Artigo de método

Análise molecular de transição endotelial-mesenquimais induzida por transformar o fator de crescimento-β sinalização

DOI:

10.3791/57577

⸱

3 de agosto de 2018

 ,  ,  , 
1David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 2Department of Respiratory Medicine, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 3Hastings Center for Pulmonary Research, Division of Pulmonary, Critical Care and Sleep Medicine, Department of Medicine, Keck School of Medicine, University of Southern California, 4Department of Molecular Pathology, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo

Neste artigo

Resumo

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Um protocolo para indução em vitro de transição endotelial-mesenquimais (EndMT), que é útil para investigar as vias de sinalização celulares envolvido em EndMT, é descrito. Neste modelo experimental, EndMT é induzida pelo tratamento com TGF-β em células endoteliais de MS-1.

Resumo

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Plasticidade fenotípica de células endoteliais está subjacente o desenvolvimento do sistema cardiovascular, doenças cardiovasculares e várias condições associadas com fibrose do órgão. Nestas condições, as células endoteliais diferenciadas adquirem fenótipos mesenquimais semelhante. Este processo é chamado de transição endotelial-mesenquimais (EndMT) e é caracterizado por downregulation de marcadores endoteliais, upregulation de marcadores mesenquimais e alterações morfológicas. EndMT é induzida por várias vias de sinalização, incluindo (TGF) do fator de crescimento transformante-β, Wnt e entalhe e regulado por mecanismos moleculares semelhantes de transição epitelial-mesenquimal (EMT) importante para gastrulação, fibrose do tecido, e metástase do cancro. Compreender os mecanismos da EndMT é importante para desenvolver abordagens diagnósticas e terapêuticas, visando EndMT. Indução robusta do EndMT em vitro é útil para caracterizar assinaturas de expressão de gene comum, identificar mecanismos moleculares druggable e tela para moduladores de EndMT. Aqui, descrevemos um método em vitro para indução de EndMT. Células endoteliais microvascular do pâncreas de rato MS-1 submetido a EndMT após a exposição prolongada ao TGF-β e mostram upregulation de marcadores mesenquimais e mudanças morfológicas, bem como a indução de múltiplos inflamatórias quimiocinas e citocinas. Métodos de análise de microRNA (miRNA) modulação também estão incluídos. Esses métodos fornecem uma plataforma para investigar os mecanismos subjacentes a EndMT e a contribuição dos miRNAs para EndMT.

Introdução

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Endotelial-mesenquimais transição (EndMT) é o processo pelo qual uma célula endotelial diferenciada passa por uma variedade de alterações moleculares, resultando em uma célula mesenquimais do fibroblasto como1. EndMT foi inicialmente descrita como uma transformação de células endoteliais durante o desenvolvimento do coração2,3. No desenvolvimento inicial do coração, o tubo de coração consiste em um interior endocárdio e miocárdio um exterior. Estas duas camadas são separadas por uma camada de matriz extracelular, chamada geleia cardíaca. As células embrionárias endocárdico, que adquirem marcadores de células endoteliais, trânsito em células mesenquimais, invadem a geleia cardíaca subjacente e promovem a formação dos coxins cardíacas, fornecendo a base para as válvulas atrioventricular e septo e as válvulas semilunar. Além disso, foi sugerido para ser fontes de pericitos e células de músculo liso vascular em outros sistemas vasculares embrionários, incluindo vasos coronários, aorta abdominal e artéria pulmonar4,5,6EndMT. Além disso, o EndMT está implicada na fisiológico angiogênico brotando7.

Acumular evidência tem sugerido que o EndMT também está envolvida em várias doenças cardiovasculares e outras doenças1,8. EndMT-associado a condições incluem calcificação vascular, aterosclerose, hipertensão arterial pulmonar, malformação cavernosa, fibrose do órgão, remodelação de enxerto de veia, disfunção do enxerto em transplante renal e câncer8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18. um recente relatório descrito que vários marcadores moleculares de EndMT podem ser uma ferramenta para a previsão do diagnóstico e prognóstico da disfunção do enxerto renal em rim transplante17. Modulação de vias de sinalização celulares EndMT-relacionados foram mostrados para melhorar várias condições de doença, incluindo Fibrose cardíaca e enxerto de veia remodelação no animal modelos8,15. Portanto, compreender os mecanismos subjacente EndMT é importante desenvolver estratégias diagnósticas e terapêuticas, visando EndMT.

