Artigo de método

Ultralow genoma entrada biblioteca preparação de um único espécime Tardigrade de sequenciamento

DOI:

10.3791/57615

⸱

15 de julho de 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Advanced Biosciences, Keio University, 2Systems Biology Program, Graduate School of Media and Governance, Keio University, 3Faculty of Environment and Information Studies, Keio University

Neste artigo

Resumo

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Contaminação durante o sequenciamento de genoma de organismos microscópicos continua a ser um grande problema. Aqui, nós mostramos um método para sequenciar o genoma de um Tardigrada de um único espécime com tão pouco quanto 50 pg de DNA genômico sem amplificação do genoma inteiro para minimizar o risco de contaminação.

Resumo

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Tardigrades são animais microscópicos que entram em um estado de ametabólico chamado anidrobiose quando enfrenta a dessecação e pode retorna ao seu estado original, quando a água é fornecida. O sequenciamento genômico de animais microscópicos, como tardigrades riscos contaminação bacteriana que às vezes leva a interpretações errôneas, por exemplo, sobre a extensão da transferência horizontal de genes nestes animais. Aqui, nós fornecemos um método de entrada ultralow para sequenciar o genoma da Tardigrada, Hypsibius dujardini, de um único espécime. Empregando a rigorosa exclusão de lavagem e contaminantes juntamente com uma extração eficiente dos 50 ~ 200 pg DNA genômico de um único indivíduo, nós construímos uma biblioteca sequenciada com um instrumento de sequenciamento de DNA. Essas bibliotecas foram altamente reprodutível e imparcial, e uma análise informática das leituras sequenciais com outras genomas de H. dujardini mostrou uma quantidade mínima de contaminação. Esse método pode ser aplicado a tardigrades unculturable que não podem ser sequenciados usando métodos anteriores.

Introdução

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Tardigrades são animais microscópicos que podem entrar em um estado de ametabólico chamado anidrobiose, quando enfrenta a dessecação. Eles recuperar pela absorção de água,1,2. No estado ametabólico, tardigrades são capazes de tolerar vários ambientes extremos, incluindo temperaturas extremas pressões e3 4,5, uma dose elevada de luz ultravioleta6, raios-x e raios gama 7 , 8e o espaço cósmico9. Dados genomic são uma base indispensável para o estudo dos mecanismos moleculares de anidrobiose.

Tentativas anteriores para sequenciar o genoma de tardigrades mostraram sinais de contaminação bacteriana10,11,12,13,14. Sequenciamento genômico de tais organismos pequenos requer um grande número de animais e é propenso a contaminação bacteriana; Portanto, temos anteriormente estabelecido um protocolo de sequenciamento, usando um método de entrada ultralow a partir de um único espécime de Tardigrada, para minimizar o risco de contaminações15. Usando esses dados, temos mais realizado uma alta qualidade resequencing e remontagem do genoma de H. dujardini16,17. Aqui descrevemos detalhadamente este método para sequenciamento genômico de um único indivíduo tardigrade (,Figura 1). A validação deste método de sequenciamento é além do foco deste trabalho e já foi exaustivamente discutida no nosso anterior relatório16.

Esse método é composto de duas partes: o isolamento de um único Tardigrada com o mais baixo possível contaminação e a extração de alta qualidade de níveis de pictograma de DNA. A Tardigrada é fome completamente enxaguada com água, bem como antibióticos e observada sob um microscópio com ampliação de 500 X para garantir a remoção de qualquer contaminação bacteriana. Medições e estimativas anteriores mostram que um único indivíduo de Tardigrada contém aproximadamente 50-200 pg de genomic DNA16, que é extraído por rachando o exoesqueleto de quitina, por ciclos de gelo-degelo ou homogeneização manual. Este DNA genômico é enviado para a construção da biblioteca e sequenciado em um instrumento de sequenciamento de DNA. Uma análise adicional informática mostra sequenciamento de alta qualidade, bem como baixos níveis de contaminação em comparação com projetos de sequenciamento tardigrade anterior.

