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Eficiente geração de pâncreas/duodeno Homeobox proteína 1+ Posterior Foregut/pancreático progenitores de hPSCs em culturas de adesão

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DOI:

10.3791/57641

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27 de março de 2019

 ,  ,  , 
1Center for iPS Cell Research and Application (CiRA), Kyoto University

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para diferenciar as células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) em proteína de pâncreas/duodeno homeobox 1+ (PDX1+) células para a geração de linhagens pancreáticas baseiam no crescimento não-colônia tipo monocamada de dissociou células únicas. Este método é adequado para produzir células hPSC-derivado homogêneas, a manipulação genética e rastreio.

Resumo

Células-tronco pluripotentes humanas (hPSC)-derivadas de células pancreáticas são uma fonte promissora de célula para medicina regenerativa e uma plataforma para estudar processos de desenvolvimento humanos. Dirigido por diferenciação que recapitula a processos de desenvolvimento é uma das principais maneiras de gerar células pancreáticas, incluindo a proteína de pâncreas/duodeno homeobox 1+ (PDX1+) células progenitoras pancreáticas. Protocolos convencionais iniciem a diferenciação com pequenas colônias logo após a passagem. No entanto, no estado de colônias ou agregados, as células são propensas a heterogeneidades, que podem dificultar a diferenciação para PDX1+ células. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para diferenciar hPSCs em PDX1+ células. O protocolo consiste em quatro etapas e inicia a diferenciação por semeadura de células únicas dissociadas. A indução de SOX17+ células da endoderme definitivo foi seguido pela expressão de marcadores de tubo dois instintos primitivos, HNF1β e HNF4α e eventual diferenciação em PDX1+ células. O presente protocolo proporciona fácil manuseio e pode melhorar e estabilizar a eficiência de diferenciação de algumas linhas de hPSC que anteriormente foram encontrados para diferenciar de forma ineficiente em linhagens endodermal ou PDX1+ células.

Introdução

O pâncreas é constituído principalmente por células endócrinas e exócrinas, e sua disfunção ou sobrecarga causa várias doenças, como a pancreatite, diabetes e câncer pancreático. Para elucidar a patogenia da pancreatopathy, é necessário analisar o processo de desenvolvimento e função das células do pâncreas. Além disso, um fornecimento estável de celular com qualidade robusta é necessária para estabelecer a terapia de suplementação de célula/tecido. Células-tronco pluripotentes humanas (hPSC)-derivadas de células pancreáticas são uma promissora fonte de células para esses fins, e o protocolo de diferenciação para células pancreáticas tem sido intensamente estudado1,2,3, 4. Avanços recentes na geração in vitro de células β pancreáticas imitam a geração das células β adulto humano e estas células mostrar efeito terapêutico sobre implante em diabético modelo ratos2,3. Além disso, a análise das células β, gerados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) de saudável e tipo 1 diabetes pacientes doadores revelou sem diferenças funcionais, incluindo quando sob estresse5. Além disso, fenótipos de doença foram parcialmente reproduzidos em células pancreáticas induzidas com paciente-derivado iPSCs ou hPSCs, abrigando mutações genéticas no mesmo site que o pacientes6,7.

Para gerar células pancreáticas de hPSCs, é usada gradual diferenciação direcionada que recapitula a processos de desenvolvimento. O pâncreas é derivado da camada endoderme do embrião precoce, que expressa o sexo-determinando a região Y-caixa 17 (SOX17) e forkhead caixa A2 (FOXA2)8. Baseada em estudos de rato, a camada de endodermal forma tubo do intestino primitivo, que é marcado pela expressão do fator nuclear de hepatócito 1-beta (Hnf1β) e fator nuclear de hepatócito 4-alfa (Hnf4α). O tubo do intestino primitivo alonga e desenvolve-se o aparelho respiratório, aparelho digestivo e órgãos. Após o alongamento, a área posterior foregut torna-se região pancreática presuntiva, marcada pela expressão da proteína fator transcricional pâncreas/duodeno homeobox 1 (PDX1)8,9,10. As partes dorsais e ventrais do PDX1+ intestino tubo engrossar para pancreático botões de formulário, que são marcados pela expressão co de pâncreas transcrição fator 1 subunidade alfa (PTF1A) e NK6 homeobox 1 (NKX6.1)8,11. Esta expressão marca o início morfológico de organogênese do pâncreas. As células da endoderme do pâncreas, que são componentes dos brotos pancreáticos, formar uma rede tubular ramificada de estruturas epiteliais12 e eventualmente se diferenciar em células endócrinas e exócrinas, incluindo β-células secretoras de insulina e α-células secretoras de glucagon. Expressão de PDX1 é detectado primeiro na região do pâncreas presuntiva, que então é observada ao longo de todo o desenvolvimento do pâncreas e mostra a localização de células β - e δ9,13,14. Embora o Pdx1+ área de células que expressam não Ptf1a ou Nkx6.1 diferencia em antro gástrico, duodeno, biliar extra-hepática e algumas células intestinais em meio à fase tardia do desenvolvimento em ratos9, PDX1+ as células são consideradas os progenitores do pâncreas a fase inicial do desenvolvimento em seres humanos.