EndMT é caracterizada por perda de junções célula-célula, aumento da capacidade migratória, downregulation de genes específicos endoteliais como VE caderina e upregulation de genes mesenquimais incluindo actina de músculo liso-α (α-SMA). Além disso, EndMT e transição epitelial-mesenquimal (EMT), um processo similar que converte células epiteliais de células mesenquimais, estão associados a produção alterada de vários componentes da matriz extracelular, que pode contribuir para o desenvolvimento de tecido fibrose8,19.

Recentemente, vários estudos em vitro de EndMT tem elucidado detalhes dos mecanismos moleculares de EndMT15,20. EndMT é induzido por vários caminhos de sinalização, incluindo (TGF) do fator de crescimento transformante-β, Wnt e entalhe1. Entre eles, o TGF-β tem um papel crucial na indução de EMT e EndMT. Em EndMT, uma exposição prolongada aos resultados de TGF-β em EndMT em várias células endoteliais, enquanto exposição curta parece ser insuficiente21. Descrevemos aqui um protocolo simples para indução de EndMT, no qual 1 de SVEN milha (MS-1) células endoteliais microvascular do pâncreas de rato sofrem EndMT em vitro após exposição prolongada ao TGF-β20. Neste modelo, várias análises a jusante podem ser realizadas para investigar características de marca do EndMT, incluindo as alterações morfológicas, downregulation de marcadores endoteliais, upregulation de genes inflamatórios, do citoesqueleto e mesenquimais marcadores rearranjos e contração do gel de colágeno.

MicroRNAs (miRNAs) são 22 ~ nt pequenos RNAs regulamentares que dirigem a repressão posttranscriptional de mRNA vários alvos22,23. Através do reconhecimento de semente mediada por sequência alvo, miRNAs suprimir centenas de genes-alvo e modulam diversas funções celulares, tais como motilidade, proliferação e diferenciação celular. Este também é o caso de regulamento de EMT e EndMT, e vários miRNAs têm sido relatados como reguladores de EMT e EndMT24,25. O modelo de EndMT apresentado nesta revisão pode ser facilmente combinado com procedimentos de modulação de miRNA para testar as funções de miRNAs em EndMT. A presente revisão resume nossos procedimentos experimentais para investigar EndMT TGF-β-induzida em células de MS-1 e inclui também a comparação das condições de indução de EndMT por TGF-β em outras células endoteliais.

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Protocolo

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1. indução de EndMT

  1. Manter as células de MS-1 em condições de cultura padrão e evitar a confluência. Uma fonte de células de MS-1 é descrita na Tabela de materiais. Para células de MS-1, uso médio mínimo essencial-α (α-MEM) com 10% de soro fetal bezerro (FCS), 50 U/mL penicilina e estreptomicina 50 de μg/mL.
  2. Células de lavar MS-1 em 10 cm do prato com 1 x salina tamponada fosfato (PBS) e adicionam 1,0 mL de tripsina na placa. Incubar durante 5 min a 37 ° C.
  3. Separe as células usando 9 mL do meio de cultura. Recolha a suspensão de células em um tubo de 15 mL.
  4. Centrifugar a suspensão celular de 300 – 400 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
  5. Retire o sobrenadante cuidadosamente e suspender o centrifugado em meios de cultura previamente aquecido.
  6. Contagem de células viáveis usando solução de azul de Trypan e um hemocytometer padrão ou um contador automático de células.
  7. Placa MS-1 células em placas de cultura padrão não revestidos em 0,5 x 103 células por cm2 por muito tempo o termo cultura. Por exemplo, células de3 placa de 5,0 x 10 por bem em um 6 cultura bem placa. Use os mesmos meios de cultura, incluindo a mesma concentração de FCS. Nas células do MS-1, TGF-β induz EndMT na cultura de longo prazo (pelo menos 48-72 h), com o uso do FCS.
  8. Estimula as células endoteliais com TGF-β2 (uma concentração final de 1 ng/mL) após 24 h.
  9. Células de cultura numa incubadora umidificado (5% de CO2, 37 ° C). Monitorar as células diariamente quando o foco sobre as alterações morfológicas.
  10. Substitua a mídia fresco pré-aquecido meios de cultura contendo TGF-β2 após 48 h de tratamento com TGF-β na cultura de longo prazo.
  11. Proceda as análises a jusante. Normalmente, reorganização de actina é observada após 24 h de tratamento, e downregulation de marcadores endoteliais e upregulation de marcadores mesenquimais são observados após 48-72 h de tratamento com TGF-β.