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Protocolo

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1. preparação

  1. Prepare o gel de agarose 2% usando água destilada (DW) como solvente em um prato de cultura plástico 90 mm e 10 mL de um cocktail com DW 1% penicilina/estreptomicina. O gel pode ser armazenado por 2-3 semanas na incubadora, situado a 18 ° C.
    Nota: Evite qualquer armazenamento do gel abaixo de 10 ° C, para a baixa temperatura vai encolher o gel de agarose, resultando em uma minúscula abertura entre o gel e a parede do prato de cultura em que o tardigrades podem ser preso.

2. exclusão de contaminantes e preparação da amostra

  1. Coletar uma única Tardigrada, colocá-lo na placa de ágar preparado e lavá-lo 2x - 3x com DW para remover quaisquer partículas restantes.
  2. Incube a Tardigrada 18-22 ° c por 24 h para remover qualquer excesso de comida do intestino.
  3. Coloque a Tardigrada faminta em antibióticos penicilina/estreptomicina para 2-6 h remover qualquer contaminação bacteriana e coloque o animal descontaminado em um vidro limpo slide usando uma pipeta de P10.
  4. Observar a Tardigrada sob um microscópio ampliação de 500 X e confirmar que não há nenhuma bactéria restantes.
    Nota: A ampliação elevada com um estereomicroscópio é ideal, mas um microscópio óptico pode ser utilizado como alternativa sem aplicar uma lamela.
  5. Recolher o indivíduo usando uma pipeta P10 com um máximo de 5 µ l de líquido, coloque-o em um tubo de reação em cadeia (PCR) baixo-vinculação do polymerase e remover como muito excesso de líquido possível.
    Nota: Os microtubos, tubos PCR e pontas de pipetas devem todos ser baixa ligação para minimizar a perda de DNA.
    Nota: Realizar uma homogeneização mais rapidamente possível, para a dessecação rápida ou a morte do animal significativamente pode danificar o DNA genômico.

3. homogeneização e extração de DNA

  1. Homogeneizar o animal para obter seu DNA genômico (gDNA) com um dos seguintes métodos.
    Nota: É fundamental para o uso do kit especificado mostrado na Tabela de materiais nas etapas de extração de DNA a seguir, outros kits (coluna e grânulo baseado) não são eficazes na entrada extremamente baixa. O genoma do lysis foi fornecido com 0,5% beta-Mercaptoetanol antes de usar.
    1. Homogeneizar o animal com ciclos de congelamento e descongelamento18.
      1. Imediatamente após a etapa 2.5, adicionar 100 µ l de tampão de Lise para o tubo PCR contendo a Tardigrada.
      2. Coloque o tubo de PCR em nitrogênio líquido por 10 minutos e, durante 10 min, movê-lo para um bloco de calor aquecido a 37 ° C. Repita este passo 2x.
        Nota: Este passo pode ser repetido quando a homogeneização não é suficiente, ou pode ser realizada após o esmagamento do manual.
    2. Manualmente esmaga o animal.
      1. Imediatamente a seguir passo 2.5, sob um estereomicroscópio, esmagar o indivíduo com a P10 ponta da pipeta, pressionando o animal contra a parede do tubo PCR e imediatamente adicionar 100 µ l de tampão de Lise.
        Nota: É fundamental observar esse procedimento sob um estereomicroscópio, porque a Tardigrada pode facilmente escorregar, e esmagando ineficiente resultará em uma falha ao extrair gDNA. Certifique-se que a cutícula tardigrade é quebrada para que o tampão de Lise pode infiltrar-se no organismo.
  2. Incube o tubo durante 30 min à temperatura ambiente para lise ocorrer.
    Nota: Um mínimo de 30 min é necessário para uma eficiente Lise, mas a incubação pode ser mais longa.
  3. Transferi o volume total (100 µ l) da mistura de Lise para um microtubo de ligação de baixa limpa 1,5 mL.
  4. Adicionar 100 µ l de tampão de Lise para o tubo PCR de baixo-ligação que foi usado para a homogeneização e agora está vazio e depois de pipetagem a mistura, transferi-lo para o microtubo de 1,5 mL ligação de baixa usado na etapa 3.3. Repita este passo 2x.
  5. Como no passo 3.4, adicionar 300 µ l de tampão de Lise para o tubo do PCR de baixo-ligação, e, depois de pipetagem, mover a mistura para o microtubo de ligação de baixa 1,5 mL. Microtubo de 1,5 mL ligação de baixa deve conter 600 µ l da mistura após esta etapa.
    Nota: Estes passos são minimizar a perda de gDNA vinculado a parede do tubo PCR, a lavagem da amostra várias vezes.
  6. Adicionar o total de 600 µ l da mistura de Lise para a coluna de rotação colocada em um tubo de coleta e centrifuga-lo a 10.000 x g por 1 min.
  7. Re-aplicar o fluxo através da coluna e centrifuga-lo a 10.000 x g por 1 min.
    Nota: Este passo é fundamental para garantir que a maior parte do gDNA é associada à coluna.
  8. Adicionar 500 µ l de tampão de lavagem para a coluna de rotação e centrifuga-lo a 10.000 x g por 1 min. transferência a coluna de rotação para um microtubo de 1,5 mL limpa.
  9. Aplicar 20 µ l de 10 mM Tris-HCl, pH 8.5, para a coluna de rotação, espere por 5 min à temperatura ambiente e centrifugue a 10.000 x g por 1 min.
    Nota: O tampão de eluição não deve conter EDTA, pois ela interfere com as enzimas de preparação de biblioteca.
  10. Re-aplicar o fluxo através da coluna de rotação e depois de 5 min de incubação à temperatura ambiente, centrifugue-lo por 1 min a 10.000 x g.
    Nota: Este passo é fundamental para garantir a máxima eluição do gDNA associada à coluna.

