Injeções de lipopolissacarídeo em camundongos para imitar a entrada de produtos de origem microbiana após a quebra da barreira Intestinal

O intestino humano é colonizado com um grande consórcio de microorganismos que formam a microbiota, que desenvolveu um relacionamento mutuamente benéfico com o host durante a evolução. Nesta relação, o host fornece um nicho seguro para a microbiota, Considerando que a microbiota fornece vitaminas, digestão de nutrientes e proteção contra agentes patogénicos para o host, a microbiota reside¹. Quando este relacionamento benéfico entre o host e a microbiota é perturbado, podem desenvolver doenças, tais como a doença inflamatória intestinal (IBD). IBD é uma doença inflamatória crônica multifatorial do intestino causada por fatores genéticos e ambientais que ocorrem em duas formas principais, (CD) de doença de Crohn e colite ulcerativa (UC). Apesar das semelhanças entre as duas formas de DII, caracterizam-se por certas diferenças na localização e natureza das modificações inflamatórias. CD é uma desordem inflamatória recidivante de transmural que potencialmente pode se estender a qualquer parte do tracto gastrointestinal, enquanto UC é não-transmural e é restrito para o cólon. Além disso, mutações no nucleotídeo oligomerização domínio-contendo proteína de ligação 2 (NOD2), um receptor de reconhecimento de padrão (PRR) que reconhece muramyl dipeptídeo (MDP), um componente da parede celular de bactérias gram-positivas mais - negativas, é associados ao CD². Além disso, seus produtos, Listeria e estreptococos e Escherichia coli (e. coli)foram todos encontrados dentro de macrófagos em pacientes de CD que digitou o host depois que uma barreira romper³. Quando as bactérias ou seus produtos entram o hospedeiro durante o desenvolvimento do CD, o sistema imunológico desenvolve uma resposta levando à produção de anticorpos antibacteriano⁴de circulação. Talvez, a prova mais convincente para o papel da microbiota na patogênese da IBD decorre em modelos do rato. Quando os animais são tratados com antibióticos, ou quando os ratos são mantidos em condições de (GF) livre de germes, a severidade da doença é reduzida na maioria dos modelos de colite, tais como IL-10-/-ratos que não desenvolvem colite em GF instalações^5,6. Além disso, a colite também perturba a composição da microbiota, que é caracterizado por uma composição desequilibrada e reduziu a riqueza chamada disbiose⁷. A consequência do IBD pode ser um aumento da permeabilidade intestinal que pode levar a entrada de micróbios e produtos derivados microbiana no hospedeiro.

Em animais, a aplicação de dextrano sulfato de sódio (DSS) induz uma violação epitelial intestinal, levando a um aumento da permeabilidade da barreira epitelial⁸. Concentrações de LPS portal são elevadas em animais com DSS colite⁹. Curiosamente, animais faltando o C tipo lectina receptor específico adesão intracelular molécula 3 agarrando nonintegrin relacionados ao homólogo 1 (sinal-R1) são protegidos de colite DSS e endotoxemia induzida por LPS¹⁰. Para mais divulgação no hospedeiro, bactérias ou produtos derivados de bactérias têm de passar a barreira vascular¹¹, a cavidade peritoneal, onde se situam o intestino pequeno e grande porte, os linfonodos mesentéricos e/ou o fígado¹². Para reduzir a complexidade deste sistema, utilizou-se um composto derivado de bacteriano definido. LPS, que faz com que a endotoxemia depois intraperitoneal (i.p.) ou intravenosa (i.v.) injeção¹³ foi injetado em ratos, para estudar a expressão das interleucinas Il6 e IIB e as citocinas Tnfa em resposta a LPS.

