Name: Novo método de entrega de DNA do plasmídeo para Mouse bexiga Urotélio por eletroporação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Aprenda a entregar plasmídeos de DNA no urotélio da bexiga de camundongos por eletroporação in vivo. Este método rápido e eficiente permite a superexpressão gênica e edição de genoma para pesquisa em câncer de bexiga.

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Agradecemos o Professor Chen Bin, Dr. Yue Zhang e Kendy Hoang para ajuda com a configuração do sistema de eletroporação. Este trabalho foi financiado por doações do grupo de benefício de câncer de Santa Cruz e NIH para Z.A.W.

Todos os procedimentos descritos aqui foram realizados em conformidade com as diretrizes e normas da institucionais Cuidado Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade da Califórnia em Santa Cruz.
1. plasmídeo e preparação de ferramentas
<ol><li>Para cada bexiga transfect, preparar pelo menos 20 µ l de DNA do plasmídeo (1 µ g / µ l).</li>
	<li>Adicione 1 µ l de Trypan azul para a 20 µ l de solução de plasmídeo em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Pipeta para misturar bem.</li>
	<li>Autoclave cirúrgica todos os instrumentos e esterilizar a área de trabalho com 70% de etanol. Spray instrumentos cirúrgicos e luvas com etanol a 70% com frequência ou usar um esterilizador de grânulo de vidro ao executar as seguintes etapas para manter condições estéreis.</li>
</ol>2. médico-Légal Animal
<ol><li>Use um sistema de anestesia superior de tabela para anestesiar o animal com isoflurano. Ligue o tanque2 O e ajuste o medidor de fluxo de oxigênio para 1 L/min.</li>
	<li>Coloca um rato adulto de C57BL/6J feminino na câmara de indução. Ativar e ajustar o vaporizador de isoflurano para 3% para a indução. O mouse deve estar em anestesia dentro de 2 min. administrar analgésico de buprenorfina (0,1 mg/kg) por via subcutânea após a remoção do mouse da câmara de indução para analgesia preemptiva. Nota: No presente protocolo, ratos fêmeas são usados, porque são mais fáceis de trabalhar com durante cateterismo de uretra. O protocolo também funciona para ratos masculinos, mas um cuidado adicional é necessária ao executar a etapa 3.</li>
	<li>Aplica a pomada oftálmica nos olhos do animal para evitar ressecamento. Coloque o mouse anestesiado virado para cima sobre uma almofada de aquecimento com seu nariz do cone de nariz. Gire o interruptor de circuito de ar para soltar isoflurano através do cone de nariz.</li>
	<li>Conter a cabeça e o cone de nariz com fita adesiva. Ajuste o vaporizador de isoflurano para 2% para manutenção.</li>
	<li>Conter os membros com fita adesiva. Realize testes de dedo-pinch para certificar-se de que o animal está em anestesia profunda e em seguida, raspar a região abdominal.</li>
</ol>3. urina depleção e lavagem da bexiga
<ol><li>Aplique lubrificante ao cateter (24G, comprimento de 2,11 cm, diâmetro externo de 0,045 cm) e certifique-se de que sua superfície externa é totalmente coberto.</li>
	<li>Insira o cateter na abertura da uretra e lentamente empurre-os até atingir a bexiga, momento em que a urina deve fluir através do cateter. Pressione suavemente o abdômen para ajudar a depleção de urina.<ol>
<li>Verifique se o cateter é inserido corretamente a bexiga, observando a urina automática out-fluxo. Evitar a perfuração da parede da uretra e da bexiga e aplique o lubrificante várias vezes se necessário.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Descarte a urina com uma pipeta para um copo de resíduos.</li>
	<li>Pipete 80 µ l de soro de tampão fosfato (PBS) para a extremidade externa do cateter, com a outra extremidade ainda na bexiga. Cuidadosamente, anexe uma seringa de 1 mL para o cateter. Empurre suavemente a seringa para injetar a PBS para a bexiga. Embora alguns PBS o cateter para evitar a criação de bolhas de ar na bexiga.</li>
	<li>Remova a seringa. Espere para PBS drenar para fora da bexiga. Pressione suavemente o abdômen para evacuar PBS.</li>
	<li>Descarte a PBS o cateter com uma pipeta para o copo de resíduos.</li>
	<li>Repita PBS lavagem (etapas 3.4-3.6) para mais duas vezes. Nota: É essencial trabalhar suavemente durante estas etapas de lavagem. Sangue no cateter ou falhas de automatic out-fluxo de líquido geralmente indica a uretra é perfurada através de. Também é importante evitar a introdução de bolhas de ar, como eles irão diminuir a eficiência de eletroporação.</li>
</ol>4. plasmídeo entrega
<ol><li>Aplicar o etanol a 70% no abdômen do mouse e usar um bisturi para fazer uma incisão vertical de 1 cm para abrir a pele abdominal acima da bexiga.</li>
	<li>Pipetar pelo menos 20 µ l de solução de azul de Trypan além de plasmídeo a extremidade externa do cateter e aplique a seringa.</li>
	<li>Injete a solução de plasmídeo da bexiga. Se a bexiga ficar azul, a injeção é bem sucedida. Deixe algum líquido no cateter para evitar a criação de bolhas de ar na bexiga.</li>
	<li>Pegue o orifício uretral externo usando uma pinça e em seguida, retire o cateter e a seringa. Use uma sequência de caracteres para apertar o orifício uretral externo. Faça dois loops com a sequência de caracteres e em seguida amarre com dois nós. Nota: Aperto do uretral é importante para prevenir o refluxo de líquido do plasmídeo.</li>
	<li>Liga o gerador de eletroporação com os seguintes parâmetros: 33V, 50 ms de tempo de trabalho e tempo de intervalo de ms 950.</li>
	<li>Segurar a bexiga com uma pinça e comprima a bexiga com dois eletrodos. Pressione o pedal para executar a eletroporação. Nota: Os impulsos elétricos são definidos para ocorrer 5 vezes com intervalos curtos após cada impulso pedal. O mouse pode contorcer-se neste processo. Empurrar o pedal mais uma vez que pode aumentar a eficiência de entrega, mas também muitos pulsos elétricos podem danificar a integridade do tecido do Urotélio.<ol>
<li>Evite qualquer contacto entre a pinça e os eletrodos, como isso irá gerar uma faísca.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. recuperação
<ol><li>Suture a abertura abdominal e pele com esterilizados para suturas cirúrgicas e clipes. Aplica iodo sobre o ferimento.</li>
	<li>Retire o animal do sistema de isoflurano. Administre analgésico buprenorfina (0,1 mg/kg) por via subcutânea para aliviar a dor pós-cirúrgica.</li>
	<li>Manter o animal sobre a almofada de aquecimento e devolvê-lo para a gaiola em casa depois da recuperação completa. Verifique se o animal pelo menos uma vez por dia para mobilidade normal, beber e alimentar comportamentos e sem sinais de infecção até que a incisão é curado e remova os grampos. Administre injeções subsequentes de buprenorfina analgésico se o animal exibe sintoma de dor, tais como reduzida aliciamento, aumento da agressividade e vocalização.</li>
</ol>