4. sequência de construção biblioteca

  1. Fragmentação de DNA
    1. Transferir 15 µ l do eluente gDNA para um microtubo de 15 µ l para a fragmentação de DNA e centrifugar o tubo por 1 min usando microcentrifuga do tabletop.
      Nota: O microtubo especificado mostrado na Tabela de materiais é ideal para uma entrada baixa. A fragmentação com baixo volume sonication é crítica, e isso não pode ser substituído com fragmentação enzimática por causa da concentração extremamente baixa de DNA.
    2. Fragmentar o gDNA a 550 bp.
      Nota: As configurações de bp 550 usamos são as seguintes: pico de potência incidente = 30 W, factor de serviço = 20%, ciclos por explosão = 50, tempo de tratamento = 23 s.
    3. Depois de uma minuciosa pipetagem, transfira 10 µ l da mistura de DNA fragmentada para um tubo PCR limpa baixa vinculação.
      Nota: O experimento pode ser parado aqui. Preservar o DNA em 4 ° C ou a-20 ° C.
  2. Sequência de construção de biblioteca
    Nota: É absolutamente crítico para usar o kit especificado na Tabela de materiais nos procedimentos a seguir, devido à baixa quantidade de DNA de entrada.
    1. Adicionar 2 µ l de buffer de preparação de modelo e 1 µ l da enzima modelo preparação e misture-os bem com uma pipeta.
    2. Realizar a reação de preparação do modelo em um termociclador com as seguintes condições: 22 ° C por 25 min 55 ° C por 20 min, espera de 4 ° C e uma tampa aquecida a 101-105 ° C. Uma vez que a reação é completada, prossiga para a próxima etapa.
    3. Adicionar 1 µ l de buffer de síntese de biblioteca e 1 µ l da enzima de síntese de biblioteca para o produto de reação de preparação do modelo e incube a mistura a 22 ° C por 40 min (com uma espera de 4 ° C). Uma vez que a reação é completada, prossiga para a próxima etapa.
    4. Adicione 30 µ l do biblioteca amplificação mestre mix (25 µ l de tampão de amplificação da biblioteca, 1 µ l da enzima biblioteca amplificação e 4 µ l de água livre de nuclease) e 5 µ l de reagente de indexação.
    5. Misture tudo bem com uma pipeta e centrifugar a mistura brevemente com um centrifugador do tabletop.
    6. Execute um PCR com as condições apresentadas na tabela 1.
TemperaturaTempoCiclos de
72 ˚ c3 minutos
85 ˚ c2 minutos
˚ C 982 minutos
˚ C 9820 segundos4 ciclos
˚ C 6720 segundos
72 ˚ c40 segundos
˚ C 9820 segundos16 ciclos
72 ˚ c50 segundos
4 ˚ cSegure

Tabela 1: Condições PCR.

