Novo método de entrega de DNA do plasmídeo para Mouse bexiga Urotélio por eletroporação

Modelos do rato geneticamente modificados (GEMMs) têm jogado um papel essencial em expandir o nosso conhecimento sobre o desenvolvimento animal, gene funções in vivoe mecanismos de progressão de doença^1,2. GEMMs do germline tradicionalmente são desenvolvidos de duas maneiras. A primeira é a criação de ratos transgênicos por injeção pró-nuclear do plasmídeo de DNA seguido a transplantação de zigotos pseudopregnant mulheres. A outra é a geração de batida-para fora/TOC-em ratos por recombinação homóloga em células-tronco embrionárias e o desenvolvimento de quimeras. Nocaute condicional de genes num tipo específico de tecido ou célula de interesse envolve a criação de alelos geneticamente modificados com Cre e flox sites para várias gerações. Todo o processo pode ser caro e demorado, especialmente se o objetivo é atingir múltiplos genes tecido-especificamente. Recentemente, tecnologias de edição de gene como clusterizadas regularmente intercaladas curtas palíndromos repetições (CRISPR) foram aplicadas aos vários órgãos dos ratos para induzir alterações genéticas de tecido-específica para o cancro autóctone modelagem^{3, 4,5,6,7} ou doença correta mutações em situ^8,9. Nesses estudos, a entrega dos vetores gRNA geralmente foi conseguida através de adenovírus ou particulas de Lentivirus infecção do órgão ou injeção de cauda-veia hidrodinâmica. A relativa facilidade de entrega dos componentes CRISPR para o pulmão e o fígado tem melhorado muito a conveniência e eficiência de câncer nesses órgãos em comparação com os modelos tradicionais de rato Cre-Lox com base de modelagem.

O bexiga Urotélio é onde a maioria dos tumores de bexiga são originários. A entrega dos vetores de DNA para a bexiga Urotélio para terapia de modelagem ou o gene do câncer é dificultada por uma camada de glicosaminoglicano na superfície apical urotelial, que age como uma barreira para a aderência do vírus infeccioso^10,11. Vários agentes de pré-tratamento como Syn3 e o dodecil-β-d-maltoside tem sido utilizados para romper essa barreira e melhorar adenovírus infecção eficiência^12,13,14. Se o vírus adeno-associado (AAVs) efetivamente podem infectar a bexiga não foi relatado. Em geral, um método de entrega com base não-virais seria desejável. Aqui, descrevemos um método inovador desenvolvido no laboratório para entrega eficiente do plasmídeo de DNA para o Urotélio rato através de cateterismo de uretra e eletroporação. Porque a nossa abordagem não implica pré-tratamento químico da camada glicosaminoglicano ou produção de vírus, significativamente simplifica a entrega de plasmídeos de DNA no rato Urotélio de bexiga e deve facilitar estudos em vivo doenças da bexiga.

Todos os procedimentos descritos aqui foram realizados em conformidade com as diretrizes e normas da institucionais Cuidado Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade da Califórnia em Santa Cruz.

1. plasmídeo e preparação de ferramentas

1. Para cada bexiga transfect, preparar pelo menos 20 µ l de DNA do plasmídeo (1 µ g / µ l).
2. Adicione 1 µ l de Trypan azul para a 20 µ l de solução de plasmídeo em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Pipeta para misturar bem.
3. Autoclave cirúrgica todos os instrumentos e esterilizar a área de trabalho com 70% de etanol. Spray instrumentos cirúrgicos e luvas com etanol a 70% com frequência ou usar um esterilizador de grânulo de vidro ao executar as seguintes etapas para manter condições estéreis.

2. médico-Légal Animal

1. Use um sistema de anestesia superior de tabela para anestesiar o animal com isoflurano. Ligue o tanque₂ O e ajuste o medidor de fluxo de oxigênio para 1 L/min.
2. Coloca um rato adulto de C57BL/6J feminino na câmara de indução. Ativar e ajustar o vaporizador de isoflurano para 3% para a indução. O mouse deve estar em anestesia dentro de 2 min. administrar analgésico de buprenorfina (0,1 mg/kg) por via subcutânea após a remoção do mouse da câmara de indução para analgesia preemptiva.
   Nota: No presente protocolo, ratos fêmeas são usados, porque são mais fáceis de trabalhar com durante cateterismo de uretra. O protocolo também funciona para ratos masculinos, mas um cuidado adicional é necessária ao executar a etapa 3.
3. Aplica a pomada oftálmica nos olhos do animal para evitar ressecamento. Coloque o mouse anestesiado virado para cima sobre uma almofada de aquecimento com seu nariz do cone de nariz. Gire o interruptor de circuito de ar para soltar isoflurano através do cone de nariz.
4. Conter a cabeça e o cone de nariz com fita adesiva. Ajuste o vaporizador de isoflurano para 2% para manutenção.
5. Conter os membros com fita adesiva. Realize testes de dedo-pinch para certificar-se de que o animal está em anestesia profunda e em seguida, raspar a região abdominal.