2. Immunocytochemical análise

  1. Manter as células de MS-1 em condições de cultura padrão.
  2. Células da placa MS-1 para 4 células bem slides de câmara de cultura em 1,0 x 103 células por poço (1,7 cm2). Slides estão revestidos com gelatina. Uso de 0,5 m a 1,0 mL de meios de cultura por bem.
  3. Estimula as células endoteliais com TGF-β2 (uma concentração final de 1 ng/mL) após 24 h. Ao analisar o envolvimento de rocha em EndMT, adicione um antes de 1h ROCK inibidor Y-27632 (10 μM) para tratamento de TGF-β. Ao avaliar o efeito da inibição da sinalização do TGF-β, inibidores de cinase do receptor TGF-β podem ser usados.
  4. Células de cultura numa incubadora umidificado (5% de CO2, 37 ° C). Reorganização de actina é observada nas células de MS-1 após 24 h de tratamento com TGF-β. Outras alterações tornar-se evidente após 48-72 h de tratamento. Para a cultura de 72 h, substitua a mídia mídia fresca contendo TGF-β após 48 h de tratamento com TGF-β.
  5. F-Actina de coloração
    1. Após 24 h de tratamento de TGF-β, remova a mídia, corrigir células com paraformaldeído 4% em PBS 1x por 20 min em temperatura ambiente e enxágue células com PBS 1x.
    2. Incube com 0,2% Triton X-100 por 5 min à temperatura ambiente.
    3. Enxague as células três vezes com PBS 1x.
    4. Incube com isotiocianato de B faloidina-diversos de Amanita phalloides diluído 150-fold com tampão de bloqueio por 1h à temperatura ambiente.
    5. Enxague as células três vezes com PBS 1x.
    6. Mancha os núcleos com corantes de ligação de ácido nucleico cianina durante 5 min à temperatura ambiente.
    7. Slides de enxaguamento e monte lamelas viradas para baixo em um slide usando o slide meios de montagem.
    8. Observe com um microscópio confocal. Use um laser de 543 nm e um filtro de emissão de 560 – 615 nm para a deteção da fluorescência de faloidina. Usar um laser de 633 nm e um filtro de emissão mais de 650 nm para coloração nuclear. Tratamento com TGF-β, formação de fibras grossas estresse seria observada.
  6. VE-caderina e α-SMA coloração
    1. Após 72 h de tratamento de TGF-β, remova a mídia, fixar as células com frio 50% de metanol e acetona 50% (0,5-1,0 mL por bem) por 5 min.
    2. Enxagúe as células três vezes com PBS 1x (0,5-1,0 mL por bem).
    3. Incube com anticorpos primários em tampão de bloqueio durante a noite a 4 ° C, no escuro de acordo com a concentração recomendada pelo fabricante. Use o anticorpo monoclonal de VE-caderina (BV13, diluição de 1: 100) e α-SMA Cy3-conjugado anticorpo monoclonal (1A4, diluição de 1: 200)20.
    4. Enxague as células três vezes com PBS 1x.
    5. Incube as células com um anticorpo secundário conjugada com corante verde para VE-caderina anticorpo em tampão de bloqueio por 1h à temperatura ambiente no escuro de acordo com a concentração recomendada pelo fabricante.
    6. Enxague as células três vezes com PBS 1x.
    7. Mancha os núcleos com corantes de ligação de ácido nucleico cianina durante 5 min à temperatura ambiente.
    8. Slides de enxaguamento e monte lamelas viradas para baixo em um slide usando o slide meios de montagem.
    9. Observe com um microscópio confocal. Use um laser de 543 nm e um filtro de emissão de 560 – 615 nm para a deteção de α-SMA (Cy3). Use um laser de 488 nm e um filtro de emissão de 505 – 550 nm para a deteção de VE-caderina. Normalmente, após tratamento com tratamento de TGF-β, diminuição de sinais VE caderina e aumento do α-SMA sinais seria observado.

