Análise em tempo real de pressão-volume de infarto agudo do miocárdio em ratos

Resumo

Infarto agudo do miocárdio em ratos induz alterações agudas mas incompleta caracterizadas em função de ventrículo esquerdo (LV). LV cateterismo em ratos submetidos à oclusão da artéria coronária serve como um método novo para uma avaliação em tempo real da função de LV.

Resumo

Infarto agudo do miocárdio pode levar a insuficiência cardíaca aguda e choque cardiogênico. A avaliação da hemodinâmica é fundamental para a avaliação de qualquer abordagem terapêutica potencial dirigida contra aguda disfunção ventricular esquerda de (LV). Atual de modalidades de imagem (ex., ecocardiograma e ressonância magnética) tem várias limitações, desde que os dados sobre a pressão de LV não podem ser medidos diretamente. LV cateterismo em ratos submetidos à oclusão da artéria coronária poderia servir como um método novo para uma avaliação em tempo real da função de LV.

No início do procedimento, os ratos foram anestesiados seguido de intubação endotraqueal. Para cateterização de LV, a artéria carótida direita foi exposto através de incisão média-pescoço. O cateter foi introduzido e colocado na cavidade do LV. Foi realizada toracotomia esquerda e a artéria coronária esquerda (LCA) foi ligada. Para induzir a reperfusão, a sutura foi liberada após 45 min. pressão-volume dados foi gravados em todos os momentos.

Ligadura da ACV causou uma diminuição da função sistólica do LV como evidenciado por uma redução de 30% no volume de curso, fração de ejeção de LV (EF) e débito cardíaco. DP/dt máxima como um parâmetro para contratilidade LV foi também significativamente reduzida e a função diastólica foi severamente prejudicada (mínimo dP/dt-40%). Reperfusão durante um período de 20 min não conduziu a uma recuperação completa da função de LV.

Análise de pressão-volume em tempo real serviu como um procedimento válido para monitorar a função cardíaca durante infarto agudo do miocárdio em ratos. Manutenção da anestesia estável e uma abordagem cirúrgica padronizada foi crucial para assegurar resultados válidos. Como a fase inicial do infarto agudo do miocárdio é crítico para a morbidade e mortalidade, o método delineado pode ser benéfico para a avaliação pré-clínica de novas estratégias para cardioproteção.

Introdução

Doença cardiovascular é a causa mais comum de morte na civilização ocidental¹. Infarto agudo do miocárdio é um evento crítico, que é associado com alta mortalidade aguda e crônica². Mesmo se a revascularização é conseguida através de emergência intervenção coronária percutânea (PCI), a mortalidade permanece elevada, particularmente dentro o primeiro 48 h após o início dos sintomas em pacientes com infarto agudo do miocárdio³. Choque cardiogênico, causado por uma redução aguda em função de ventrículo esquerdo (LV) é das principais causas de mortalidade hospitalar nestes pacientes³. Esta redução precoce da função LV é causada por uma lesão miocárdica após isquemia e reperfusão. Esta chamada isquemia/reperfusão (eu / R) lesão é mediada por alterações no celular metabolome tais como a geração exagerada de de^4,de espécies reativas de oxigênio⁵.

Para explorar possíveis mecanismos de proteção, levando a uma diminuição do dano miocárdico em uma configuração pré-clínicos, rato fiável modelos são essenciais, incluindo métodos para a avaliação do post-e/R LV função⁶. Neste cenário, ecocardiografia transtorácica⁷ e ressonância magnética (MRI)⁶ são amplamente utilizados para fenotipagem funcional^8,9. No entanto, esses métodos não são adequados para a avaliação da disfunção LV grave e choque cardiogênico em um infarto do miocárdio em curso e não podem mostrar dados diretamente na pressão de LV. O aparelho de Langendorff com coração isolada em um ensaio ex vivo fornece informações sobre o pathomechanisms subjacente da fase inicial eu / R lesão¹⁰. Este método é limitado devido à sua incapacidade de reproduzir na vivo mecanismos adaptativos como regulamento do sistema nervoso autônomo ou regulação hormonal e homeostase da ácido-base. Existe actualmente nenhum método disponível para uma completa funcional fenotipagem de choque cardiogênico e disfunção ventricular esquerda durante um curso miocárdica eu / lesão R.

