Artigo de método

Deteção de pequena GTPase Prenilação e GTP ligação usando o fracionamento de membrana e ensaio de imunoabsorção ligada de GTPase

DOI:

10.3791/57646

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11 de novembro de 2018

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1Department of Human Anatomy and Cell Science, Rady Faculty of Health Sciences, Max Rady College of Medicine, University of Manitoba, 2Biology of Breathing Theme, Children Hospital Research Institute of Manitoba, University of Manitoba, 3Department of Biochemistry, School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Isfahan University of Medical Sciences, 4Division of Pulmonary, Critical Care, and Sleep Medicine, Department of Internal Medicine, Center for Comparative Respiratory Biology and Medicine, 5Department of Clinical Biochemistry, School of Medicine, Zahedan University of Medical Sciences, 6Department of Molecular Biology, School of Pharmacy with the Division of Laboratory Medicine in Sosnowiec, Medical University of Silesia, 7Centre de biophysique moléculaire - UPR 4301, Centre national de la recherche scientifique (CNRS) CS80054, 8LinkoCare Life Sciences AB, 9College of Nursing and Children's Hospital Research Institute of Manitoba, Rady Faculty of Health Sciences, University of Manitoba, 10Health Policy Research Center, Institute of Health, Shiraz University of Medical Sciences

Neste artigo

Resumo

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Aqui descrevemos um protocolo para investigar a Prenilação e guanosina-5'-trifosfato (GTP)-carregamento de GTPase. Esse protocolo consiste em dois métodos detalhados, nomeadamente o fracionamento de membrana e uma GTPase-lig da imunoabsorção do ensaio. O protocolo pode ser utilizado para medir a Prenilação e GTP carregamento de diferentes outras GTPases pequenas.

Resumo

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A família de GTPase pertence à superfamília de Ras e inclui aproximadamente 20 membros em seres humanos. As GTPases Rho são importantes na regulação das diversas funções celulares, incluindo a dinâmica do citoesqueleto, motilidade celular, polaridade da célula, orientação axonal, tráfico vesicular e controlo do ciclo celular. Mudanças na sinalização de GTPase desempenham um papel essencial de regulamentar em muitas condições patológicas, tais como câncer, doenças do sistema nervoso central e doenças do sistema imunológico-dependente. A modificação pós-traducional de vinculação de GTP e GTPases Rho (ou seja, Prenilação por intermediários de via do mevalonato) são fatores-chave que afetam a ativação desta proteína. Neste trabalho, dois métodos simples e essenciais são fornecidos para detectar uma gama ampla de GTPase Prenilação e atividades de vinculação de GTP. Detalhes dos procedimentos técnicos que têm sido utilizados são explicadas passo a passo neste manuscrito.

Introdução

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As GTPases Rho são um grupo de pequenas proteínas (21-25 kDa), que são bem conservadas ao longo da evolução e formar uma única subfamília na superfamília de Ras de pequenas GTPases. Cada subfamília dentro desta superfamília, há um núcleo de domínio compartilhado G que está envolvido na atividade GTPase e nucleotídeos troca1. A diferença entre a família Rho e as outras subfamílias de Ras é a presença de um "domínio de inserção de Rho" dentro da vertente β 5th eth 4 hélice α no pequeno domínio GTPase2.

Com base na classificação recente, as GTPases Rho são consideradas uma família de proteínas que se encaixam a superfamília de Ras GTPase3de sinalização. Mamíferos GTPases Rho tem 22 membros com base em sua função específica e caracterização geral4 em que RhoA, Rac1 e Cdc42 estão entre os membros mais estudado neste grupo. As GTPases Rho estão ligadas intracelular sinalização percursos através de um mecanismo rigidamente regulamentado, que é dependente de interruptores molecular através de modificações do posttranslational proteína5.