<ol><li>Sharpless, N. E., Depinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mighty+mouse%3A+genetically+engineered+mouse+models+in+cancer+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development.</a> Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).</li>
<li>Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-germline+genetically+engineered+mouse+models+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research.</a> Nat Rev Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).</li>
<li>Maddalo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+engineering+of+oncogenic+chromosomal+rearrangements+with+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system.</a> Nature. 516 (7531), 423-427 (2014).</li>
<li>Xue, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+direct+mutation+of+cancer+genes+in+the+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver.</a> Nature. , (2014).</li>
<li>Sanchez-Rivera, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+modelling+of+cooperating+genetic+events+in+cancer+through+somatic+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid modelling of cooperating genetic events in cancer through somatic genome editing.</a> Nature. 516 (7531), 428-431 (2014).</li>
<li>Romero, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keap1+loss+promotes+Kras-driven+lung+cancer+and+results+in+dependence+on+glutaminolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Keap1 loss promotes Kras-driven lung cancer and results in dependence on glutaminolysis.</a> Nat Med. 23 (11), 1362-1368 (2017).</li>
<li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li>
<li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+Cas9+in+adult+mice+corrects+a+disease+mutation+and+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype.</a> Nat Biotechnol. 32 (6), 551-553 (2014).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+AAV+system+enables+the+Cas9-mediated+correction+of+a+metabolic+liver+disease+in+newborn+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice.</a> Nat Biotechnol. 34 (3), 334-338 (2016).</li>
<li>Negrete, H. O., Lavelle, J. P., Berg, J., Lewis, S. A., Zeidel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+properties+of+the+intact+mammalian+bladder+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Permeability properties of the intact mammalian bladder epithelium.</a> Am J Physiol. 271 (4 Pt 2), F886-F894 (1996).</li>
<li>Lilly, J. D., Parsons, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bladder+surface+glycosaminoglycans+is+a+human+epithelial+permeability+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Surg+Gynecol+Obstet%22%5BJournal%5D)">Bladder surface glycosaminoglycans is a human epithelial permeability barrier.</a> Surg Gynecol Obstet. 171 (6), 493-496 (1990).</li>
<li>Ramesh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+pretreatment+agents+to+enhance+adenovirus+infection+of+bladder+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium.</a> Mol Ther. 10 (4), 697-705 (2004).</li>
<li>Yamashita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syn3+provides+high+levels+of+intravesical+adenoviral-mediated+gene+transfer+for+gene+therapy+of+genetically+altered+urothelium+and+superficial+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Syn3 provides high levels of intravesical adenoviral-mediated gene transfer for gene therapy of genetically altered urothelium and superficial bladder cancer.</a> Cancer Gene Ther. 9 (8), 687-691 (2002).</li>
<li>Engler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+improves+adenovirus-mediated+gene+transfer+and+expression+to+the+bladder+epithelium+of+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">Ethanol improves adenovirus-mediated gene transfer and expression to the bladder epithelium of rodents.</a> Urology. 53 (5), 1049-1053 (1999).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> P Natl Acad Sci USA. 101 (1), 16-22 (2004).</li>
<li>Yarmush, M. L., Golberg, A., Sersa, G., Kotnik, T., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-based+technologies+for+medicine%3A+principles%2C+applications%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges.</a> Annu Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
<li>Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PLoS One. 3 (4), e1883(2008).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li>
<li>Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+to+postnatal+rat+brain+by+non-ventricular+plasmid+injection+and+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Gene delivery to postnatal rat brain by non-ventricular plasmid injection and electroporation.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li>
<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J Vis Exp. (6), e239(2007).</li>
<li>Follenzi, A., Santambrogio, L., Annoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+to+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Immune responses to lentiviral vectors.</a> Curr Gene Ther. 7 (5), 306-315 (2007).</li>
</ol>

