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Artigo de método

Um protocolo para adquirir o Tenocyte degenerativa dos humanos

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DOI:

10.3791/57634

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9 de junho de 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, CHA Bundang Medical Center, CHA University School of Medicine, 2Department of Pathology, Kyung Hee University Hospital at Gangdong, Kyung Hee University School of Medicine, 3Department of Physiology, CHA University School of Medicine, 4Department of Rehabilitation, CHA Bundang Medical Center, CHA University School of Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Uso in vitro de tenocytes degenerativa é essencial ao investigar a eficácia do tratamento romance na tendinopatia. No entanto, a maioria dos estudos de investigação usar apenas o modelo animal ou um tenocyte saudável. Propomos o seguinte protocolo para isolar tenocytes degenerativa humana durante a cirurgia.

Resumo

Tendinopatia, uma condição dolorosa que se desenvolve em resposta à degeneração do tendão, está em ascensão no mundo desenvolvido devido ao aumento da atividade física e a esperança de vida. Apesar de sua crescente prevalência, a patogênese subjacente ainda permanece incerto, e o tratamento é geralmente sintomático. Recentemente, várias opções terapêuticas, incluindo fatores de crescimento, as células-tronco e terapia gênica, foram investigadas na esperança de aumentar a potência de cura do tendão degenerativa. No entanto, a maioria destes estudos de investigação foram realizada somente em modelos animais ou tenocytes humana saudável. Apesar de alguns estudos usando tenocytes patológico, para o melhor de nosso conhecimento não há atualmente nenhum protocolo descreve como obter tenocytes degenerativa humana. O objetivo deste estudo é descrever um protocolo padrão para a aquisição de tenocytes degenerativa humana. Inicialmente, o tecido do tendão foi colhido de um paciente com epicondilite lateral durante a cirurgia. Em seguida, foram coletadas amostras de biópsia do extensor carpi radial brevis tendão correspondendo a mudanças estruturais observadas no momento da cirurgia. Todos os tendões colhidos apareceram para ser maçante, cinza, friável, e edematosa, que fez-los visualmente distintos daqueles saudáveis. Tenocytes foram cultivadas e usadas para experimentos. Entretanto, metade dos tecidos colhidos foram analisados histologicamente, e foi mostrado que partilhavam as mesmas características chaves da tendinopatia (angiofibroblástico displasia ou hiperplasia). Uma análise secundária por imunocitoquímica confirmou que as células cultivadas foram tenocytes com a maioria das células ter manchas positivas para proteínas mohawk e tenomodulin. As qualidades da natureza degenerativa de tenocytes foram então determinadas comparando-se as células com o controle saudável usando um ensaio de proliferação ou qRT-PCR. O tenocyte degenerativa exibido uma maior taxa de proliferação e padrões de expressão de gene semelhante de tendinopatia que combinasse os relatórios anteriores. Em geral, este novo protocolo poderá fornecer uma ferramenta útil para futuros estudos de tendinopatia.

Introdução

Tendinopatia é uma condição de músculo-esquelética crônica degenerativa que se desenvolve em várias partes do corpo. Recentemente, o número de casos de tendinopatia aumentou consideravelmente no mundo desenvolvido devido à crescente participação em esportes recreativos e maior expectativa de vida1,2. A causa da tendinopatia é considerada multifatorial e essas causas incluem isquemia, lesões de radicais livres de oxigênio, um desequilíbrio entre inervações vasoconstritor e vasodilatador, micro-rasga interna e alterações neuro-Regulamento3 ,4,5,6,7,8. A maioria dos tratamentos para tendinopatia apenas aliviar seus sintomas. Além disso, tratamentos sem regeneração de tecidos requerem um longo tempo para reabilitação e alcançar uma resposta limitada de tendões lesionados, que impõe um desafio clínico para os médicos,9.

A incompetência de opções atuais do tratamento, juntamente com a falta de capacidade de degenerativa do tendão de auto-recuperação tem chumbo pesquisadores a ter interesse em explorar estratégias de tratamento alternativo. Recentemente, novos estudos relataram muitos resultados promissores para melhorar a eficácia de cura dos tendões tendinopatia usando fatores de crescimento, células-tronco com base em terapia e terapia de gene10,11,12.