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para diferenciar hPSCs em PDX1+ células para a geração de linhagens no pâncreas. A protocolo inicia diferenciação por semeadura dissociou células únicas15,16,17. Geralmente, hPSCs indiferenciadas são mantidas como colônias ou agregados de células em suspensão ou na adesão. Como resultado, a maioria dos protocolos iniciar a diferenciação logo após a passagem. No entanto, no estado de colônias ou agregados, as células são propensas a heterogeneidades espaciais e transcriptional18,19,20,21,22, que podem dificultar o primeiro passo de diferenciação para a endoderme definitivo seguido de diferenciação ineficiente para PDX1+ células. O presente protocolo pode oferecer fácil manuseio para melhorar e estabilizar a eficiência de diferenciação de algumas linhas de hPSC que anteriormente foram encontradas para diferenciar de forma ineficiente de endodermal linhagens e PDX1+ as células23, 24 , 25.

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Protocolo

Experimentos utilizando hPSCs foram aprovados pelo Comitê de ética do departamento de medicina e pós-graduação faculdade de medicina, Universidade de Kyoto.

1. preparação de materiais

Nota: Prepare todas as mídias e os reagentes para cultura de células em um ambiente estéril. Aquecer a base de meios de cultura à temperatura ambiente (RT) antes do uso. Médio para diferenciação é usada dentro de 6 h em RT. detalhes dos reagentes estão listados na Tabela de materiais.

  1. Diferenciação (figura 1A)
    1. Médio de 1A fase: transferência de meio RPMI 1640 em um tubo com uma pipeta. Adicione o suplemento isento de soro, União A, CHIR99021 e Y-27632 a uma concentração de 1 x, 100 ng/mL, 3 μM e 10 μM, respectivamente.
    2. Médio de estágio 1B: transferir meio RPMI 1640 em um tubo com uma pipeta. Adicione o suplemento isento de soro, A de União e CHIR99021 a uma concentração de 1 x, 100 ng/mL, ≤ 1 μM, respectivamente.
      Nota: A concentração de CHIR99021 deve ser menor do que no meio da 1A fase e além disso não é necessário, mas aumenta o número de células.
    3. Médio de fase 2: meio de transferência melhorada MEM (iMEM) em um tubo com uma pipeta. Adicione o suplemento isento de soro e fator de crescimento de queratinócitos (KGF) a uma concentração de 0,5 x e 50 ng/mL, respectivamente.
    4. Médio de fase 3: transferência iMEM médio em um tubo com uma pipeta. Adicionar o suplemento isento de soro, KGF, NOGGIN, 3-ceto-N-aminoetil-N'- aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (CYC) e ácido 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic (TTNPB), com uma pipeta para concentrações de 0,5 x 50 ng/mL, 100 ng/mL, 0,5 μM e 10 nM, respectivamente.
  2. Citometria de fluxo (FCM)
    1. tampão de permeabilização/lavagem 1X: transferência de água em um tubo por uma pipeta. Adicione tampão de permeabilização/lavagem por uma pipeta para uma concentração de 1 x.
    2. FCM obstrui a solução: 1x tampão de permeabilização/lavagem de transferência em um tubo por uma pipeta. Adicione soro de burro por uma pipeta para uma concentração de 2% (vol/vol).
  3. Immunostaining
    1. Solução de bloqueio: Phosphate-Buffered salina (DPBS de transferência Dulbecco) em um tubo por uma pipeta. Adicione soro de burro e Triton X com uma pipeta para concentrações de 5% (vol/vol) e 0,4% (vol/vol), respectivamente.