3. ensaio de contração de Gel de colágeno tridimensional

  1. Realize cultura de células de MS-1, com ou sem o TGF-β para 72 h antes do ensaio de contração de gel de colágeno.
  2. Preparar o tipo eu gel de colágeno no gelo. Misturar a solução de colágeno frio, 10x concentrado MEM médio e tampão de diluição de colágeno contendo 0,05 N NaOH, 2,2% NaHCO3e 200 mM HEPES pH 7,4 em um 8:1:1 relação.
  3. Misture 200 mL de controle ou suspensões de células endoteliais TGF-β-tratada (1.0 x 106 células/200 μL) e 800 μl da solução de gel de colágeno. Para TGF-β amostras tratadas, adicionar TGF-β2 (1 ng/mL) para a suspensão de eritrócitos.
  4. Adicionar 1,0 mL da mistura a cada poço das placas de cultura 12-poços e deixar para solidificar na incubadora a 37 ° C por 30 a 60 min.
  5. Após a gelatinização, sobreposição de 1,0 mL de MEM-α contendo 10% FCS, 50 U/mL penicilina e estreptomicina 50 μg/mL para flutuar o gel. Para TGF-β amostras tratadas, adicionar TGF-β2 (1 ng/mL) para a mídia.
    Nota: Para amostras tratada de TGF-β, adicione TGF-β para o gel e a meios de cultura.
  6. Incube os géis flutuantes a 37 ° C por 48 h.
  7. Digitalizar as imagens de géis de fundo das placas usando um scanner. Alternativamente, grave as imagens de géis usando uma câmera digital em uma distância fixa acima os géis.
  8. Quantificar a área de superfície de gel com base no número de pixel usando o ImageJ. Seleccione o gel usando uma seleção à mão livre ou ferramentas de seleção relacionados ou usando o gel "imagem | Ajustar | Limiar de cor"da ferramenta e em seguida, determinar a área do uso de gel" Analyze | Comando de medida".

4. inibição de miRNA atividades por miRNA trancada do ácido nucleico-baseado inibidores

  1. Manter as células de MS-1 em condições de cultura padrão.
  2. Transfect miRNA inibidores trancado ácido nucleico (LNA), miRNA sintético duplex ou siRNAs (20 ou 50 nM) usando reagentes lipofection de acordo com as instruções do fabricante. Detalhes e fontes de LNA miRNA inibidores sintéticos miRNA duplex e siRNAs foram descritas em nossos anteriores relatórios26,27. Nas células do MS-1, procedimentos padrão de transfeccao baseados as instruções do fabricante funcionam bem para a introdução dos inibidores de miRNA LNA, miRNA sintético duplex ou siRNAs.
  3. Após 16 – 48 h, estimulam as células endoteliais com TGF-β2 (uma concentração final de 1 ng/mL).
  4. Prossiga para várias análises a jusante, incluindo análise da expressão (RT-PCR quantitativo e análises sequenciação do ARN (RNA-seq)) RNA, immunocytochemical análise e ensaio de repórter. Análises a jusante têm sido descritas em nossos anteriores relatórios20,26,27.

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Resultados

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TGF-β é um potente indutor de EndMT em várias células endoteliais. Após o tratamento de 24 h com TGF-β nas células do MS-1, coloração para F-Actina mostra reorganização de actina stress fibras (figura 1A)20. Pré-tratamento com um inibidor ROCK Y-27632 inibe a indução de actina reorganização20. MS-1 células endoteliais alterar de uma morfologia de paralelepípedos, como a clássica para uma morfologia fusiforme mes...