Através de uma revisão de literatura, encontramos que os estudos envolvidos podem ser divididos em duas categorias com base em seus materiais de análise: animal modelos como um rato, um rato ou um coelho; e modelos humanos. No que se refere o modelo animal, atualmente, existem duas técnicas populares para gerar tendinopatia: indução química da lesão ou mecânico sobrecarregando o modelo. No entanto, cada modelo animal foi limitado em reproduzir o complexo humano tendinopatia patologia13,14.

A maioria dos jornais, usando amostras humanas foram analisados histologicamente ou realizado o em vitro experimento com base em um tenocyte humano saudável em vez de um tenocyte degenerativa15,16,17,18 , 19 , 20 , 21. somente alguns jornais relataram que eles usaram um humano tenocyte degenerativa, mas eles não descrever em detalhe o protocolo usado para obter o tenocyte degenerativa do humano22,23. Neste contexto, note-se que resultados de sucesso do modelo animal ou o tecido saudável/tenocyte não podem necessariamente prever eficácia humana ou dosagem eficaz porque a degeneração do tendão é um processo complicado e a patogênese é Ainda não totalmente compreendidas.

Coletivamente, é necessário descrever o protocolo padrão para obter o tenocyte degenerativa do tecido humano sem causar efeitos adversos para o doador. Este artigo descreve um protocolo sobre como adquirir o tenocyte degenerativa humana. Para validar o protocolo, os tecidos colhidos foram analisados histologicamente. Em seguida, a célula culta foi confirmada como o tenocyte degenerativa usando imunocitoquímica (ICC), um quantitativo em tempo real-cadeia da polimerase (qRT-PCR) e um ensaio da viabilidade.

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Protocolo

O protocolo foi realizado em conformidade com a declaração de Helsínquia e o protocolo foi aprovado pelo Conselho de revisão institucional no CHA Bundang Medical Center.

1. colheita de tecido degenerativas do tendão do paciente

  1. Diagnóstico de epicondilite lateral tomar uma história clínica e achados de exame físico, usando: ternura sobre a origem tendinosa perto do epicôndilo lateral; dor evocada por resistiu à extensão da articulação do pulso.
  2. Use os seguintes critérios de inclusão: mais de 18 anos de idade; uma história de epicondilite lateral, por um período mínimo de seis meses; recalcitrante para tratamento não-operatório; pelo menos três meses se passaram desde que a injeção de corticosteroide, plasma rico plaquetas ou toxina botulínica
  3. Excluir o seguinte: as mulheres grávidas; pacientes com história de doença da coluna cervical, cotovelo, artrite, doenças reumatológicas, cirurgia ao redor do cotovelo e síndrome de encarceramento do nervo; pacientes, recusando-se a doar o tecido.
  4. Técnica cirúrgica
    Nota: Ver Figura 124.
    1. Após anestesia geral por intubação endotraqueal e isoflurano, colocar o braço na mesa e aplicar um torniquete. Em seguida, aplica betadine agente sobre o braço todo e a cortina com uma folha de cirúrgica asséptica.
    2. Expor o cotovelo lateral através de uma incisão de 3 a 5 cm com n º 15 cirúrgica Bisturi lâmina apenas ântero-medial ao epicôndilo lateral e proximal ao nível da articulação.
    3. Visualmente identificar a interface de aponeurose do extensor e extensor radial longo do carpo (ECRL) e fazer uma incisão de divisão 2 a 3 mm em profundidade entre o ECRL e extensores aponeurose com uma lâmina de bisturi cirúrgico de n º 15 na interface identificada.
    4. Extraia o ECRL anteriormente, que trará a origem patológica extensor carpi radial longo brevis (ECRB) abaixo em vista directa.
    5. Identifica visualmente o tecido degenerativo patológico por sua característica cor cinzento maçante e tecido geralmente edemaciado e friável.
    6. Após a identificação, cuidadosamente ressecar todo o tecido degenerativo agudamente usando cirúrgica bisturi n º 15 e minilâminas.
    7. Incorporar o tecido ressecado (cerca de 1 cm3) salina tamponada fosfato (PBS) imediatamente e remover todo o tecido circundante, exceto o tecido do tendão cuidadosamente em cerca de 10 mL de PBS, logo que possível.
    8. Em casos com Exostose óssea no epicôndilo lateral, remover Exostose usando um rongeur e suavizar isso com uma grosa. Fazer vários furos (diâmetro 1,6 mm, com furos de 6 – 8) no côndilo ântero-lateral para aumentar o suprimento vascular. Isto é opcional.
    9. Feche a ferida camada por camada, usando material de sutura não absorvível.
  5. Tenocyte de controle saudável
    1. Obter tenocytes saudável do tendão remanescente do tendão autotendão ou autopatela durante a reconstrução do ligamento cruzado anterior e usá-lo como o controle para o seguinte experimento25.
      Nota: O número de amostras utilizadas neste estudo foram três em cada grupo.