LPS é um patógeno associado molecular padrão (PAMP) expresso como um componente da parede celular de bactérias Gram-negativas, que consiste de lipídios A (a principal PAMP na estrutura dos LPS), um oligossacarídeo de núcleo e um O lado da cadeia¹⁴. Receptor tipo toll 4 (TLR4) expressado por células dendríticas, macrófagos e células epiteliais reconhece LPS¹⁵, que requer co-receptores para ligação apropriada. A fase aguda da proteína LPS-proteína (LBP) vincula LPS para formar um complexo que transfere LPS para o cluster de diferenciação 14 (CD14), uma proteína de membrana glicosilfostidilinosiol-ancorado. CD14 mais shuttles LPS de antígeno de linfócitos 96 ou também conhecido como MD-2, que está associada com o domínio extracelular de TLR4. A vinculação dos LPS para MD-2 facilita a dimerização do TLR4/MD-2 para induzir mudanças conformacionais moléculas intracelulares adaptador para ativar a jusante sinalização via¹⁴, que inclui a diferenciação mieloide primária de recrutar gene de resposta 88 (MyD88) - via dependente e a TIR domínio-contendo adaptador de indução interferon-β (TRIF) - dependente da via¹⁶. O reconhecimento de LPS por TLR4 então ativa da via do NF-κB e induz a expressão de cytokines proinflammatory, como TNFa, IL-6 e IL-1 β¹⁷.

Em particular, quando LPS é injetado em animais, a concentração de LPS dado aos animais, o fundo genético do animal e a dieta tem de ser considerada. Altas concentrações de LPS leva a um choque séptico, caracterizado por hipotensão e várias falhas do órgão e finalmente a morte¹⁸. Ratos são menos sensíveis à LPS em comparação com os humanos, onde as concentrações de LPS entre 2-4 ng/kg de peso corporal (BW) são capazes de induzir uma tempestade de citocinas¹⁹. Para os ratos, a dose letal (DL50), que induz a morte em metade do varia de 10-25 mg/kg BW²⁰ dependendo da estirpe de rato usado ratos. Para as cepas de rato comumente usados, C57Bl/6 e BALB/c, a dose letal 50% (DL50) é de 10 mg/kg BW. Em contraste, as estirpes C3H/HeJ e C57BL/10ScCr são protegidas de endotoxemia LPS induzidos, que é devido a mutações no Tlr4²¹. Consequentemente, ratos Tlr4-deficientes são hiporeactividade para injeções com LPS²². Outras linhas de rato geneticamente modificado, como PARP1-/-ratos²³ são resistentes ao choque tóxico induzida por LPS.

O modelo do mouse descrito aqui usa uma dose subletais de LPS administrado sistemicamente para imitar as consequências da divulgação de LPS, após uma quebra de barreira das superfícies do corpo. A concentração de LPS escolhida (2 mg/kg BW) não induzir a mortalidade em ratos C56Bl/6, mas a liberação induzida de citocinas pró-inflamatórias.

Os ratos foram criados e mantidos sob isentos de agentes patogénicos (SPF) condições específicas na instalação de animal do departamento de Biomedicina, Universidade de Basileia (Basileia, Suíça). Todos os experimentos de rato foram realizados em conformidade com o suíço Federal e regulamentos cantonais (número de protocolo animal 2816 [Cantão de Basileia-cidade]).

1. preparação da solução de LPS

1. Abra o estoque de LPS purificados de Escherichia coli 0111:B4 sob condições estéreis e reconstitui-lo em água na concentração de 5 mg/mL.
2. Dilua o estoque de LPS com a solução salina estéril tamponada de fosfato (PBS) para a concentração de trabalho de 0,2 µ g / µ l.

2. intraperitoneal injeção de LPS para ratos

1. Aspire as solução de trabalho em uma seringa de 0,5 mL com agulha 30 G em um fluxo de ar laminar LPS.
2. Pesar de camundongos C57Bl/6 fêmeas (seis a 10 semanas de idade) e calcular a quantidade de LPS que será injetado: 10 µ l (2 µ g) / g de peso corporal.
   Nota: por exemplo, se um rato pesa 20 g e, em seguida, 20 g x 10 µ l = 200 µ l LPS, trabalhando a solução precisa ser injetado.
3. Manipular o mouse suavemente mas com firmeza e conter o animal em uma mão. Certifique-se de que o animal é capaz de respirar normalmente, mas não torcer e virar durante a contenção.
4. Incline o rato nariz ligeiramente para o assoalho para expor o abdome para injeção. Localize a linha média do abdômen e o local de injeção no baixo abdômen esquerda ou direita da linha média. Injete i.p. PBS em vez de LPS em ratos controle.
5. Com a mão livre, injetar o volume apropriado (o volume calculado no passo 2.2) dos LPS solução de trabalho. Certifique-se que a agulha entrou na cavidade peritoneal em contrário, mis injeções na camada muscular abdominal podem ocorrer. Ainda, não vá muito fundo com a agulha na cavidade peritoneal para evitar ferir os órgãos internos localizados nessa área.
6. Retorne cuidadosamente o animal da gaiola com até 5 ratos por gaiola.