GTP carregando hidrólise mecanismos essenciais no ciclo de ativação/desativação de pequenas GTPases Rho e são regulamentados através de proteínas GTPase-ativando (lacunas). As lacunas são responsáveis para a hidrólise de GTP e trabalham em conjunto com guanina nucleotídeo troca fatores (GEFs) que são responsáveis para a reação de GTP-carregamento. Inibidores de dissociação de Rho PIB (GDIs) fornecem mais regulamento de pequenas GTPases Rho através de ligação para o PIB-limite Rho GTPases. Isto inibe a dissociação do PIB e facilita o sequestro de pequenas GTPases Rho longe de sites a membrana intracelular ativa. Há também mais Regulamento das proteínas de GTPase envolvendo a Prenilação de GDIs que regula tanto a hidrólise de nucleotídeos e troca e controles PIB/GTP ciclismo1,6,7,8.

Tanto GTP-carregamento Prenilação de GTPase são envolvidos no movimento de GTPase entre citosol e membranas celulares, alterando as propriedades lipofílicas destas proteínas1,9. Os reguladores acima referido interagirem com fosfolipídios da membrana celular e outras proteínas modulação do PIB/GTP troca atividade10. Além disso, GDIs, inibidores de dissociação, bloqueiam tanto a hidrólise de GTP e a troca GDP/GTP. GDIs inibir a dissociação das proteínas Rho inativas do PIB e, portanto, sua interação com a jusante efetores. GDIs também regular o ciclismo de GTPases entre o citosol e a membrana na célula. A atividade de GTPases Rho depende em grande medida seu movimento para a membrana da célula; assim, GDIs são considerados como reguladores críticos que podem sequestrar as GTPases no citoplasma através de esconder sua região hidrofóbica/domínios11,12.

Para ter uma ótima sinalização e função em todas as fases do seu ciclo de ativação de GTPase, o ciclo dinâmico da hidrólise de GTP-carregamento/GTP é crucial. Qualquer tipo de alterações neste processo pode resultar em alterações subsequentes na célula funções regulamentadas de GTPase, tais como célula polaridade, proliferação, morfogênese, citocinese, migração, adesão e sobrevivência13,14.

O protocolo atual oferece aos leitores com um método detalhado para monitorar pequeno RhoA GTPase ativação através de investigação de suas Prenilação e PIB/GTP de carregamento. Esse método também pode ser usado para detectar a Prenilação e vinculação de GTP de uma vasta gama de pequenas GTPases. A GTPase de imunoabsorção pode ser usada para medir o nível de ativação de outros tipos de GTPases, tais como Rac1, Rac2, RAP3, H, K ou N-Ras, Arf e Rho15. A agente farmacológico sinvastatina é usada como um exemplo, como recentemente foi relatado para ser envolvido na regulação do pequeno de GTPase Prenilação e atividade8,9,14,16.

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Protocolo

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1. determinação da localização de RhoA usando membrana/citosol fracionamento