2. histologia

  1. Cerca de metade do tecido colhido armazenar em formol a 10% tamponada neutro em uma coifa química ou equivalente.
  2. Seção-lo em seções de 4 – 5 µm no e incorporar o tecido em um bloco de parafina (4 – 5 mL).
  3. Mancha de seções de controle e degenerativas do tendão com mancha de hematoxilina e eosina (H & E) e mancha azul de Alcian a um pH de 2,5. Execute H & E mancha em uma máquina automatizada mancha como segue.
    1. Deparaffinize usando o xileno (3 vezes, 5 min, respectivamente).
    2. Hidrato de álcoois classificados à água (100% álcool, 4 min 100% álcool, 3 min 95% de álcool, 2 min; álcool 70%, 1 min; água, 2 min).
    3. Coloração em hematoxilina 5 min. Lave bem em água por 2 min.
    4. Diferenciar em álcool ácido 1% (1% HCl em álcool a 70%) por 3 s. lavar bem em água por 3 min.
    5. Neutralizar o HCl mergulhando em uma amônia de 0,5% para 10 s, seguido por uma lavagem de água de 3 min.
    6. Mancha na Eosion por 5 min.
    7. Desidrata-se através de álcoois (80% de álcool, 30 s; 95% de álcool, 1 min; álcool 1 min, 100% de álcool a 100% 2 min).
    8. Claro em xileno (3 vezes, 2 min, 2 min e 3 min, respectivamente).
    9. Montar com um slide de capa.
  4. Execute immunohistochemitry (IHC) usando o kit Bond polímero refinar deteção de acordo com as instruções do fabricante com pequenas modificações.
    1. Depois de deparaffinization usando o xileno, executar um procedimento de recuperação de antígeno usando solução de recuperação de epítopo de Bond por 30 min a 100 ° C. A solução de recuperação de epítopo Bond contém um tampão citrato baseado e surfactante (1 L, pH 5,9 – 6.1).
    2. Saciar peroxidases endógenas incubando o tecido com peróxido de hidrogênio por 5 min.
    3. Incube as seções durante 15 minutos a uma temperatura ambiente (21-22 ° C) com anticorpos contra o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) (1: 200), tenomodulin (1: 200) ou mohawk (1: 200).
    4. Execute o anticorpo secundário de marcação com um sistema conjugado de rábano poliméricos livre de biotina peroxidase-linker anticorpo.
      1. Uso secundário coelho anti-mouse IgG no soro animal de 10% (v/v) em solução tampão saline/0.09% 2-Methyl-4-isothiazolin-3-one solução para localizar anticorpos do rato.
      2. Use anticoelho de polímero poli-HRP-IgG (< 25 µ g/mL) contendo 10% (v/v) de soro animal em tampão Tris saline/0.09% para localizar anticorpos de coelho.
      3. Uso 3, 3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hidrato em uma solução de estabilizador para visualizar o complexo através de um precipitado marrom.
      4. Counterstain com < 0,1% hematoxilina (azul) para visualizar o núcleo de células.
  5. Observar os slides corados com H & E, Alcian blue manchas e IHC para VEGF, tenomodulin e mohawk sob microscópio de luz e obter imagens microscópicas representativas de cada slide em campo uma alta potência (400 X).