3. monitorar os ratos

1. Monitore os animais no momento da injeção e a cada 2 h após a injeção de 8 h para a ocorrência e severidade de endotoxemia. Portanto, use uma folha de Pontuação (tabela 1), que foi adaptada de um manuscrito publicado anteriormente ²⁴.
2. Marcar os ratos injetados LPS para os seguintes parâmetros listados na tabela 1
   1. Verifique a aparência da pele que é normalmente liso. Se a pele parece pele babado, espetado ou inchado que indica desconforto e/ou dor, marca-lhes como 1, 2 ou 3.
   2. Verifique se a atividade do mouse.
      Nota: Os ratos normalmente mover-se livremente ao redor da gaiola toda comendo, bebendo, escalada, mas atividade suprimida ou restrita pode ser um sinal de dor.
   3. Verifique o nível de consciência.
      Nota: Os ratos são muito curiosos, e movem-se normalmente ao redor da gaiola, investigando os arredores. Falta de ou movimento reduzido pode sugerir dor e desconforto.
   4. Verifica os olhos.
      Nota: Os olhos totalmente abertos são esperados em ratos saudáveis, mas os olhos total ou parcialmente fechados, possivelmente com secreção, podem ser uma indicação de dor.
   5. Verifique a taxa de respiração.
      Nota: Os ratos saudáveis geralmente têm uma taxa de respiração normal e rápida, uma taxa de respiração reduzida poderia ser uma indicação de desconforto).
   6. Verifique a qualidade da respiração.
      Nota: Respiração difícil, com ou sem ofegar é um sinal de dor.

4. tecido amostragem para extração de ácido ribonucleico (RNA) e homogeneização

1. Preparar os tubos de coleta/homogeneização: reagente de isolamento de RNA adicionar 1 mL passo a passo para tubos de 2 mL preenchido com esferas de cerâmica de 1,4 mm.
2. Nos pontos de tempo apropriado (antes (0 h) e 2 h, 4 h e 8 h após a injeção de LPS) eutanásia o mouse com overdose de anestésico (isoflurano) seguido de sangria e proceder com a dissecação.
3. Corte a pele e a camada muscular, expondo a cavidade abdominal com os órgãos internos com uma tesoura.
4. Dissecar o baço, fígado e cólon, limpe cuidadosamente os órgãos da gordura e mantê-los em PBS no gelo.
5. Corte um pedaço pequeno (cerca de 0,5 cm de comprimento) de cada órgão usando tesoura ou bisturi.
   Nota: É importante ter sempre a peça de aproximadamente a mesma parte do órgão em cada rato (mesmo lóbulo do fígado, proximal ou distal parte do cólon).
6. Em breve secar o tecido em um pedaço de tecido de papel e coloque-o no tubo de coleta/homogeneização, certificando-se de que ele está completamente imerso no reagente de isolamento de RNA.
7. Homogeneizar o tecido em um homogeneizador de bancada de alta velocidade. Para tecidos moles, como baço, fígado e cólon usam 1 ciclo de homogeneização a velocidade 6,00 por 30 s.
8. Incube as amostras por 5 min à temperatura ambiente.
9. Cuidadosamente coloque o tubo no nitrogênio líquido para congelar o tecido lisado. Armazene o snap congelado lisado a-80 ° C até o isolamento de RNA.

5. RNA extraído de tecido

Nota: RNA reagentes de isolamento, clorofórmio e álcoois são considerados como material perigoso. Realize a extração do RNA sob uma capa de química. Use o certificado livre de RNase reagentes e equipamentos para manter um ambiente livre de RNase.