  1. Tratamento com células cultura e sinvastatina
    1. Semente de 50.000 de U251 células em um 100 mm prato e cultura-los em Dulbecco modificado médio da águia (DMEM) (alta glicose, 10% de soro fetal bovino [FBS]).
    2. Quando 30% confluente, tratar as células, removendo o meio e acrescentando que contêm simvastatin médio-lhe (10 µM de sinvastatina dissolvida em Dimetilsulfóxido [DMSO]) e incube por 36 h a 37 ° C8. Uso de DMSO sozinho como um controle de veículo.
      Nota: 10 milhões de células são necessárias para o fracionamento do citosol e membrana das células.
  2. Coleção de células
    1. Remova as células da incubadora a 37 ° C. Olhe para as células sob um microscópio para confirmar a confluência.
      Nota: As células devem ser confluente de 70-80%.
    2. Aspire o meio, lavar as células 1 x com frio fosfato salino (PBS). Adicionar 5 mL de tampão de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) o ácido (KCl: 400 mg/L, NaCl: 6800 mg/L, NaHCO3: 2200 mg/L, NaH2PO4. H2O: 140 mg/L, D-glicose: 1.000 mg, dissódico EDTA: 373 mg/L) por placa e lugar as células de volta para a incubadora de 37 ° C por 5 min.
    3. Depois de 5 min. de incubação, colete o EDTA com as células em um tubo de 15 mL contendo a mesma quantidade de meio como EDTA.
      Nota: Ter médio no tubo neutraliza o EDTA e impede qualquer digestão mais das membranas celulares.
    4. Colocar o tubo em uma caixa de gelo e prossiga para a centrífuga.
    5. Configurar o centrifugador para 1.500 x g a 4 ° C e girar as células por 5 min.
    6. Remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento e adicione 1 mL de PBS frio. As células se misturam bem.
    7. Transfira a mistura de célula (solução) para um novo tubo de 1,5 mL, centrifugar a 1.500 x g a 4 ° C e girar as células por 5 min.
    8. Verificar o tamanho da pelota (para estimar o volume da reserva para o próximo passo). Coloca as amostras no gelo. Desprezar o sobrenadante completamente sem perturbar o sedimento.
    9. Adicionar tampão gelada (10 mM Tris-HCl [pH 7,5], 0,1 mM EDTA, EGTA de 0,1 mM, 1mm ditiotreitol e coquetel de inibidor de protease), misturar as amostras bem pipetando para cima e para baixo e em seguida, proceder à sonication.
  3. Sonication
    1. Definir o sonicador de cinco ciclos, 5 s cada e repita 3x.
    2. Execute o sonication no gelo. Prossiga para o se.
      Nota: Gelo e fria condição preservar as proteínas e tornar os resultados mais confiáveis.
  4. Ultracentrifugação
    1. Use um se separar a célula homogenates em citoplasmática e fracções de membrana. Definir o centrifugador para 100.000 x g durante 35 minutos a 4 ° C. Como mostrado na Figura 1, verificar o tamanho da pelota.
      Nota: A fração de membrana é na parte inferior do tubo e o resto é outros componentes citoplasmáticos.
    2. Recolha o sobrenadante completamente, tomando cuidado para não perturbar a pelota. O sobrenadante é a fração citosólica. Coloque o sobrenadante em um tubo recém rotulado.
    3. Adicionar 300 µ l de tampão de dissociação (amortecedor II) (50 mM Tris-HCl [pH 7,5], 0,15 M NaCl, 1mm ditiotreitol, SDS 1%, 1 mM EDTA, 1mm EGTA e coquetel de inibidor de protease) ao pellet (contém a fração de membrana). Misture bem pipetando para cima e para baixo.
    4. Proceda à determinação da proteína e preparação da amostra de borrão ocidental (análise de immunoblot).
  5. Immunoblotting
    1. Prepare a proteína de célula extratos de frações separadas em tampão de lise (20 mM Tris-HCl [pH 7,5], 0.5 mM PMSF, detergente não-iônico de 0,5%-40, 100 µM β-glicerol-3-fosfato e 0,5% inibidor da protease cocktail).
    2. Medir a concentração de proteína usando o método de Lowry8 e calcular o volume de lise (20 mM Tris-HCl [pH 7,5], 0.5 mM PMSF, 0,5% de detergente nondenaturing, octylphenoxypolyethoxyethanol, 100 µM β-glicerol-3-fosfato e 0,5% coquetel de inibidor de protease) para normalizar a concentração de proteína entre as amostras.
    3. Aquecer as amostras a 90 ° C por 5 min e 15-20 µ l das amostras em um gel de SDS-PAGE de 15% para separar as proteínas de carga.
      Nota: Carga de 1 µ g de proteína para cada amostra. Calcule o volume que precisa ser executado em conformidade.
    4. Transferi as proteínas separadas para membranas de nylon sob reduzir condições (500 nM glicina, 50 mM Tris-HCl e 20% metanol) por 2h, à temperatura ambiente (RT) a 100 V.
      Nota: Para confirmar a transferência bem-sucedida de proteína, use Ponceau mancha ou visualizar o marcador de proteína na membrana.
    5. Bloquear as membranas com leite em pó desnatado 5% e 1 x salino Tris contendo o detergente (TBS/0.01% detergente não iônico; TBST) para bloquear a ligação de anticorpos inespecíficos a 4 ° C durante a noite ou em RT por 1h.
    6. Acrescente os anticorpos primários para análise de immunoblotting e incubar durante a noite a 4 ° C.
      Nota: Neste experimento, Rac1/2/3, cdc42, RhoA, GAPDH e pancaderina foram usados em uma diluição de 1:1,000 em leite de 1% em 1 x TBST. Pancaderina e GAPDH foram usados para confirmar a membrana e pureza de fração citosólica, respectivamente.
    7. Lave as membranas 3 x com um tampão de lavagem com 1 x TBST por 20 min.
    8. Incubar as membranas com peroxidase de antirábano coelho (HRP)-anticorpo secundário conjugado para os respectivos anticorpos primários (para 1 h, a RT).
    9. Lave os borrões 3x por 20 min e desenvolvê-los com deteção melhorada quimioluminescência (ECL).