Uma abordagem sincronizada com combinação de cateterização de pressão-volume (PV) e oclusão transitória cirúrgico principal artéria coronária esquerda (LCA) pode ser benéfico, mas tecnicamente desafiador. Estável extracardiac hemodinâmica durante I / lesão R são essenciais para obter resultados válidos desde instável anestesia ou perda sanguínea pesadamente poderia influenciar os resultados. Um romance de aproximação para hemodinâmica fenotipagem de I / R lesão através de LV PV cateterismo e transiente LCA oclusão poderia trazer novos insights em choque cardiogênico e disfunção de LV no infarto agudo do miocárdio e servir como um método para análise futura em cardioproteção.

Protocolo

Todos os experimentos foram concluídos em conformidade e em conformidade com todos os regulamentos pertinentes («Convenção Europeia para a protecção dos animais vertebrados utilizados para fins experimentais e outros fins científicos (Directiva 2010/63/UE) ou cuidado animal estava no conformidade com as normas institucionais. Todos os experimentos foram realizados com camundongos C57BL/6JRj do sexo masculino na idade de 6 meses.

1. preparação

1. Prepare um microscópio cirúrgico e uma almofada de aquecimento, bem como uma sonda rectal para monitorar a temperatura do corpo. Limpar e esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos.
2. Prepare 2 pedaços de 10 cm de fio de seda 5-0 para ligadura de vasos, 5 cm de fio de polipropileno 6-0 e tubo de silicone de 2 mm para ligadura do LCA.
3. Prepare a cubeta de calibração de cateter de PV, pré-aquecimento-37 ° c e prepare uma 100 µ l Hamilton seringa cheia com 15% de cloreto de sódio (NaCl) em H₂O para calibração de salina.
4. Cateter de lugar o PV (3 cm, F 1,4) em 37 ° C pré-aquecido 0,9% NaCl em H₂O (salina) pelo menos 30 minutos antes da medição. Conectar o cateter para o dispositivo de aquisição de dados e conectar o dispositivo a um conversor analógico/digital. Conecte os dois dispositivos a um computador.
5. Configure o software. Realize pressão orientada por software de calibração e calibração de condutância, conforme exigido pela orientada por software de fluxo de trabalho⁸.

2. anestesia e Analgesia

1. Anestesia o mouse usando a cetamina 100mg/kg de peso corporal e o peso de corpo de 10 mg/kg de cloridrato de xilazina por injeção intraperitoneal. No início da eu / cirurgia R, administrar 0,05 mg/kg corpo peso buprenorfina intraperitonealmente para manter analgesia.
2. Depois de 10 min, realizar intubação endotraqueal usando cateter 20G por via intravenosa (iv) e ventilar o mouse com 40% de oxigénio (O₂) e 2% (v) de isoflurano. Definir parâmetros de ventilação apropriado (por exemplo, 220 µ l volume de curso, 150/min. para um mouse de C57BL/6JRj de 25-30 g).
3. Monitore continuamente o corpo temperatura via retal. Aperte o mouse na placa aquecida com a cabeça apontando para o investigador. Temperatura normal do corpo de mouse é 36,5-38 ° C. Manter a temperatura corporal dentro de 1 grau pelo ajuste da temperatura da chapa aquecida.