1. Separação de fases
   1. Descongele o lisado de tecido congelado no gelo.
   2. Centrifugar a amostra em 1.000 x g por 5 min a 4 ° C para as restantes partículas de tecido que podem ser deixadas de Pelotas.
   3. Transferi o sobrenadante para um novo tubo isento de nuclease 1,5 mL.
   4. Adicionar clorofórmio gelada da 200 µ l por isolamento 1ml RNA reagente e agitar vigorosamente à mão para 10-15 s.
   5. Incube durante 2-3 min à temperatura ambiente.
   6. Centrífuga em 12, 000 x g durante 15 minutos a 4 ° C.
      Nota: A amostra conterá agora 3 fases: diminuir a fase de vermelho de fenol-clorofórmio, a interfase e a fase aquosa incolor superior. O RNA está presente na fase aquosa superior.
   7. Recolha a fase aquosa superior (50% do volume total) e a transferência em um novo tubo isento de nuclease 1,5 mL.
2. Precipitação do RNA
   1. Adicionar 0,5 mL isopropanol gelado por 1 mL de reagente de isolamento do RNA e misture suavemente por inversão do tubo 5 - 6 vezes.
   2. Incube durante 10-15 min à temperatura ambiente.
   3. Centrifugar a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C.
      Nota: Pelota do RNA deve ser visível nesta fase.
3. Lavagem de pelota do RNA
   1. Remova completamente o sobrenadante contendo o isopropanol sem perturbar o sedimento.
   2. Lave o sedimento com 1 mL gelada de 75% de etanol, por 1 mL reagente de isolamento de RNA usado para a Lise inicial.
   3. Vórtice da amostra brevemente.
   4. Centrifugar a amostra a 7.500 (ou 12.000) x g por 5 min a 4 ° C.
4. Dissolução do RNA
   1. Remova completamente o etanol no sobrenadante sem perturbar o sedimento.
   2. Deixar o tubo aberto sob o capô químico para 3-5 min secar ao ar livre a pelota do RNA em temperatura ambiente (não demasiado seco como nesse caso será difícil de dissolver o RNA).
   3. Dissolva a pelota do RNA em água livre de nuclease do 20-50 µ l pipetando cuidadosamente acima e para baixo.
   4. Incube a amostra a 55 ° C, durante 10-15 min melhorar ainda mais a solução do RNA.
      Nota: Nesta fase, RNA pode ser armazenado a-80 ° C até posterior análise.

6. digestão de DNA restante

1. Medir a concentração de RNA com um espectrofotômetro pipetando igualmente uma alíquota (2 µ l) para o espectrofotômetro e ajustar-se a concentração recomendada.
2. Inicie a digestão de contaminar o DNA com o max. 10 µ g RNA em água de nuclease livre 50 µ l.
3. Adicione 0,1 volume de 10 x DNase eu Buffer e 1 µ l rDNase eu por amostra e misture suavemente pipetando cima e para baixo.
4. Incube a 37 ° C por 20-30 min.
5. Reagente de inactivação do vórtice DNase e adicionar volume 0,1 à amostra misturando bem com a pipeta.
6. Incube durante 5 min à temperatura ambiente misturando ocasionalmente pela mão.
7. Centrifugar a 10.000 x g, durante 1,5 min.
8. Transferi o sobrenadante contendo RNA DNA livre no tubo nuclease-livre de novo.
9. Medir a concentração de RNA e qualidade por Espectrofotômetro.

7. reversa transcrição

1. Use um kit de transcrição reversa (RT) comercialmente disponíveis ácido desoxirribonucleico cDNA por transcrição reversa.
   Nota: Aqui, até 2 µ g de RNA pode ser revertido transcrito.
2. Calcule o volume, que contém 2 µ g de RNA. Pipete 2 µ g do RNA em um novo tubo PCR.
3. Adicione água nuclease-livre para a amostra no tubo para o volume final de 10 µ l de PCR.
4. Prepare 2 x Master Mix, misturando os seguintes componentes listado na tabela 2
5. Adicione 10 µ l 2 x Master Mix de 10 µ l de RNA para obter 1 x Master Mix no volume total de 20 µ l.
6. Feche o tubo de reação em cadeia (PCR) de polimerase e spin-down a amostra brevemente.
7. Colocar as amostras em uma PCR Thermocycler e definir as configurações listadas na tabela 3.
8. Armazene o cDNA gerado a-20 ° C para posterior análise.