2. hPSC diferenciação para Posterior Foregut pancreático/células progenitoras (PDX1 células de+ )

Nota: Realizar todos os procedimentos usando técnicas estéreis. hPSCs são mantidas em placas de 6-poços revestidas por um material sintético de superfície para hPSCs com o hPSC meio de manutenção de acordo com instruções17,26 as indicações do fabricante. Quando células alcançar confluência de 50 a 80% (fase 0) usá-los para diferenciação.

  1. Prepare a membrana basal placas revestidas de matriz.
    1. Transferência de 6 mL de RPMI 1640 (4 °C) em um tubo de refrigeração a 4 °C no gelo. Adicione 2 mg de matriz da membrana basal (4 °C) com pontas de pipeta-mL 1 refrigeração e misture bem pipetando suave para fazer matriz de membrana basal de 0,33 mg/mL.
    2. 2 mL de matriz diluídos membrana basal de transferência a cada poço das placas de cultura de célula 6-poços por uma pipeta. Coloca as placas a 37 °C por 60-90 min em uma incubadora. Depois disso, mantenha as placas RT até uso (dentro de 3 h).
  2. Semente do hPSCs e iniciar a diferenciação a endoderme definitivo (1A fase).
    1. Aspire o meio usado e adicionar 2 mL de ácido etilenodiaminotetracético de 0,5 mM (EDTA) (RT) por alvéolo com uma pipeta para lavar o hPSCs cultivadas nas placas de 6-poços.
    2. Aspirar 0,5 mM EDTA e adicionar 2 mL de 0,5 mM EDTA por alvéolo com uma pipeta. Incube as placas a 37 °C por 5 min.
    3. Aspirar 0,5 mM EDTA e adicione 1 mL de meio de manutenção do hPSC no RT suplementado com 10 μM Y-27632 por bem com uma pipeta. Pipete suavemente, mas rapidamente para explodir fora anexadas células nas placas e para dissociar as células agrupadas em células únicas. Não bolhas a suspensão de eritrócitos durante a pipetagem.
    4. A suspensão de células em um tubo de centrífuga de 50 mL contendo 4 mL de meio de manutenção hPSC em RT suplementado com 10 μM de transferência Y-27632. Pipete suavemente a suspensão de eritrócitos.
    5. Conte o número de células na suspensão de célula usando o procedimento de exclusão de mancha azul Trypan.
      1. Mix 15 μL da suspensão de células e 15 μL de Trypan azul em um tubo.
      2. Transferência de 10 μL da suspensão celular diluída com Trypan azul para célula contando slides em duplicado por uma pipeta de 10 μL.
      3. Contar a célula número com um contador automático de células e calcular a densidade de células na suspensão de célula. Viabilidade é geralmente > 98%.
    6. Alíquota da suspensão de células em um tubo de centrífuga de 50 mL em 1-1.5 x 106 células por poço de placas boas 6 (1-1,5 x 105 células/cm2).
    7. Centrifugar o tubo de 50 mL a 200 x g em RT por 5 min.
    8. Aspirar o sobrenadante com uma pipeta e ressuspender as células com 1 mL de meio de 1A fase (RT) por poço. Delicadamente, pipetar a suspensão de células e adicionar outro 1 mL de meio de 1A fase (total, 2 mL por bem).