3. esquerdo Ventricular cateterismo

1. Desinfecte o peito e pescoço com três esfrega alternadas de betadine e 70% de álcool.  Espere por desinfectante da pele secar. Remova os pelos no peito, usando um sistema de barbear de animais pequenos.
2. Realize uma incisão longitudinal mediana 10 mm 5 mm abaixo do lábio inferior para o esterno usando pequena tesoura cirúrgica.
3. Disse a parte esquerda e direita da glândula submandibular através de romba preparação usando uma pinça. Separe o tecido muscular e gordura na região paratraqueal direita para expor a artéria carótida direita comuna. Mobilizar e separar do navio para um comprimento total de 5-10 milímetros do tecido conjuntivo através de cuidadosa preparação contundente ao lado do navio com uma pinça curvada.
   Nota: Evite manipulação mecânica do nervo vago ou o corpo da carótida, em todos os tempos, pois isso pode causar bradicardia e hipotensão arterial grave.
4. Passe os dois fios de seda preparados sob o vaso. Ligar o vaso distal com um nó apertado e coloque um nó frouxo na região proximal exposta que ainda permite a passagem do cateter.
5. Fixe os fios do nó craniano (apertado) ao lado da cabeça dos ratos para aplicar uma tensão leve no navio como isto irá facilitar a introdução do cateter. Coloque um grampo vascular pinça hemostática no navio proximal proximal do nó solto reversivelmente bloquear o fluxo sanguíneo.
6. Realize uma incisão em forma de cunha 1 mm proximal ao nó craniana para abrir o recipiente com micro tesouras.
   Nota: Uma pequena gota de sangue irá indicar a adequada execução desta etapa.
7. Inserir o cateter cuidadosamente para 10mm. iniciar a gravação dos dados do cateter.
   Nota: Estendendo-se a incisão com um fórceps pode facilitar esse processo.
8. Extraia o grampo vascular. Adicione 1 a 2 gotas de solução salina para a incisão para facilitar o movimento do cateter. Continue a introduzir o cateter por aproximadamente mais 10 mm. Depois de passar o nó proximal com a ponta do sensor, aperte o nó com cuidado apenas suficiente para evitar refluxo juntamente com as partes mais finas do cateter de sangue sem prejudicar o movimento do cateter.
   Nota: O tamanho do sensor na ponta do cateter impede o refluxo do sangue ao extrair o grampo vascular.
9. Delicadamente, continue-se de inserir o cateter até a análise de pressão mostra pressão arterial perfil indicando que o cateter é colocado na aorta (Figura 3A).
   Nota: O cateter atingindo a válvula aórtica será indicado pela resistência de luz e movimento sincronizado de pulso do cateter.
10. Quando sentir resistência, tentando avançar através da válvula aórtica, puxe o cateter novamente 5 mm e avance até cateterismo LV será indicado em uma mudança na análise de PV como pressão diastólica chegará a 0 - 20 mmHg (Figura 3B). Observe as variações de volume de acompanhamento para confirmar ainda mais a colocação ventricular esquerda da ponta do sensor (Figura 3). Aperte o nó proximal mais firmemente para impedir o movimento do cateter.

4. isquemia/reperfusão cirurgia

1. Realizar incisão na pele do esterno caudal em direção a axila esquerda para um comprimento total de 15 mm. Proceda com preparação brusco das camadas dois musculares até as costelas podem ser visualizadas.
2. Abra a tórax através de incisão entre a terceira e quarta costela esquerda. Use ganchos cirúrgicos para obter acesso ao pericárdio. Ressecar o pericárdio acima do coração. Antes de continuar com a ligadura da ACV, espere 30 s sem tocar o animal gravar dados de PV para análise válido.
3. Localize a ACV emergentes sob a orelha esquerda e descendo no lado esquerdo do coração em direção ao ápice. Use uma sutura de polipropileno de 6-0 para cercar a artéria com um loop de 2 mm por baixo da aurícula esquerda. Coloque um tubo de silicone pequeno sob o loop e um nó apertado acima.
   Nota: Ficando cinza de miocárdio Distal serve como controle positivo para ACV oclusão⁶. Eu / cirurgia R deve ser realizada em 5 min, independentemente do investigador operacional.
4. Corte a sutura em 1 mm de comprimento. Solte os ganchos cirúrgicos e fechar manualmente as camadas de músculo acima da incisão. Espere 45 min enquanto grava continuamente dados de PV.
5. Depois de 45 min, re-abrir a incisão e remova o tubo de silicone para induzir a reperfusão. Gravar dados por mais 20 minutos.
   Nota: Uma mudança para uma cor vermelha como visto antes isquemia indica sucesso reperfusão.