2. medição da carga de GTP de RhoA usando um ensaio pequeno G-proteína de ativação

  1. Contagem de 10.000 células/mL e cultura as células U251 100mm prato.
  2. Quando eles são 30% confluente, trate as células com sinvastatina, conforme descrito na etapa 1.1.2.
  3. Leva os pratos de cultura fora da incubadora. Olhe para as células ao microscópio para confirmar a confluência. Certifique-se de que as células são 70% - 80% de Confluencia. Coloque o prato de Petri no gelo, aspirar a mídia e lavar as células 3 x com gelada PBS (pH 7,2).
  4. Aspire a PBS. Incline o prato de Petri no gelo por um minuto adicional remover todos os restos de PBS.
    Nota: PBS Residual afeta negativamente neste ensaio.
  5. Lise as células em um volume de 700 µ l de tampão de Lise gelada contendo inibidores de protease e fosfatase.
    Nota: 700 µ l é geralmente suficiente para uma placa de Petri de 100mm. Consulte a tabela 1 para encontrar o volume adequado para cada navio de cultura.
  6. O lisado celular da colheita com o raspador de célula. Incline o prato de cultura para esta técnica.
  7. Transfira o lisado para um rotulado criotubo gelado e mantê-lo no gelo.
  8. Misture cuidadosamente usando um vórtice. Manter 10 µ l do lisado para o ensaio da proteína, para medir a concentração de proteína na amostra.
  9. Snap-congelar as células restantes lisado em nitrogênio líquido.
    Nota: Prepare várias alíquotas de lisado antes do snap-congelamento-los, para evitar os ciclos de congelamento/descongelamento repetidos que podem levar à perda da atividade de RhoA GTPase celular.
  10. Transferir o cryotubes snap-congelado para um freezer-80 ° C e armazenar as amostras para o teste de imunoadsorção de GTPase.
    Obs.: Não armazene as amostras durante mais de 14 dias. Trabalhar rapidamente e nunca deixe as amostras no gelo por mais de 10 min. Nunca manipular todos os pratos de Petri simultaneamente.
  11. Medir a concentração de proteína usando o método de Lowry8 e calcular o volume da lise para normalizar a concentração de proteína entre as amostras.
    Nota: A melhor concentração geralmente é de 1 mg/mL; no entanto, 0.3 - 2 mg/mL pode ser detectável.
  12. Prepare um controle em branco, acrescentando 60 µ l de tampão de Lise e 60 µ l de tampão de ligação para um microtubo.
    Nota: O controle em branco tem todos os reagentes, exceto o antígeno e é usado para a subtração do fundo.
  13. Prepare um controlo positivo, acrescentando 12 µ l de proteína de controle Rho, 48 µ l de tampão de Lise e 60 µ l de tampão de ligação.
    Nota: O controlo positivo tem todos os reagentes mais um antígeno confirmado para Rho-A-GTP.
  14. Levar o prato de afinidade de Rho fora de seu saco e coloque-o no gelo.
  15. Dissolva o pó em poços com 100 µ l de água destilada gelada. Manter a placa no gelo.
  16. Descongele os lysates célula snap-congelado em um banho de água situado a 25 ° C.
  17. Adicione o volume calculado de Lise gelada (da etapa 2.11) para cada amostra para normalizar a concentração de proteína.
    Nota: Retire a PBS após lavar as células (usando um aspirador de tubo de vácuo) para evitar causando alterações na composição da lise. Equalize a proteína de amostra para uma concentração entre 0,8 e 2 mg/mL para uma comparação exata entre as amostras em ensaios de ativação GTPase. A tabela 2 fornece detalhes sobre a reserva a ser utilizado para este teste.
  18. Transferir 60 µ l das amostras geladas normalizadas para microtubos e adicionar 60 µ l de binding buffer; Homogeneizar as amostras e mantê-los no gelo.
  19. Remova completamente as água/soluções de microplate por agredir vigorosa, seguido por cinco a sete torneiras difícil num tapete de laboratório.
  20. Adicione 50 µ l de amostras normalizadas, um controle em branco e um controlo positivo nos poços em duplicatas.