    9. Aspire a matriz diluídos da membrana basal dos poços das placas de cultura de células preparadas na etapa 2.1.2 por uma pipeta μL 1.000. Imediatamente para a próxima etapa.
    10. Delicadamente, pipete a suspensão de eritrócitos na etapa 2.2.8 novamente. Imediatamente após a mistura, transferi a suspensão de eritrócitos (2 mL) em cada poço de uma placa de 6. Cubra o prato com uma folha de alumínio para proteger a placa de luz. Coloque a placa no banco limpo no RT para 10-15 min.
      Nota: Não mova a placa após a semeadura.
    11. Delicadamente, coloque a placa em 37 °C, 5% CO2 incubadora (ambiente umidificado) e cultura por 24 h.
      Nota: Não agite a placa após a semeadura.
  3. Induzi a diferenciação em definitivo endoderme (estágio 1B).
    1. Aspire o meio usado e adicionar 2 mL de DPBS nos poços com uma pipeta. Repita a aspiração e a adição de DPBS uma vez.
      Nota: Para remover as células mortas a monocamada, agite suavemente a placa antes de cada aspiração.
    2. Aspirar o DPBS usado por uma pipeta e adicionar 4 mL de meio de fase 1B (37 °C) por poço. Delicadamente, coloque a placa na incubadora 37 °C (umidificada atmosfera de 5% CO2) e cultura por 48 h.
    3. Aspire o meio usado e adicionar 2 mL de DPBS ao poço com uma pipeta. Repita a aspiração e a adição de DPBS uma vez.
      Nota: Remova as células mortas a monocamada por agitação suave antes de cada aspiração.
    4. Aspirar o DPBS usado por pipeta e adicionar 4 mL de meio de fase 1B (37 °C) por poço. Delicadamente, coloque a placa na incubadora (37 °C, umidificada atmosfera de 5% CO2) e cultura por 24 h.
  4. Induzi a diferenciação dentro do tubo do intestino primitivo (fase 2).
    1. Aspire o meio usado e adicionar 2 mL de DPBS ao poço com uma pipeta.
      Nota: Remova as células mortas a monocamada por agitação suave antes de cada aspiração.
    2. Aspirar o DPBS usado por pipeta e adicionar 4 mL de meio de fase 2 (37 °C) por poço. Coloque a placa na incubadora (37 °C, umidificada atmosfera de 5% CO2) e cultura por 4 dias.
  5. Induzir a diferenciação em PDX1+ células (fase 3).
    1. Aspire o meio usado e adicionar 2 mL de DPBS ao poço com uma pipeta. Repita a aspiração e a adição de DPBS uma vez.
    2. Aspirar o DPBS usado por pipeta e adicionar 4 mL de meio de fase 3 (37 °C) por poço. Coloque a placa na incubadora (37 °C, umidificada atmosfera de 5% CO2) e cultura por 3 dias.
  6. Induzi a diferenciação em células endócrinas no pâncreas.
    1. Realize a indução de célula NKX6.1+ (estágio 4, por 8 dias) seguida por indução de células endócrinas (estágio 5, por 12 dias) com protocolos descrito anteriormente3,16,26. Caracterizar e validar a diferenciação de células endócrinas por imunocoloração e análise de (qRT-PCR) reação em cadeia de polimerase transcrição reversa em tempo real quantitativa.
      Nota: Consulte Toyoda et al16 e Kimura et al26 para obter procedimentos detalhados experimentais. Consulte a tabela 1 para sequências da primeira demão, usadas para análise de qRT-PCR.