8. quantitativo PCR (qPCR)

1. Realize a reação de qPCR com um kit disponível comercialmente.
2. Autoprojete e testar os primers intrão-abrangendo, antes do uso, com diferentes concentrações de cDNA de modelo. Analisar a eficácia da primeira demão, criando uma curva padrão e usar os primers com eficácia elevada e as curvas de fusão corretas.
   Nota: As sequências dos primers utilizados neste experimento estão listadas na tabela 2.
3. Prepare o quantitativo polimerase de reação em cadeia (qPCR) em 384 a placa com a configuração de reação descrita na tabela 4.
4. Mantenha todas as soluções e a placa no gelo usando papel alumínio para evitar que a placa ficar molhada quando a mistura reacional é preparada.
5. Execute todas as reações em triplica.
6. Realize a reação de PCR em um thermocycler usando a configuração listada na tabela 5.
7. Calcule o valor médio do Ct para todas as reações do triplica. Normalizar todos os genes-alvo para o nível de expressão de glycerinealdehyde-3-fosfato-desidrogenase (Gapdh) gene das tarefas domésticas, calculando-se 2^(-ΔCt).
   Nota: Todos os genes-alvo com o Ct médio > 35 eram consideradas sob o limite de detecção.

Para imitar as consequências para o host após a entrada de bactérias ou produtos derivados de bactérias, que ocorre após a quebra da barreira intestinal, LPS foi injetado em camundongos C57Bl/6, em doses subletais (2 µ g/g de massa corporal). Cada único rato foi monitorado e marcou para a ocorrência de endotoxemia com parâmetros listados na folha de pontuação que inclui, a aparência dos ratos, a atividade dos animais, a condição dos olhos e a taxa de respiração e qualidade (tabela 1) . Os animais apresentaram sinais clínicos de doença que atingiu o pico de 6 a 10 h após a injeção de LPS e recuperado dentro de 24 h (Figura 1). Individuais camundongos foram sacrificado 2h, 4h e 8h após a injeção de LPS. Pedaços de tecido foram coletados de cólon, fígado e baço. RNA foi isolado por estes órgãos e reverso transcrito de cDNA. O cDNA foi usado como um modelo para qPCR para determinar os níveis de expressão de Il6 (Figura 2A), Il1b (Figura 2B), TNFa (Figura 2) e Il10 (Figura 2D) com primers utilizados para o qPCR descritas na tabela 6. A expressão de Il6 atingiu 2 h após a injeção no baço e cólon e 4h após a injeção no fígado. A expressão de Il1b, TNFa e Il10 pico 4h após a injeção no baço, fígado e cólon. Dentro de 8 h após a injeção, a expressão de Il6, Il1b, TNFa e Il10 retornado aos níveis de base.

Figura 1: injeção de LPS (2 µ g/g de massa corporal) induzida por sinais clínicos de endotoxemia em C57Bl/6mice. Após a injeção de 2 µ g/g de massa corporal de LPS, ratos individuais foram monitorados com o placar de doença apresentado na tabela 1 que inclui a aparência e a atividade dos animais, abrindo seus olhos e sua taxa de respiração e qualidade cada 2h para 12h e 24h na popa er injeção de LPS. O resultado de doença (eixo y) foi eliminado para o respectivo tempo (eixo x). Média ± SD para 4-5 ratos por cada ponto de tempo é apresentado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: injeção de LPS (2 µ g/g de massa corporal) induz a expressão de citocinas pró-inflamatórias em camundongos C57Bl/6. Os ratos foram injetados com 2 µ g/g de massa corporal de LPS e os níveis de expressão de Il6 (A), Il1b (B), Tnfa (C) e Il10 (D) foram analisados por qPCR no baço, fígado e cólon na hora indicada pontos após a injeção. Níveis de expressão de citocinas foram todos normalizados para a expressão de Gapdh. Média ± SD para 4-5 ratos por cada ponto de tempo é mostrado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: folha de Pontuação doença para monitorar camundongos C57Bl/6 após injeção de LPS. Parâmetros monitorados após a injeção de LPS. Animais foram monitorados a cada 2 h após a injeção, por um período de 12 h, e pontuações foram dadas para cada parâmetro individual listado na tabela. O resultado final para cada animal representa a soma de todas as pontuações individuais. Isto é uma adaptação de referência24. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela 2: Reagentes utilizados para preparar a mistura de mestre a transcrição reversa.

Tabela 3: Thermocycler configurações usadas para a transcrição reversa.

Tabela 4: Descrição da reação de PCR.

Tabela 5: Thermocycler configurações usadas para PCR.

Tabela 6: Primers usados na reação de qPCR. A sequência de primers utilizados para qPCR para detectar rato citocinas e gene de limpeza Gapdh.

Os autores não têm nada para divulgar.