  1. Purificação dos produtos do PCR
    Nota: Este passo pode ser substituído com outros métodos de purificação. Se um método alternativo é usado, certifique-se de verificar a pureza de DNA resultante usando um espectrofotômetro. Rácios de absorvância de 260/280 e 260/230 devem estar acima de 1.8.
    1. Adicionar 50 µ l de grânulos magnéticos, adicionar a solução de 10 x e centrifuga-lo brevemente com microcentrifuga do tabletop.
    2. Incube a solução por 2 min à temperatura ambiente.
    3. Incube-lo num suporte magnético por 5 min ou até que a solução se torne completamente limpar e remover o sobrenadante.
    4. Adicionar 200 µ l de etanol a 80% preparados na hora para o tubo PCR baixa vinculação em um carrinho de ímã, espere por 30 s e retirar o sobrenadante. Repita este passo 2x. Não perturbe os grânulos.
    5. Brevemente, centrifugar o tubo do PCR baixa ligação com uma centrífuga de mesa e remover qualquer excesso etanol sobre o suporte magnético. Secar ao ar livre os grânulos, mas Evite excessos.
    6. Resuspenda as contas com 15 µ l de 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, completamente Pipetar a solução para que as esferas magnéticas são homogeneamente distribuídas, incubar o tubo para 2 min à temperatura ambiente e após uma breve centrifugação, incube-lo num suporte magnético para 2 min, até que a solução é clara.
      Nota: O tampão de eluição não deve conter EDTA, pois ela interfere com a química de sequenciamento.
    7. Transferi o sobrenadante, sem perturbar a pelota, para um novo tubo de PCR baixa vinculação.
      Nota: O experimento pode ser parado aqui. Preserve o DNA a 4 ° C ou a-20 ° C para armazenamento de longa data.

5. sequência do DNA, quantificação e verificação da qualidade

Nota: Uma seleção de qualidade não é conduzida antes desta etapa devido à baixa quantidade de DNA.

  1. Validação da distribuição de tamanho de biblioteca do DNA
    Nota: Outros sistemas de eletroforese de elevado-sensível com uma comunicação digital de distribuição de tamanho podem ser usados.
    1. Retornar o reagente do tampão de eletroforese e gel cartucho (25-1.000 bp no intervalo) à temperatura ambiente.
    2. Adicione 3 µ l de reagente tampão de eletroforese com 1 µ l da biblioteca de sequenciamento e misturá-los bem durante 1 min com um vórtice e brevemente, centrifugue-los com uma centrífuga de mesa.
    3. Realizar a eletroforese e validar a distribuição de tamanho de biblioteca com o software associado. O pico principal fragmento deve ser amplamente que variam de cerca de 300 a 1.000 bp.
  2. Quantificação de DNA
    Nota: Outros métodos baseados em fluorescência ou PCR quantitativo também pode ser usado, mas espectrofotometria deve ser evitada, pois não é suficientemente preciso para quantificar as bibliotecas de sequenciamento.
    1. Adicione 796 µ l de tampão de solução e 4 µ l de reagente fluorescente e misture-os bem. Dispense a 190 µ l da solução de trabalho de dois tubos de ensaio e 197 µ l para um tubo de ensaio.
    2. Adicione 10 µ l de padrões com concentrações conhecidas de DNA para cada tubo de ensaio contendo 190 µ l da solução de trabalho e 3 µ l da biblioteca preparada para o tubo de ensaio contendo 197 µ l da solução de trabalho.
    3. Vórtice brevemente os tubos e centrifugue-los em um centrifugador do tabletop. Quantificar o DNA usando um dados com configurações de 3 µ l.
  3. Sequência de biblioteca de DNA
    Nota: A plataforma de sequenciamento deve ser compatível com o kit de construção de biblioteca especificada.
    1. Prepare a biblioteca de sequenciamento baseada no protocolo do fabricante.
    2. Defina a célula de fluxo e gaveta de reagente dentro do instrumento de sequenciamento e insira o sequenciamento executar informações seguindo o protocolo do fabricante.
    3. Execute o sequenciamento.
      Nota: Temos realizado duas corridas de sequenciamento: uma amostra/executar, bem como quatro amostras multiplexadas em uma corrida.