3. fluxo Cytometry (FCM)

  1. Aspire o meio usado e adicionar 2 mL de 0.5 mM EDTA para o poço com uma pipeta. Repita a aspiração e a adição de 0,5 mM EDTA uma vez.
    Nota: Agite a placa suavemente para remover as células mortas das células monocamadas antes de cada aspiração.
  2. Para dissociar as células (aproximadamente 3-6 × 106 células por poço), adicionar 2 mL de 0,25% Trypsin contendo 0,5 mM EDTA por bem. Incube as placas a 37 °C por 5-10 min.
  3. Pipetar suavemente mas rapidamente para dissociar as células agrupadas em células únicas. Não bolhas a suspensão de eritrócitos durante a pipetagem.
  4. 8-10 ml de meio base (RPMI 1640 ou iMEM, RT) contendo 0,5 x suplemento isento de soro e 10 μM Y-27632 por bem e misturar a suspensão de eritrócitos. Transferi a suspensão de células para um tubo de centrifugação.
  5. Centrifugar o tubo a 300 x g em RT por 5 min.
  6. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células com 2 mL de EDTA (RT) de 0,5 mM. Pipete suavemente a suspensão de eritrócitos.
  7. Centrifugar o tubo a 300 x g em RT por 5 min.
  8. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células com 100 μL de tampão de fixação e permeabilização por 106 células sob um capuz. Pipete suavemente a suspensão de células sob um capuz. Mantenha o tubo no RT por 30 min.
  9. Centrifugar o tubo a 400 x g em RT por 5 min.
  10. Aspirar o sobrenadante sob um capuz e ressuspender as células com solução de bloqueio FCM 500 μL por 106 células. Pipete suavemente a suspensão de eritrócitos. Mantenha o tubo no RT por 30 min.
  11. Transferi 50 µ l de suspensão de células para um tubo (aproximadamente 1 x 105 células). Centrifugar o tubo a 400 x g em RT 5 min. Retire o sobrenadante e ressuspender as células com 100 μL do anticorpo primário diluído (ver Tabela de materiais) na FCM obstrui a solução e incubar a 4 °C para > 16 h.
  12. Centrifugar o tubo a 400 x g em RT por 5 min. Retire o sobrenadante e ressuspender as células com 180 μL de tampão de Perm/lavagem 1X.
  13. Centrifugar o tubo a 400 x g em RT 5 min. Retire o sobrenadante e ressuspender as células com 100 μL do anticorpo secundário diluído (ver Tabela de materiais) na FCM obstrui a solução. Incube as celulas em RT por 60 min ou a 4 °C para > 16 h com proteção da luz.
  14. Centrifugar o tubo a 400 x g em RT por 5 min. Retire o sobrenadante e ressuspender as células com 180 μL de tampão de Perm/lavagem 1X.
  15. Centrifugar o tubo a 400 x g em RT 5 min. Retire o sobrenadante e ressuspender as células com 180 μL de 2% de soro de burro em DPBS.
  16. Filtre a suspensão celular transferindo um 5 ml redonda poliestireno tubo inferior com um filtro de célula (35 µm de malha de nylon) e manter a 4 °C com proteção de luz até a análise.
  17. Analise uma proporção de células coradas positivamente por um citômetro de fluxo27.

4. imunocoloração

  1. Aspire o meio usado e adicionar 2 mL de DPBS ao poço com uma pipeta. Repita a aspiração e a adição de DPBS uma vez.
    Nota: Agite suavemente a placa para remover as células mortas das células monocamadas antes de cada aspiração.
  2. Adicionar 2 mL de paraformaldeído 4% (PFA) (4 °C) por alvéolo com uma pipeta sob um capuz. Manter a placa a 4 °C por 20 min.
  3. Remova o PFA com uma pipeta sob um capuz. Adicione 2 mL de DPBS no RT para o poço com uma pipeta sob um capuz. Repita a aspiração e a adição de DPBS uma vez.
  4. Adicionar 2 mL da solução de bloqueio por bem e manter a placa na RT por 30 min.
  5. Aspirar a solução usada e adicionar 1 mL de anticorpo primário (veja a Tabela de materiais) em solução por alvéolo de bloqueio. Incubar em RT por 60 min ou a 4 °C para > 16 h.
  6. Aspire da solução, adicione 2 mL de DPBS contendo 0,4% Triton X-100 e incubar a RT por 10 min. repetir a aspiração, a adição de solução e incubação de uma vez.
  7. Aspirar a solução usada e adicionar 1 mL de anticorpo secundário (consulte a Tabela de materiais) em solução por alvéolo de bloqueio. Incube a RT por 60 min com proteção da luz.
  8. Aspire da solução, adicione 2 mL de DPBS contendo 0,4% Triton X-100 (RT) e incube a RT por 5 min com proteção da luz. Repita a aspiração, a adição de solução e incubação duas vezes.
  9. Leve micrografias de examinar a eficácia de diferenciação sob um microscópio de fluorescência28.

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Resultados

HiPSCs propagação (585A129,30) são condensados e formar uma monocamada homogênea (figura 1B) que é adequada para diferenciação. HiPSCs indiferenciados (fase 0) são dissociadas e re-semeados como células únicas, a densidade celular baixa (1-1,5 x 105 células/cm2). Dentro de 1 h, as células estão conectadas à placa e começarem a mostrar a protrusão. No dia 1, as células são proliferaram e bem distribuídas para cob...

