Novo método de entrega de DNA do plasmídeo para Mouse bexiga Urotélio por eletroporação
3 de maio de 2018
Nós descrevemos um método novo para a entrega do plasmídeo de DNA em células uroteliais do rato bexiga na vivo através de cateterismo de uretra e eletroporação. Oferece uma maneira rápida e conveniente para gerar modelos de rato autóctone de doenças da bexiga.
O objetivo geral deste método é entregar plasmídeos de DNA no urotélio da bexiga de camundongos vivos in vivo para superexpressão gênica ou edição do genoma. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do câncer de bexiga, como como diferentes mutações genéticas promovem a progressão do câncer de bexiga? A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece uma maneira rápida e conveniente de entregar genes na bexiga sem as preocupações de segurança e barreiras técnicas associadas aos vetores virais.
Tive a ideia para esse método de tentar usar qualquer vírus associado projetado para entrega de DNA, o que não funcionou bem na bexiga. A implicação dessa técnica também pode se estender à terapia gênica porque a eletroporação pode alcançar a entrega eficiente de plasmídeos de DNA nas células uroteliais. Demonstrando o procedimento estarão Ofir Stefanson e Yueli Liu do meu laboratório.
Para iniciar este procedimento, autoclave todos os instrumentos cirúrgicos e esterilize o espaço de trabalho com etanol a 70%. Pulverize instrumentos cirúrgicos e luvas com etanol 70% com frequência ao realizar os procedimentos subsequentes para manter as condições estéreis. Para começar, anestesie o mouse e raspe a área cirúrgica.
Para esgotar a urina, aplique lubrificante no cateter e certifique-se de que sua superfície externa esteja totalmente coberta. Em seguida, insira o cateter na abertura da uretra do mouse e empurre-o lentamente até atingir a bexiga. Pressione suavemente o abdômen para ajudar na depleção da urina.
Em seguida, descarte a urina com uma pipeta em um copo de resíduos e, em seguida, pipete 80 microlitros de PBS na extremidade externa do cateter com a outra extremidade ainda na bexiga. Em seguida, coloque cuidadosamente uma seringa de um milímetro no cateter. Empurre suavemente a seringa para injetar PBS na bexiga.
Deixe um pouco de PBS no cateter para evitar a criação de bolhas de ar na bexiga. Depois, remova a seringa e espere que o PBS seja drenado para fora da bexiga. Pressione suavemente o abdômen para evacuar o PBS e, em seguida, descarte o PBS no cateter com uma pipeta no copo de resíduos.
Repita a lavagem do PBS por mais duas vezes. Para cada bexiga a ser transfecto, prepare pelo menos 20 microlitros de plasmídeo de DNA a um micrograma por microlitro. Em seguida, adicione um microlitro de azul de tripano aos 20 microlitros de solução de plasmídeo e um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e pipeta para misturar bem.
Para entregar o plasmídeo, aplique 70% de etanol no abdômen. Faça uma incisão vertical de um centímetro para abrir a pele abdominal acima da bexiga. Em seguida, corte a camada muscular para expor a bexiga.
Pipete pelo menos 20 microlitros de plasmídeo mais solução de azul de tripano na extremidade externa do cateter e desconecte-o à seringa. Em seguida, injete a solução de plasmídeo na bexiga. Se a bexiga ficar azul, a injeção é bem-sucedida.
Deixe um pouco de líquido no cateter para evitar a criação de bolhas de ar na bexiga. Depois, pegue o orifício uretral externo e remova o cateter e a seringa. Use um barbante para apertar o orifício uretral externo.
Faça dois laços com o barbante e amarre com dois nós. Este é um passo crucial que requer a cooperação de duas pessoas. Certifique-se de que os nós estejam apertados para que os plasmídeos não vazem.
Agora, ligue o gerador de eletroporação. Aperte a bexiga com dois eletrodos e pressione o pedal para realizar a eletroporação. Para manter a bexiga apoiada, pode-se beliscar a parte de trás da incisão abdominal com uma pinça.
Evite qualquer contato entre a pinça e os eletrodos, pois isso pode gerar uma faísca. Quando terminar, suturar a abertura abdominal e cutânea com sutura cirúrgica estéril. Remova a corda e aplique clipes.
Aplique iodo na ferida e, em seguida, remova o animal do sistema isoflurano. Administre o analgésico buprenorfina por via subcutânea para aliviar a dor pós-cirúrgica. Mantenha o animal na almofada de aquecimento e devolva-o à gaiola de casa após a recuperação total.
Verifique o animal pelo menos uma vez ao dia quanto à mobilidade normal, comportamentos de beber e alimentação e nenhum sinal de infecção até que a incisão esteja curada. Então, uma semana depois, remova os clipes. Administre injeções subsequentes de analgésico buprenorfina se o animal apresentar sintomas de dor, como redução da higiene, aumento da agressividade e vocalização.
Para demonstrar a entrega bem-sucedida do gene no urotélio da bexiga, 20 microlitros de plasmídeo pCAG-GFP e solução de azul de tripano foram injetados através da uretra e cinco pulsos elétricos foram administrados. Aqui é mostrada a eletroporação bem-sucedida que tornou a bexiga verde após 48 horas, enquanto uma bexiga de controle negativo que não sofreu eletroporação não mostrou sinal de GFP. A coloração imunofluorescente dos tecidos seccionados da bexiga foi realizada com anticorpos CK5, CK18 e GFP.
