sutura coronal e o corante injetado deve estar presente no ventrículo contralateral e no terceiro ventrículo. Além disso, a inserção forçada deve ser evitada durante a injeção. Se a ponta da agulha estiver corretamente colocada na sutura coronal, a agulha deve penetrar suavemente no crânio.
Esta técnica i.c.v. também pode ser aplicada a camundongos acordados e não anestesiados, e relatamos os efeitos centrais agudos das drogas examinadas usando esta técnica23,24. Embora o presente procedimento seja vantajoso, pois não é necessário nenhum equipamento especial para a cannulação, a injeção i.c.v. só pode ser realizada uma vez. Se for necessária uma administração repetida de drogas, a cannulação é necessária.
O teste RTX apresentado aqui é uma abordagem fácil de usar para avaliar a função do TRPV13,,19. O comportamento nociceptivo pode ser observado com mais destaque em uma dose de 1-10 ng RTX e inibido pela co-injeção de capsazepine, um antagonista TRPV119,25. No teste de formalina alguns grupos gravam os experimentos, mas a observação pós-hoc é muitas vezes difícil porque os ratos tendem a cobrir a pata afetada com a cabeça e o corpo. Portanto, os experimentadores em nosso laboratório observam e medem diretamente o comportamento de lambida/mordida. Neste cenário, deve-se tomar cuidado para não perturbar os ratos. Além disso, em testes de dor, é muito importante acalmar suficientemente o mouse. A garras excessivamente fortes e um ambiente barulhento podem produzir analgésicos induzidos pelo estresse e retardar a resposta nociceptiva.
Camundongos que são i.c.v.-pré-tratados com RTX mostram uma resposta nociceptiva normal no teste RTX e no teste de pressão da cauda. No entanto, esses camundongos são insensíveis aos efeitos analgésicos do acetaminofeno, que foi sugerido para mediar o TRPV1central 9,10. Esses resultados sugerem que a dessensibilização TRPV1 extra-seletiva supraspinal pode ser induzida em RTX-i.c.v. Ratos. Embora a dessensibilização do TRPV1 tenha sido realizada com a aplicação local de agonistas13,14,,15,16,,17,18, a dessensibilização supraspinal-seletiva ainda não foi alcançada. O RTX-i.c.v. os protocolos de injeção aqui apresentados fornecerão um modelo experimental conveniente para estudar o papel do TRPV1 na função supraspinal.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para declarar
Acknowledgments
Nenhum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Resiniferatoxin | LKT Laboratories | R1774 | used for s.c./i.c.v. pretreatments and the RTX test |
| Acetaminophen | IWAKI SEIYAKU | gifted from IWAKI SEIYAKU | |
| Pentobarbital sodium salt | Tokyo Chemical Industry | P0776 | used for anesthesia |
| Ethanol (99.5) | Wako Pure Chemical Industries | 057-00456 | used for dissolving RTX |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monooleate | Wako Pure Chemical Industries | 161-21621 | used for dissolving RTX |
| 25 μL microsyringe | Hamilton | 1702LT | used for i.c.v. injection |
| 100 μL microsyringe | Hamilton | 1710LT | used for intraplantar injection |
| 26-gauge disposable needle | TERUMO | NN-2613S | used for i.c.v. injection |
| 30-gauge disposable needle | NIPRO | 01134 | used for intraplantar injection |
| Pressure meter | Ugo Basile | Analgesy-Meter Type 7200 | used for tail pressure test |
References
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