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Discussão

A geração de PDX1+ células é composto de várias etapas; Portanto, é fundamental para tratar as células no momento oportuno. Entre as medidas, a eficiência de indução da endoderme definitivo em grande parte, afeta a eficiência de indução final, possivelmente por interferência de outras contaminantes linhagem células (ou seja, mesoderme e ectoderme), que podem proliferar e/ou secretam fatores que interromper a diferenciação específica. Se a proporção de SOX17+ células é inferior a 80% no dia 4 (fase 1...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado em parte pelo financiamento da sociedade do Japão para a promoção da ciência (JSPS) através de Scientific Research (C) (JSPS KAKENHI Grant Number15K09385 e 18 K 08510) T.T., e subsídio para JSPS bolsistas de pesquisa (número de concessão KAKENHI de JSPS 17J07622) AK, e a agência de Japão para pesquisa médica e desenvolvimento (AMED) através da sua pesquisa conceder "Núcleo centro para pesquisa de células, a rede de centro de pesquisa para realização de medicina regenerativa de iPS" a K.O. Os autores agradecer Dr. Peter Karagiannis por ler o manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
3-Keto-N-aminoetil-N′-aminocaproyldihydrocinamoil cyclopamineToronto Research ChemicalsK171000CYC
4- [(E) -2- (5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl] -benzoic acidSanta Cruz BiotechnologySC-203303TTNPB
50 mL Tubos de centrífuga cônicos estéreis de polipropilenoThermo Fisher Scientific339652
Anticorpo anti-CDX2 [EPR2764Y]AbcamAb76541Anti-CDX2, × diluição de 1/1000
B-27 Suplemento (50 ×)Thermo Fisher Scientific17504-044Suplemento sem soro
BD FACSAria II Classificador de CélulasBD BiosciencesPara citometria de fluxo
Freezer biomédicoSANYOMDF-U538Para -30 ° C armazenando
lâminas de contagem de células para contador de células TC10 / TC20,vidro de lâmina de contagemde 1450011 BIO-RAD
PLACA MULTIPOÇOS DE CULTURA DE CÉLULAS, 6 POÇOS, PS,Greiner BIO-ONE657165Para cultura de diferenciação/placa de 6 poços
CentrífugaTOMYAX-310Para cultura de células
CentrífugaTOMYMX-305Para RT-qPCR
CHIR99021Axônio MedchemAxônio 1386
BANCO LIMPOSHOWA KAGAKU S-1601PRVBancada limpa
Corning CellBIND Placa de 6 poçosCorning3335Para cultura sem alimentador de hPSCs/placa de 6 poços
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced Corning354230Basement membrane matrix
Corning Synthemax II-SC SubstrateCorning3535Para cultura sem alimentador de hPSCs/material de superfície sintética para hPSCs
CriostatoLeicaLeica CM1510 SPara imunocoloração de agregados.
Kit Cytofix/CytopermBecton Dickinson554714O tampão Perm/Wash é  Tampão de permeabilização/lavagem. O tampão Cytofix/Cytoperm é um tampão de fixação e permeabilização.
Caneta DakoDakoS2002Para imunocoloração de agregados
mistura dNTP (10 mM)Thermo Fisher Scientific18427-088Para RT-qPCR
Anticorpo secundário anti-cabra IgG (H+L) Cross-Adsorbed, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA11055Anticorpo secundário, &vezes; diluição de 1/500
Anticorpo secundário anti-rato IgG (H+L) Altamente adsorvido cruzado, Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA10036Anticorpo secundário, &vezes; diluição de 1/500
Anticorpo secundário altamente adsorvido anti-coelho IgG (H+L) de burro, Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA10040Anticorpo secundário, &vezes; diluição de 1/500
Soro de burroMerck MilliporeS30Soro de burro
D-PBS(-) sem Ca ou MgNacalai tesque14249-95DPBS