5. calibração

Nota: A calibração do sistema PV cateter consiste em 4 etapas obrigatórias, dois dos quais têm a ser executada após a medição. Calibração deve ser repetida após cada experimento para assegurar resultados válidos.

1. Execute a calibração de pressão e calibração de condutância antes do experimento, conforme descrito no passo 1.5.
2. Realize a calibração salina quando o cateter ainda é colocado no ventrículo esquerdo após o experimento em si está terminado. Localize a veia jugular certa lateral da artéria carótida na área preparada. Injectar 10 µ l 25% NaCl em H₂O através de um Hamilton seringa durante a gravação de dados.
3. Calcule a calibragem usando o software de aquisição, realçando a fase ascendente na curva de volume (Figura 5). Repita este processo para um total de 3 vezes. Evite a perda de sangue após a extração da seringa, usando uma pinça vascular para comprimir rapidamente a punção.
4. Realize a calibração de volume para calibrar a aquisição de dados de volume por análise de volumes padronizadas. Obter sangue de rato de aproximadamente 500 µ l de punção cardíaca com uma seringa de 1ml ligeiramente heparinizado (por exemplo, 5 µ l por 200 heparina de IE). Puxe o cateter PV 10-15 mm, para não danificar o cateter.
5. Encha o sangue Obtido em cuvete de calibração previamente aquecida a 37 ° C (Figura 5A). Evite bolhas que pode interferir com os resultados. Adicione a ponta do cateter em cada bem e gravar dados. Obter uma curva padrão orientada por software de análise (Figura 5B). Repita o processo para um total de 3 vezes.
6. Eutanásia em ratos de sangria deslocamento cervical enquanto anestesia suficiente de isoflurano é mantida em todos os tempos.

6. análise de dados

1. Depois de concluir as etapas de calibração, realizar a análise de dados orientada por software. Portanto, destacar a seção apropriada (pelo menos dez ciclos) dentro da seção de análise do PV de fluxo de trabalho e realizar a análise de linha de base. Excluir os ciclos com desvios devido à ventilação ou manipulação se necessário (Figura 3D).
2. Realize análise de linha de base PV antes de passagem da válvula aórtica (apenas pressão arterial), imediatamente antes e após a oclusão do LCA. Prossiga através da realização de análise de base de PV e em intervalos de 5 min., enquanto isquemia e reperfusão. No final do experimento, realizar análise de dados de pressão após a retração do cateter do ventrículo esquerdo (pressão arterial).
3. Analise pelo menos 10 ciclos consecutivos, para evitar erro de amostragem. Quando experimenta forte interferência de obtidos valores com a ventilação, interrupção transitória da ventilação para um máximo de 5 s pode ser considerado.
4. Use os seguintes parâmetros que são calculados em Análise de linha de base (Figura 3D) para caracterizar a função LV:
   1. Volume de curso (µ l)
   2. Fração de ejeção: Stroke volume / diastólica final volume (%)
   3. Débito cardíaco: volume de curso * frequência cardíaca (µ l/min)
   4. Índice cardíaco: saída Cardiac (µL/(min*cm²) de área de superfície do corpo
   5. Curso de trabalho: área interna da curva PV (mmHg * µ l)
   6. Pressão máxima (Pmax); Pressão média (Pmean)
   7. dP/dt máxima (mmHg/s) como um parâmetro de função sistólica LV
   8. min dP/dt (mmHg/s) como um parâmetro para conformidade de LV
   9. Constante de tempo de tempo de relaxamento: Tau (ms)

Resultados

Após cateterismo LV, reversível ligadura de LCA foi realizada por 45 min, seguido por 10 min de reperfusão. Dados de PV foi gravados em todos os tempos (Figura 1).