  21. Coloque a placa em um agitador orbital por 30 min a 4 ° C a 300 rpm.
    Nota: A etapa de agitação é muito importante, e é recomendável usar o agitador orbital placa a 300 rpm.
  22. Limpar as amostras da placa por agredir e lavá-los 2 x com 200 µ l de tampão de lavagem em RT. vigorosamente remover o tampão de lavagem dos poços depois de cada lavagem, passando rapidamente, seguido por rosqueamento e manter a placa no banco no RT
  23. Adicionar 200 µ l de tampão de apresentadoras RT a cada poço e incubar a RT por 2 min.
  24. Agite a solução dos poços e lavar os poços 3 x com 200 µ l de tampão de lavagem em RT
  25. Adicione 50 µ l de acabadas anticorpo primário anti-RhoA de 1/250 a cada poço.
  26. Coloque a placa em um agitador orbital por 45 min a 300 rpm definido como 25 ° C. Agite a solução do poço.
  27. Repita as etapas de lavagem 2 x (etapa 2.24).
  28. Adicione 50 µ l de acabadas anticorpo secundário anti-RhoA de 1/250 a cada poço.
  29. Coloque a placa em cima de um agitador orbital por 45 min a 300 rpm definido como 25 ° C.
  30. Preparar o reagente de detecção HRP misturando volumes iguais de Reagente A e do reagente B.
  31. Agite a solução de cada poço e lavar os poços 3 x com 200 µ l de tampão de lavagem em RT
  32. Adicione 50 µ l de reagente de deteção de HRP preparada para cada poço.
  33. Leia o sinal luminescente dentro de 3-5 min para obter o máximo sinal e analisar os resultados usando um pacote de software apropriado.
    Nota: As leituras devem ser tomadas dentro de 3-5 min para obter o máximo sinal. Executar uma placa de"teste" para confirmar a Lise adequada volume de tampão está sendo usado para os lisados celulares para que a concentração de proteína é alta o suficiente para detectar atividade de RhoA GTPase. (Uma placa de teste é um prato de células usado para determinar se a concentração de proteína está dentro do intervalo aceitável e, também, para determinar se o volume da lise sendo usado é apropriado). O controle positivo deve ler 4 - a 10 vezes mais alto que os poços em branco se for no intervalo linear. Se não, em seguida, ajuste o luminómetro consultando o fabricante. As configurações para o luminómetro são dadas na tabela 3.
  34. Insira os dados brutos nas colunas onde os títulos leia amostra, quer dizer, desvio padrão, rep1, rep2, rep3e rep4, que é para mostrar o número de repetições a ser feito em cada amostra.
  35. Em dizer, insira a fórmula =average(Xn:Yn) onde X = o designador de coluna para rep1, Y = o designador de coluna para rep4e n = o designador de linha da linha sendo trabalhado.
  36. Em desvio-padrão, insira a fórmula = DESVPAD (Xn:Yn) onde X = o designador de coluna para rep1, Y = o designador de coluna para rep4e n = o designador de linha da linha sendo trabalhado.
  37. Entra os replicar dados em rep1, rep2, etc.
  38. Depois de inserir os dados, use o método de clique e arraste para selecionar a amostra, quer dizere desvio padrão.
  39. Em software de análise de dados, selecione a função para o gráfico, fazendo que se parece com um quadrado com um gráfico de barras mini dentro.
    Nota: Isso traz o gráfico tornando processo onde é possível aos gráficos de desenho baseados nos dados inseridos.
  40. Escolher o gráfico de colunas e valores de entrada, designar os números de dizer .
    Nota: O gráfico para os números de dizer é feito primeiro, e em seguida, a coluna de desvio padrão para as barras de erro do eixo y é designada. Para fazer isso, clique duas vezes em barras de gráfico, selecione a guia de erro do eixo y , clique a opção personalizada e selecione a área da planilha digitar a localização dos dados do desvio-padrão . A diferença entre os grupos que precisam ser comparados pode ser vista após a criação dos gráficos desejados.