Essential 8 MediumThermo Fisher ScientificA1517001Para cultura sem alimentador de hPSCs/hPSC meio de manutenção
Falcon 5 mL Tubo de Ensaio de Poliestireno de Fundo Redondo, com Tampa de Pressão do Filtrode Células Corning352235 Tubode poliestireno de fundo redondo de 5 mL com filtro de célula
Ponta de filtro, 1.000 µ LWatoson124-1000SUse junto com pipetas
Ponta do Filtro, 20 µ LWatoson124-P20SUse junto com pipetas
Ponta de filtro, 200 µ LWatoson124-P200SUse em conjunto com pipetas
Microscópio de FluorescênciaKeyenceBZ-X700Para imunocoloração
Incubadora Forma Steri-Cycle CO2 IncubadoraThermo Fisher Scientific370A
HNF-1β Anticorpo (C-20)Santa Cruz Biotechnologysc-7411Anti-HNF1β, × diluição de 1/200
HNF-4α Anticorpo (H-171)Santa Cruz Biotechnologysc-8987Anti-HNF4α, × diluição de 1/200
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570Para coloração de núcleo, × diluição de 1/200
RNA total do pâncreas humanoAmbionAM7954Para RT-qPCR
Anticorpo humano PDX-1/IPF1R& D SystemsAF2419Anti-PDX1, IgG de cabra, & vezes; 1/200 de diluição
de SOX17 humanoAnticorpo R& D SystemsAF1924Anti-SOX17, × diluição de 1/200
Meio de opção de zinco MEM melhoradoThermo Fisher Scientific10373-017iMEM
Câmara de incubaçãoCosmo Bio10DOPara imunocoloração de agregados
Luvas de exame de látexAdachi
MAS vidro de lâmina revestidoMatsunami Glass83-1881Para imunocoloração de agregados
MicroAmp Placa de reação rápida de 96 poçosApplied Biosystems/Thermo Fisher Scientific4346907para microscópio RT-qPCR
OlympusCKX41N-31PHPPara cultura celular
MicrotubeWatoson131-515CS
Monoclonal Anti-α-FetoproteinSIGMAA8452Anti-AFP, × diluição de 1/200
Nanodrop 8000Thermo Fisher ScientificPara RT-qPCR
Oligo dTFASMACCustom made Oligo Para RT-qPCR de sequência é "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT"
Paraformaldeído, póNacalai tesque26126-54PFA, fixador, diluído em DPBS
Refrigerador farmacêuticoSANYOMPR-514Para 4 ° C armazenando
PIPETMAN P PipetaGILSON
Recombinante Humana KGF/FGF-7R& D Systems251-KGKGF
Cabeça Humana RecombinantePeproTech120-10CNOGGIN
Recombinante Humano/Rato/Rato Activin AR& D Systems338-ACActivin A
ReverTra Ace (100 U/μ L)TOYOBOTRT-101Para RT-qPCR
Conjunto DNase livre de RNase (50)QIAGEN79254Para RT-qPCR
RNeasy Mini KitQIAGEN74104Para RT-qPCR
RPMI 1640 com L-GlnNacalai tesque30264-85RPMI 1640
Filme de vedação para tempo realTakaraNJ500RT-qPCR
10 mLCostar/Corning4488Para cultura de células
Pipetas sorológicas 25 mLCostar/Corning4489Para cultura de células
Pipetas sorológicas 5 mLCostar/Corning4487Para cultura de células
Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAbSinalização celular3579SAnti-SOX2, × diluição de 1/200
StepOnePlusApplied Biosystems/Thermo Fisher ScientificPara RT-qPCR
SucaroseNacalai tesque30406-25Para imunocoloração de agregados
TB Green
Premix Ex Taq II 		TakaraRR820BPara RT-qPCR
TC20 Contador de Células AutomatizadoBIO-RAD1450101J1Contador de Células
Automático Composto OCT Tissue-Tek 4583 Sakura Finetechnical4583Para imunocoloração de agregados
Tissue-Tek Cryomold Moldes/AdaptadoresSakura Finetechnical4566Para imunocoloração de agregados
Triton X-100Nacalai tesque35501-15
Trypan BlueBIO-RAD1450021
Freezer ultrafrioSANYOMDF-U33VPara -80 ° C que armazena
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher Scientific15575-038Dilua com DPBS para preparar 0,5 mM EDTA
Veriti Thermal CyclerApplied Biosystems/Thermo Fisher Scientificpara RT-qPCR
Y-27632Wako251-00514
de câmara dupla transparente de Para pipetas sorológicas

Referências

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