Correto posicionamento do cateter PV foi confirmado, obtendo o gráfico característico do LV PV (Figura 2A). Colocação de cateter de LV mostrou a faixa de pressão ventricular típica com um mínimo de 0 - 20 mmH...

Discussão

PV monitorização da hemodinâmica LV no infarto agudo do miocárdio serve como um novo método para avaliação em tempo real na vivo de choque cardiogênico e insuficiência de LV em I / lesão R. Cateterismo PV pode fornecer um amplo espectro de parâmetros no que respeita à função sistólica e diastólica de LV. Além dos parâmetros volumétricos LV normalmente obtidos pela ecocardiografia ou ressonância magnética (volumes de câmara, EF, débito cardíaco e volume de curso), análise PV produz um perfil mais completo da funç...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Betaisodona Loesung	Mundipharma	4162-1606/89x30mm	Cubeta de calibração Povidon-Iod
Instrumentos	Millar	910-1049	Cubeta de calibração
Contura aparador de pêlos profissional	Wella	HS-60	Sistema de barbear para pequenos animais
Agulha Eclipse 27G	BD	REF 305770	27G
agulha Fórceps	FST	11203-25, 11069-08, 11616-15, 11506-12, 11051-10	Pinça cirúrgica
Pinça	Aesculap Braun	BN731R, BD 311R	Pinça cirúrgica
Foris FS2434	Eizo	0FTD2033	Monitor
Hamilton Seringa 100 µ agulha l	Hamilton	80621	100µ l seringa com agulha
Mesa OP aquecida para pequenos animais	Harvard Apparatus	15001	Mesa OP aquecida
Heparina-Natrium 25000	Ratiopharm	N68542.04	Heparina
Cetamina 10% 100 mg/ml	bela-pharm	FS1670041	Ketamin
Labchart Pro 8 + Pro módulos	AD Instruments	MLS260/8	PV software de análise de dados
LAS EZ	Leica	Software da câmera do microscópio	LAS EZ
Leica IC80 HD Leica		IC80 HD	Câmera do microscópio
Leica M80	Leica	M80	Microscópio
Transdutor de cateter de microponta	Instrumentos Millar	Cateter fotovoltaico SPR-839	MiniVent
	Harvard Apparatus	845	ventilação
MPVS Ultra	Instrumentos Millar	Dispositivo de aquisição de dados de cateter fotovoltaico	PL3508B48/M
Octenisept	Schü lke	20000832-A	desinfetante
Plastipak 1ml	PD	REF 303172	seringa de 1ml
PowerLab 8/35	AD Instruments	PL3508	conversor analógico/digital
Prolene 6-0	Ethicon	XNEH7814. P31	Kit de
retração de sutura	FST	18200-20	retração de situs cirúrgico
Seraflex 5-0	Sutura de seda	IC108000
Naila Tesoura pequena e micro-tesoura	FST	Essen 14059-11, 15007-08, 14064-11	Tesoura cirúrgica
Tubo de silicone pequeno	Tubo Reichelt Chemietechnik		para oclusão LCA
Sódio Cloreto	Sigma-Aldrich	S7653	Cloreto de sódio
testo 108	testo	5631080	termômetro retal
Computador desktop Thinkcentre		PC0EJS2V	computador
Vasofix Safety 20G	Braun	4269110S-01	cateter de intubação
Windows 10	Microsoft	KW9-00240	Sistema operacional
Xylazin 2%	Ceva	6324464.00.00	Cloridrato de xilazina