3. urina depleção e lavagem da bexiga

1. Aplique lubrificante ao cateter (24G, comprimento de 2,11 cm, diâmetro externo de 0,045 cm) e certifique-se de que sua superfície externa é totalmente coberto.
2. Insira o cateter na abertura da uretra e lentamente empurre-os até atingir a bexiga, momento em que a urina deve fluir através do cateter. Pressione suavemente o abdômen para ajudar a depleção de urina.
   1. Verifique se o cateter é inserido corretamente a bexiga, observando a urina automática out-fluxo. Evitar a perfuração da parede da uretra e da bexiga e aplique o lubrificante várias vezes se necessário.
3. Descarte a urina com uma pipeta para um copo de resíduos.
4. Pipete 80 µ l de soro de tampão fosfato (PBS) para a extremidade externa do cateter, com a outra extremidade ainda na bexiga. Cuidadosamente, anexe uma seringa de 1 mL para o cateter. Empurre suavemente a seringa para injetar a PBS para a bexiga. Embora alguns PBS o cateter para evitar a criação de bolhas de ar na bexiga.
5. Remova a seringa. Espere para PBS drenar para fora da bexiga. Pressione suavemente o abdômen para evacuar PBS.
6. Descarte a PBS o cateter com uma pipeta para o copo de resíduos.
7. Repita PBS lavagem (etapas 3.4-3.6) para mais duas vezes.
   Nota: É essencial trabalhar suavemente durante estas etapas de lavagem. Sangue no cateter ou falhas de automatic out-fluxo de líquido geralmente indica a uretra é perfurada através de. Também é importante evitar a introdução de bolhas de ar, como eles irão diminuir a eficiência de eletroporação.

4. plasmídeo entrega

1. Aplicar o etanol a 70% no abdômen do mouse e usar um bisturi para fazer uma incisão vertical de 1 cm para abrir a pele abdominal acima da bexiga.
2. Pipetar pelo menos 20 µ l de solução de azul de Trypan além de plasmídeo a extremidade externa do cateter e aplique a seringa.
3. Injete a solução de plasmídeo da bexiga. Se a bexiga ficar azul, a injeção é bem sucedida. Deixe algum líquido no cateter para evitar a criação de bolhas de ar na bexiga.
4. Pegue o orifício uretral externo usando uma pinça e em seguida, retire o cateter e a seringa. Use uma sequência de caracteres para apertar o orifício uretral externo. Faça dois loops com a sequência de caracteres e em seguida amarre com dois nós.
   Nota: Aperto do uretral é importante para prevenir o refluxo de líquido do plasmídeo.
5. Liga o gerador de eletroporação com os seguintes parâmetros: 33V, 50 ms de tempo de trabalho e tempo de intervalo de ms 950.
6. Segurar a bexiga com uma pinça e comprima a bexiga com dois eletrodos. Pressione o pedal para executar a eletroporação.
   Nota: Os impulsos elétricos são definidos para ocorrer 5 vezes com intervalos curtos após cada impulso pedal. O mouse pode contorcer-se neste processo. Empurrar o pedal mais uma vez que pode aumentar a eficiência de entrega, mas também muitos pulsos elétricos podem danificar a integridade do tecido do Urotélio.
   1. Evite qualquer contacto entre a pinça e os eletrodos, como isso irá gerar uma faísca.

5. recuperação

1. Suture a abertura abdominal e pele com esterilizados para suturas cirúrgicas e clipes. Aplica iodo sobre o ferimento.
2. Retire o animal do sistema de isoflurano. Administre analgésico buprenorfina (0,1 mg/kg) por via subcutânea para aliviar a dor pós-cirúrgica.
3. Manter o animal sobre a almofada de aquecimento e devolvê-lo para a gaiola em casa depois da recuperação completa. Verifique se o animal pelo menos uma vez por dia para mobilidade normal, beber e alimentar comportamentos e sem sinais de infecção até que a incisão é curado e remova os grampos. Administre injeções subsequentes de buprenorfina analgésico se o animal exibe sintoma de dor, tais como reduzida aliciamento, aumento da agressividade e vocalização.

Para demonstrar o sucesso da entrega do gene para a bexiga Urotélio, usamos o plasmídeo de15 pCAG-GFP para eletroporação. 20 µ l de solução de azul de Trypan e plasmídeo foi injetado através da uretra e 5 pulsos elétricos foram administrados. Após 48 h, nós dissecado a bexiga de rato e observadas manchas de fluorescência de GFP sob um microscópio de fluorescência de dissecação, Considerando que um negativo controlar a bexiga que não sofreu electroporation não mostrou nenhum sinal GFP (figura 1A). Quando realizamos a mancha da imunofluorescência de tecidos da bexiga seccionado com citoqueratinas (CK) 5, CK18, e anticorpos GFP, encontramos que a GFP sinal estava presente no guarda-chuva, intermediária e células basais, mas não no músculo da camada (figura 1B), indicando boa especificidade da entrega do plasmídeo no Urotélio. Aproximadamente 15% das células uroteliais são GFP+, e tal natureza clonal deve ser ideal para câncer modelagem desde tumores geralmente iniciar de células individuais.

Figura 1: sucesso na entrega do plasmídeo pCAG-boas práticas agrícolas para o rato bexiga Urotélio. (A) comparação de uma bexiga que foi submetido a eletroporação (à direita) para uma bexiga de controlo negativo (à esquerda), mostrando que electroporation ficou com êxito a bexiga verde. Imunofluorescência (B) a coloração dos tecidos bexiga seccionado, mostrando o padrão de expressão de mosaico de células GFP+ no guarda-chuva (CK18+), intermediário (CK5+CK18+) e basal (CK5+) camadas urotelial. Barra de escala em A corresponde a 1 mm e em B 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não declaram nenhum interesse de concorrente.