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Discussão

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Tem sido relatado que ativado tratamento Ras e TGF-β para 24h induzida EndMT nas células do MS-1, enquanto o TGF-β sozinho falhou induzir a EndMT deste curto período,21. Consistentemente, observamos que TGF-β substancialmente induzida EndMT após o tratamento mais tempo (48-72 h) em MS-1 células20. EndMT tem sido repetidamente observado após tratamento prolongado com TGF-β (2-6 dias) em várias células endoteliais como umbilical humano veia células endoteliais (HUVEC), humana...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Agradecemos Zea Borok e Kohei Miyazono sugestões na preparação do manuscrito. H.I.S. e M.H. são compatíveis com o Uehara Memorial Foundation Research Fellowship, e H.I.S. é suportado pelo Osamu Hayaishi Memorial bolsa de estudo no exterior. Este trabalho foi financiado por um subsídio da Fundação de ciência Takeda (A.S.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
MS-1 célulasAmerican Type Culture CollectionCRL-2279
MEM-alphaThermo Fisher Scientific32571036
TGF-beta2R & D302-B2-002
4 poços Lab-Tek II Chamber SlideThermo Fisher Scientific154526
Y-27632 Sigma-AldrichY0503
Bloqueando umnacalai tesque03953-95
faloidina-tetrametilrodamina B isotiocianatoSigma-AldrichP1951
TOTO-3 iodetoThermo Fisher ScientificT3604
VE anticorpo monoclonal de caderina (BV13)Thermo Fisher Scientific14-1441-82
alfa-SMA Anticorpo monoclonal Cy3 (1A4)Sigma-AldrichC6198
Alexa Fluor 488 cabra anti-camundongo IgG (H + L)Thermo Fisher ScientificA-11001
LamínulaThermo Fisher Scientific174934
Solução de colágenoNitta gelatina Inc.Cellmatrix I-P
Nitta gelatina Inc.LNA I-P
EXIQON miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Controle Negativo B e miRNA alvo)
miRNA sintético duplexQiagen miScript miRNA Mimic
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778030
Lipofectamine 2000Thermo FisherScientific 11668027
Tampão de diluição de colágeno Inibidor de miRNA de da Cellmatrix