Observou-se que o sinal de GFP está presente nas células guarda-chuva, intermediárias e basais, mas não na camada muscular, indicando boa especificidade da entrega de plasmídeo no urotélio. Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada em 15 minutos se executada corretamente. Após seu desenvolvimento, essa técnica abre caminho para que pesquisadores da área de câncer de bexiga construam novos modelos autóctones de camundongos para estudar os mecanismos de progressão da doença.
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Visão Geral
Este artigo descreve um novo método para entregar plasmídeos de DNA nas células uroteliais da bexiga de camundongo in vivo por meio da cateterização da uretra e eletroporação. Esta técnica fornece uma maneira rápida e conveniente de gerar modelos autóctones de doenças da bexiga em camundongos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Terapia gênica
- Pesquisa sobre câncer de bexiga
- Técnicas de eletroporação
Antecedentes
- O método tem como objetivo entregar plasmídeos de DNA no urotélio da bexiga de camundongos vivos.
- Aborda questões fundamentais sobre a progressão do câncer de bexiga.
- Vetores virais tradicionais apresentam preocupações de segurança e barreiras técnicas.
- Este método oferece uma alternativa para a entrega de genes.
Objetivo do Estudo
- Facilitar a superexpressão gênica ou edição do genoma em células da bexiga.
- Explorar os efeitos de mutações genéticas no câncer de bexiga.
- Melhorar a eficiência dos métodos de entrega de DNA.
Métodos Utilizados
- Cateterização da uretra para entrega de plasmídeo.
- Eletroporação para aumentar a captação de DNA.
- Aplicação in vivo em modelos de camundongos.
- Demonstração por Ofir Stefanson e Yueli Liu.
Resultados Principais
- Entrega bem-sucedida de plasmídeos de DNA em células uroteliais.
- Método rápido e eficiente em comparação com vetores virais.
- Aplicações potenciais em terapia gênica e pesquisa sobre câncer.
- Viabilidade demonstrada em modelos vivos de camundongos.
Conclusões
- Este método fornece uma abordagem inovadora para a entrega gênica na bexiga.
- Tem implicações para o estudo de doenças da bexiga e câncer.
- Pesquisas futuras poderiam expandir suas aplicações na terapia gênica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método aborda um gargalo crítico na pesquisa do câncer de bexiga ao permitir a entrega rápida e não viral de genes ao urotélio in vivo. Ele possibilita a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas ao permitir a superexpressão transitória ou a diminuição da expressão de genes candidatos em um sistema relevante para a doença. A abordagem acelera a geração de modelos pré-clínicos, reduzindo o tempo e o custo em comparação com modelos de linhagem germinativa, ao mesmo tempo que mantém a relevância fisiológica para estudos translacionais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da entrega de plasmídeos às células uroteliais da bexiga para modulação funcional de genes.
- Valor Operacional: Oferece uma alternativa rápida e conveniente aos vetores virais, evitando restrições de biossegurança e atrasos na produção.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem fenotípica em um contexto de tecido nativo, aumentando a confiança na seleção de alvos para vias do câncer de bexiga.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera resultados reprodutíveis e quantificáveis (por exemplo, expressão de GFP) para avaliar a eficiência de transfeção e os níveis de expressão gênica.
- Valor Operacional: Padroniza a entrega de plasmídeos por meio de cateterização e eletroporação, permitindo triagens consistentes de compostos ou perturbações genéticas.
- Escalabilidade: Facilita a preparação de modelos de bexiga validados para ensaios posteriores de resposta a fármacos ou biomarcadores.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Cria modelos de camundongos autóctones que refletem os mecanismos de iniciação e progressão do câncer de bexiga.
- Valor Operacional: Permite a modulação gênica induzível em camundongos adultos, oferecendo controle temporal em estudos pré-clínicos.
- Continuidade Translacional: Conecta descobertas científicas à validação pré-clínica ao testar os efeitos genéticos em um sistema orgânico clinicamente relevante.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na continuidade entre descoberta e pré-clínico, permitindo iteração rápida da hipótese do alvo até a validação in vivo no tecido da bexiga.
- Biologia da Descoberta: Apoia a clarificação de vias e a confirmação de alvos por meio da entrega direta de genes a compartimentos uroteliais.
- Triagem: Fornece saídas quantitativas de fluorescência ou imuno-histoquímicas para avaliar a eficiência de transfeção e modulação gênica.
- Análises: Oferece pontos finais mensuráveis (por exemplo, intensidade do sinal de GFP, especificidade por tipo celular) para comparar condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Permite a modelagem pré-clínica de fenótipos de câncer de bexiga utilizando urotélio geneticamente manipulado.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para entrega gênica em múltiplos alvos e estudos na pesquisa de doenças urológicas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a dependência de sistemas artificiais de superexpressão.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio de parâmetros cirúrgicos e de eletroporação padronizados.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao acelerar a geração de modelos e reduzir a taxa de falhas devido à seleção inadequada de alvos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos no câncer de bexiga com base em dados funcionais in vivo.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em técnicas cirúrgicas murinas, cateterização e eletroporação.
- Depende de instrumentos cirúrgicos estéreis, gerador de eletroporação e eletrodos compatíveis.
- Necessita padronização entre as equipes para volume consistente de plasmídeo, parâmetros de pulso e exposição da bexiga.
- As considerações para adaptação incluem o tamanho do plasmídeo, a escolha do promotor e a taxa de renovação do urotélio, que afeta a duração da expressão.
- As limitações práticas incluem expressão transitória (pico em 48 horas) e desafios técnicos para manter a integridade da bexiga durante os procedimentos.