3. Tenocyte cultura

  1. Preparação do tecido
    1. Prepare a amostra de tendão, removendo todo o tecido circundante completamente com microtesoura e pinça.
    2. Lavagem com PBS e picar em pedaços pequenos (cerca de 1 mm3 ou menos).
    3. Digerir tecido por 1h em 30 mL de meio modificado águia de Dulbecco (DMEM) suplementado com 30 mg/mL colagenase II a 37 ° C.
    4. Passe as células através de um filtro de célula de 100 µm.
    5. Desactive a colagenase II, adicionando 1 mL de soro fetal bovino (FBS).
    6. Centrifugar a 196 x g durante 5 min.
  2. Cultura celular
    1. 3 x 105 células de sementes em um prato de 100mm e cultura com DMEM suplementado com 10% FBS e 1% de solução antibiótico antimicótico a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 por 1 semana.
    2. Altere o meio de cultura a cada três dias até que ocorra a confluência de 80%. Cultura tanto controle saudável e amostras de células degenerativas até passagem quatro e usar para experimento.

4. imunocitoquímica (ICC)

  1. 200 µ l de células cultivadas (2 x 105 células) de transferência aos oito poços de um slide de câmara e crescer as células a confluência com a adição de novas mídias para 1 dia.
  2. Lavar as células com PBS e corrigir com 500 µ l de formol 4% por poço.
  3. Incubar as lâminas com 0,5% Triton X-100 em PBS por 10 min para permeabilização das membranas.
  4. Bloquear em PBS com albumina de soro bovino 1% e 0,05% TWEEN-20 para mohawk e tenomodulin, respectivamente.
  5. Incube no escuro com anticorpo monoclonal antimoicano de rato (diluição de 1: 100) e anticorpo anti-tenomodulin de cabra (diluição de 1: 100) a 4 ° C durante a noite.
  6. Incubar os anticorpos secundários (Alexa 555-anti cabra (1: 200) por tenomodulin; Rato de 488-anti de Alexa (1: 200) por mohawk) no escuro por 1h à temperatura ambiente.
  7. Montar com 0,5 µ l de um meio de montagem de fluorescência.
  8. Analise usando um microscópio de fluorescência (400 X).

5. proliferação ensaio

  1. Realidades de célula de medida usando Water-soluble tetrazólio (WST) -1.
    1. Sementes de células saudáveis e degenerativas em 96 placas bem em uma densidade de 2 x 103 células por poço para 24, 72 e 120 h.
    2. Após a incubação, adicione 10 µ l da solução de WST-1 de 10% a cada poço.
    3. Incube as placas durante 3 h a 37 ° C em 5% CO2.
    4. Medir as densidades ópticas a 450 nm, utilizando um leitor de microplacas. Fazer leituras de pelo menos três vezes em todos os pontos de tempo para cada amostra.
  2. Medida celular DNA quantidade usando o ensaio de BrdU.
    1. Ambos saudável de sementes e célula degenerativa em 96 placas bem em uma densidade de 2 x 103 células por poço para 24, 72 e 120 h.
    2. Após a incubação, adicione 10 µ l de solução de BrdU 10% a cada poço.
    3. Incube as placas durante 3 h a 37 ° C em 5% CO2.
    4. Adicionar 100 µ l/poço da solução de fixação/desnatura (60-70% de etanol, 0,1 – 0,5% de hidróxido de sódio) e manter a placa à temperatura ambiente por 30 min.
    5. Adicione 100 µ l/poço preparado 1 x solução de anticorpo de deteção e manter a placa à temperatura ambiente durante 1 h.
    6. Remover a solução e lavar a placa 3 vezes com tampão de lavagem 1X.
    7. Adicionar 100 µ l/poço preparado 1 solução de anticorpo secundário conjugado HRP x e manter a placa à temperatura ambiente por 30 min.
    8. Retire a placa da solução e lavar três vezes com tampão de lavagem 1X.
    9. Adicione 100 µ l de substrato TMB de 50%.
    10. Incube durante 30 min à temperatura ambiente.
    11. Adicione 100 µ l de solução de paragem.
    12. Medir as densidades ópticas a 450 nm, utilizando um leitor de microplacas.
      Nota: Leituras de tomar pelo menos três vezes em todos os tempo pontos para cada amostra.

6. análise estatística

  1. Coletar e analisar dados usando SPSS.
  2. Retratam dados pela média ± erro padrão da média.
  3. Teste de Mann Whitney U uso.
  4. Considerar as diferenças estatisticamente significativas quando o valor de p é menor que 0,05 (p < 0,05).