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Resultados

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Fracionamento de membrana:

Ultracentrifugação foi usada para o fracionamento dos componentes de membrana e citoplasma. Como mostrado na Figura 1, o sobrenadante contém a fração citosólica e o sedimento contém a fração de membrana. A abundância de RhoA em andmembrane citosólica frações obtidos de células U251 foi examinada após o tratamento com sinvastatina usando immunoblotting. A p...

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Discussão

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Aqui nós descrevemos um método exato para medir pequena GTPase Prenilação e vinculação de GTP mostrado como pequena GTPase Localização subcellular (membrana contra citosol) e Rho GTP carregando. As GTPases pequenas são expressos em células eucarióticas e desempenham um papel essencial na proliferação celular, mobilidade e estrutura. Ambos Prenilação e vinculação de GTP estão envolvidos na regulação da atividade GTPase; Portanto, os ensaios para avaliar a Prenilação e vinculação de GTP destas proteínas são ferram...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Saeid Ghavami foi apoiado por uma saúde ciência centro operacional Grant, CHRIM funcionamento grant e Manitoba novo investigador operando bolsa de investigação. Javad Alizadeh foi apoiado pela bolsa de estudo de pesquisa de Manitoba. Shahla Shojaei foi apoiado por uma subvenção de funcionamento de fundação de ciência saúde e a sociedade pós-doutorada MITACS acelerar. Adel Rezaei Moghadam foi apoiado por um NSERC operacional de concessão que foi realizada por Joseph W. Gordon. Amir r. Zeki foi apoiado pelo prêmio NIH/NHLBI K08 (1K08HL114882-01A1). Marek J. Los gentilmente reconhece o apoio do NCN conceder #2016/21/B/NZ1/02812, apoiado por LE STUDIUM Instituto de estudos avançados (região centro-Val de Loire, França) através do seu programa geral de vale de Loire esperto e co-financiado pela Marie Acções de Sklodowska-Curie, grant #665790. Simone da Silva Rosa foi apoiada pela bolsa de estudo UMGF.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
DMEM alta glicoseVWR (Canadá)VWRL0101-0500
Soro fetal bovinoVWR (Canadá)CA45001-106
Penicilina/estreptomicinaVWR (Canadá)97062-806
EDTA (ácido etilenodiamina tetracético)VWR (Canadá)CA71007-118
EGTA (etilenoglicol bis(2-éter aminoetílico)-N,N,N',N'- ácido tetraacético)VWR (Canadá)CAAAJ60767-AE
DTT (DL-Ditiotreitol)VWR (Canadá)CA97061-340
Persulfato de amónioVWR (Canadá)CABDH9214-500G
Tris-hidroximetilaminometanoVWR (Canadá)CA71009-186
Solução de acrilamida/bis a 30%Biorad (Canadá)1610158
TEMEDBiorad (Canadá)1610801
coquetel de inibidor de proteaseSigma/Aldrich (Canadá)P8340-5ML1:75 diluição
Rho-GTPase Kit deamostrador de anticorpos Sinalização celular (Canadá)9968diluição 1:1000
Pan-Caderina anticorpoCell Signaling (Canadá)4068diluição 1:1000
anticorpo GAPDHSanta Cruz Biotechnology (EUA)sc-69778diluição 1:3000
Ensaio de ativação RhoA G-LISA (formato de luminescência)Cytoskeleton Inc. (EUA)BK121Citoesqueleto I. G-LISA Guia Técnico de Ensaios de Ativação. 2016.RhoA
AnticorpoCelular Sinalização2117
ECLAmersham-Pharmacia BiotechRPN2209
Anti-Rabbit IgG (molécula inteira) Anticorpo PeroxidaseSigmaA6154-1ML
SpectraMax iD5 Multi-Mode MicroplateReader Molecular Devices 1612071AEspectrofotômetro
Nonidet P-40Sigma11332473001detergente não desnaturante, octilfenoxipolietoxietanol
DMSOSigmaD8418-50ML
PBSSigmaP5493-1L
Inibidor de fosfatase coquetelSigmaP5726-5ML:75 Diluição
1

Referências

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