Referências

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  1. Sanchez-Duffhues, G., Garcia de Vinuesa, A., Ten Dijke, P. Endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases: Developmental signaling pathways gone awry. Developmental Dynamics. , (2017).
  2. Markwald, R. R., Fitzharris, T. P., Smith, W. N. Structural analysis of endocardial cytodifferentiation. Developmental Biology. 42 (1), 160-180 (1975).
  3. Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis. Circulation Research. 77 (1), 1-6 (1995).
  4. Chen, Q., et al. Endothelial cells are progenitors of cardiac pericytes and vascular smooth muscle cells. Nature Communications. 7, 12422(2016).
  5. DeRuiter, M. C., et al. Embryonic endothelial cells transdifferentiate into mesenchymal cells expressing smooth muscle actins in vivo and in vitro. Circulation Research. 80 (4), 444-451 (1997).
  6. Arciniegas, E., Neves, C. Y., Carrillo, L. M., Zambrano, E. A., Ramirez, R. Endothelial-mesenchymal transition occurs during embryonic pulmonary artery development. Endothelium. 12 (4), 193-200 (2005).
  7. Welch-Reardon, K. M., Wu, N., Hughes, C. C. A role for partial endothelial-mesenchymal transitions in angiogenesis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (2), 303-308 (2015).
  8. Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
  9. Chen, P. Y., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition drives atherosclerosis progression. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4514-4528 (2015).
  10. Bostrom, K. I., Yao, J., Guihard, P. J., Blazquez-Medela, A. M., Yao, Y. Endothelial-mesenchymal transition in atherosclerotic lesion calcification. Atherosclerosis. , 124-127 (2016).
  11. Qiao, L., et al. Endothelial fate mapping in mice with pulmonary hypertension. Circulation. 129 (6), 692-703 (2014).
  12. Ranchoux, B., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition in pulmonary hypertension. Circulation. 131 (11), 1006-1018 (2015).
  13. Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
  14. Krenning, G., Zeisberg, E. M., Kalluri, R. The origin of fibroblasts and mechanism of cardiac fibrosis. Journal of Cell Physiology. 225 (3), 631-637 (2010).
  15. Cooley, B. C., et al. TGF-beta signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling. Science Translational Medicine. 6 (227), 227ra234(2014).
  16. Wang, Z., et al. Transforming Growth Factor-beta1 Induces Endothelial-to-Mesenchymal Transition via Akt Signaling Pathway in Renal Transplant Recipients with Chronic Allograft Dysfunction. Annals of Transplantation. 21, 775-783 (2016).
  17. Xu-Dubois, Y. C., et al. Markers of Endothelial-to-Mesenchymal Transition: Evidence for Antibody-Endothelium Interaction during Antibody-Mediated Rejection in Kidney Recipients. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (1), 324-332 (2016).
  18. Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts. Cancer Research. 67 (21), 10123-10128 (2007).
  19. Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., Gomez-Puerto, M. C., Ten Dijke, P. TGF-beta-Induced Endothelial-Mesenchymal Transition in Fibrotic Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).
  20. Mihira, H., et al. TGF-beta-induced mesenchymal transition of MS-1 endothelial cells requires Smad-dependent cooperative activation of Rho signals and MRTF-A. Journal of Biochemistry. 151 (2), 145-156 (2012).
  21. Hashimoto, N., et al. Endothelial-mesenchymal transition in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 43 (2), 161-172 (2010).
  22. Suzuki, H. I., Miyazono, K. Dynamics of microRNA biogenesis: crosstalk between p53 network and microRNA processing pathway. Journal of Molecular Medicine (Berl). 88 (11), 1085-1094 (2010).
  23. Suzuki, H. I., Miyazono, K. Emerging complexity of microRNA generation cascades. Journal of Biochemistry. 149 (1), 15-25 (2011).
  24. Nicoloso, M. S., Spizzo, R., Shimizu, M., Rossi, S., Calin, G. A. MicroRNAs--the micro steering wheel of tumour metastases. Nature Reviews Cancer. 9 (4), 293-302 (2009).
  25. Lagendijk, A. K., Goumans, M. J., Burkhard, S. B., Bakkers, J. MicroRNA-23 restricts cardiac valve formation by inhibiting Has2 and extracellular hyaluronic acid production. Circulation Research. 109 (6), 649-657 (2011).
  26. Katsura, A., et al. MicroRNA-31 is a positive modulator of endothelial-mesenchymal transition and associated secretory phenotype induced by TGF-beta. Genes Cells. 21 (1), 99-116 (2016).
  27. Suzuki, H. I., et al. Regulation of TGF-beta-mediated endothelial-mesenchymal transition by microRNA-27. Journal of Biochemistry. 161 (5), 417-420 (2017).
  28. Camenisch, T. D., et al. Temporal and distinct TGFbeta ligand requirements during mouse and avian endocardial cushion morphogenesis. Developmental Biology. 248 (1), 170-181 (2002).
  29. Krenning, G., Moonen, J. R., van Luyn, M. J., Harmsen, M. C. Vascular smooth muscle cells for use in vascular tissue engineering obtained by endothelial-to-mesenchymal transdifferentiation (EnMT) on collagen matrices. Biomaterials. 29 (27), 3703-3711 (2008).
  30. Medici, D., Potenta, S., Kalluri, R. Transforming growth factor-beta2 promotes Snail-mediated endothelial-mesenchymal transition through convergence of Smad-dependent and Smad-independent signalling. Biochemical Journal. 437 (3), 515-520 (2011).
  31. Krizbai, I. A., et al. Endothelial-mesenchymal transition of brain endothelial cells: possible role during metastatic extravasation. PLoS One. 10 (3), e0119655(2015).
  32. Arciniegas, E., Sutton, A. B., Allen, T. D., Schor, A. M. Transforming growth factor beta 1 promotes the differentiation of endothelial cells into smooth muscle-like cells in vitro. Journal of Cell Science. 103 (Pt 2), 521-529 (1992).
  33. Deissler, H., Deissler, H., Lang, G. K., Lang, G. E. TGFbeta induces transdifferentiation of iBREC to alphaSMA-expressing cells. International Journal of Molecular Medicine. 18 (4), 577-582 (2006).
  34. Paranya, G., et al. Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro. American Journal of Pathology. 159 (4), 1335-1343 (2001).
  35. Maleszewska, M., et al. IL-1beta and TGFbeta2 synergistically induce endothelial to mesenchymal transition in an NFkappaB-dependent manner. Immunobiology. 218 (4), 443-454 (2013).
  36. Ubil, E., et al. Mesenchymal-endothelial transition contributes to cardiac neovascularization. Nature. 514 (7524), 585-590 (2014).
  37. Xu, X., et al. Epigenetic balance of aberrant Rasal1 promoter methylation and hydroxymethylation regulates cardiac fibrosis. Cardiovasc Research. 105 (3), 279-291 (2015).
  38. Xiao, L., et al. Tumor Endothelial Cells with Distinct Patterns of TGFbeta-Driven Endothelial-to-Mesenchymal Transition. Cancer Research. 75 (7), 1244-1254 (2015).

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