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Resultados

Análise histológica revelou que o tecido colhido da epicondilite lateral teve as características de um tendão de tendinopathic. H & E seção de tendinopatia degenerativa do tendão revelou um bundle colágeno desorganizada com uma perda de polaridade e estruturas de fibra fina reta, fortemente embalado paralelo. Histológicas sinais sugestivos de degeneração, tais como maior celularidade e núcleos alargados sem a forma típica do eixo eram comuns nas amostras. Além disso, feixes de colágen...

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Discussão

Um número de estudos anteriores relataram como criar modelos animais tendinopathic crônica, utilizando diferentes procedimentos como colagenase ou injeção de kartogenin, esteira correndo e mais26,,27. Embora os estudos numerosos mostraram promissores efeitos terapêuticos baseados-se nestes modelos animais, experimentos utilizando o tenocyte degenerativa humana seria cruciais no campo da tendinopatia para reproduzir a eficácia do tratamento. Neste artigo, nós esta...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada por uma concessão da Coreia saúde tecnologia R & D projeto através da Coreia saúde indústria desenvolvimento Institute (KHIDI), que foi financiado pelo Ministério da saúde & bem-estar, República da Coreia (número de concessão: HI16C1559).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
BisturiKisanbioKS-Q0306-15No. 15
Mini-bladeBeaver374769
meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)Gibco11995065
PBSGibco14190250
soro fetal bovino (FBS)Gibco16000044
50 mM ácido ascórbico-2-fosfatoSigma-AldrichA5960
Solução Antibiótico-AntimicóticaGibco15240062
4% formaldeídoBio-soluçãoBP031
Triton X-100 Sigma-AldrichX100-100ml
BSARdtechC0082
TWEEN 20Sigma-AldrichP9416-100ml
MKX (C-5)Santa cruz biotecnologiasc-515878
Tenomodulin (N-14)Santa cruz biotecnologiasc-49325
Fluorescência Meio de MontagemDAKOS3023
DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dicloridrato)Thermo Fisher ScientificD1306
WST-1Dojindo Molecular TechnologiesCK04
BrdU Kit de Ensaio de Proliferação Celularde Sinalização Celular#6813
TRIzol ReagentInvitrogen15596018
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad170-8891
TaqMan Gene Expression Master MixApplied Biosystems4369016
GAPDHThermo Fisher ScientificHs02786624_g1
COL3A1Thermo Fisher ScientificHs00943809_m1
ACTA2Thermo Fisher ScientificHs00426835_g1
TAC1Thermo Fisher Scientific
TACR1Thermo Fisher ScientificHs00185530_m1
PTGS2Thermo Fisher ScientificHs00153133_m1
ACTBThermo Fisher ScientificHs99999903_m1
Cell Strainers (100 µ m) Corning352360
100mmThermo Fisher Scientific8188207
Lâmina de Câmara de 8 poçosThermo Fisher Scientific154534
96 Placas de Poliestireno de Fundo Plano Transparente de 96 Poços MicroscópioCorning3596
Nikon Eclipse 50i Leitor
VERSA max Molecular Devices
CFX96 Sistema de Detecção de PCR em Tempo RealBio-Rad
Solução de formalina, tamponado neutro, 10%Sigma-AldrichHT501128
ParafinasLeica Biosystems3801340
EtanolJUNSEI CHEMICAL90303-2185
HematoxilinaDAKOCS70030-2
EosinDAKOCS70130-2
Alcian blueDAKOAR16011-2
Ácido cítricoSigma-Aldrich251275
XilenoJUNSEI CHEMICAL25165-0430
Peroxidases endógenas DAKOS200380-2
Canadá bálsamoJUNSEI CHEMICAL23255-1210
Lâmina de micrótomoPENAA35
Vidro deslizanteSUPERIOR1000612
Vidro de coberturaMarienfeld-Superior101050
VEGFSanta cruz biotecnologiasc-7269
SPSS SoftwareCentrífugaVer. 18.0
LABOGENE1248R
Tecnologia Hs00243225_m1Prato de cultura de microplacas Nikon multiuso IBM

Referências

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Tecido Tend neoDigest o com ColagenaseCultura CelularImunocitoqu micaColora o por H EEnsaio de Prolifera oqRT PCRProte na MohawkProte na Tenomodulina
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