6. computacional análise

  1. Chamada de base e, se necessário, demultiplex o lê.
  2. Valide a qualidade dos dados de sequência com FastQC19.
    Nota: Para uma validação mais detalhada dos dados obtidos, consulte nosso anterior relatório16.

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Resultados

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Exclusão de contaminantes:

Este protocolo envolve uma lavagem completa da Tardigrada e uma esterilização com tratamento de antibióticos para minimizar a contaminação. Também envolve um processo de verificação visual para garantir a integridade desses processos. Uma imagem de microscópio durante a validação (passo 2.4 do protocolo) é mostrada na Figura 2. Quando observado em uma ampl...

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Discussão

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Contaminação bacteriana representa uma ameaça para o sequenciamento de genoma de organismos microscópicos. Enquanto estudos anteriores no sequenciamento do genoma tardigrade tem filtrado contaminação usando métodos de extensa informática12,20, nós sequenciou o genoma de um único indivíduo para minimizar o risco de contaminações. Desde que um indivíduo Tardigrada contém aproximadamente 50-200 pg de DNA genômico16 e é envolto em uma camada e...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores agradecer Nozomi Abe, Yuki Takai e Nahoko Ishii seu apoio técnico no sequenciamento genômico. Este trabalho foi financiado por subsídio para a sociedade do Japão para a promoção da ciência (JSPS) Research Fellow, KAKENHI brasileira para jovens cientistas (No.22681029) e KAKENHI brasileira de pesquisa científica (B), n º 17 H 03620 dos JSPS, por um Subsídio para projetos de pesquisa de ciência básica da Fundação Sumitomo (No.140340) e em parte por fundos de pesquisa do governo da província de Yamagata e Tsuruoka City, Japão. Chlorella vulgaris , usado para alimentar os tardigrades foi fornecido cortesia de Chlorella Industry Co. Ltd.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Microscópio SZ61OLYMPUS
BactoAgarDifco Laboratories214010
Penicilina Estreptomicina (10.000 U/mL)Gibco by life technologies15140-148
VHX-5000 SistemaKeyence
0.2mL Tubo de revestimento de siliconeBio Medical ScienceBC-bmb20200
Quick-DNA Kit de micropreparaçãoZYMO ResearchD3021O uso deste kit é absolutamente crítico; consulte a etapa 3.1
1,5 mL microtubogreiner bio-one616-201Veja 4.1.1
Microcentrífuga refrigerada de alta velocidadeTOMYMX-307
Covaris M220Covaris Inc.
Kit ThruPLEX DNA-SeqRubicon GenomicsCAT. NO. R400406O uso deste kit é absolutamente crítico; consulte a etapa 4.2
TermocicladorBioer TechnologyTC-96GHbC
Reagente AMPure XPBECKMAN COULTER Life ScienceA63881
EtanolWako054-027335
Tampão EBQIAGEN19086
2200 TapeStationAgilentG2965AA 
D1000 ReagentesAgilent5067-5583
D1000 ScreenTapeAgilent5067-5582
Qubit dsDNA BR Tampão/ReagenteThermoFisher ScientificQ32850
Cubee Mini-CentrífugaRecenttecGenereachR5-AQBD01aqbd
MiSeq 600 ciclo v3Illumina Inc.MS-102-3003
Sequenciador MiSeqIllumina Inc.SY-410-1003
4482277

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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