Os autores não declaram nenhum interesse de concorrente.

Electroporation aumenta a permeabilidade da membrana celular e é uma tecnologia poderosa para gene electrotransfer16. Entrega do gene em roedores vivos por eletroporação tem sido frequentemente usada em neurobiologia campos17,18,19,20,21. Suas aplicações potenciais em muitos outros órgãos não tem sido exploradas extensivamente. A nosso ...

Modelos do rato geneticamente modificados (GEMMs) têm jogado um papel essencial em expandir o nosso conhecimento sobre o desenvolvimento animal, gene funções in vivoe mecanismos de progressão de doença1,2. GEMMs do germline tradicionalmente são desenvolvidos de duas maneiras. A primeira é a criação de ratos transgênicos por injeção pró-nuclear do plasmídeo de DNA seguido a transplantação de zigotos pseudopregnant mulheres. A outra é a geração de batida-para fora/TOC-em ratos por recombinação homóloga em células-tronco embrionárias e o desenvolvimento de quimeras. Nocaute condicional de genes num tipo específico de tecido ou célula de interesse envolve a criação de alelos geneticamente modificados com Cre e flox sites para várias gerações. Todo o processo pode ser caro e demorado, especialmente se o objetivo é atingir múltiplos genes tecido-especificamente. Recentemente, tecnologias de edição de gene como clusterizadas regularmente intercaladas curtas palíndromos repetições (CRISPR) foram aplicadas aos vários órgãos dos ratos para induzir alterações genéticas de tecido-específica para o cancro autóctone modelagem3, 4,5,6,7 ou doença correta mutações em situ8,9. Nesses estudos, a entrega dos vetores gRNA geralmente foi conseguida através de adenovírus ou particulas de Lentivirus infecção do órgão ou injeção de cauda-veia hidrodinâmica. A relativa facilidade de entrega dos componentes CRISPR para o pulmão e o fígado tem melhorado muito a conveniência e eficiência de câncer nesses órgãos em comparação com os modelos tradicionais de rato Cre-Lox com base de modelagem.
O bexiga Urotélio é onde a maioria dos tumores de bexiga são originários. A entrega dos vetores de DNA para a bexiga Urotélio para terapia de modelagem ou o gene do câncer é dificultada por uma camada de glicosaminoglicano na superfície apical urotelial, que age como uma barreira para a aderência do vírus infeccioso10,11. Vários agentes de pré-tratamento como Syn3 e o dodecil-β-d-maltoside tem sido utilizados para romper essa barreira e melhorar adenovírus infecção eficiência12,13,14. Se o vírus adeno-associado (AAVs) efetivamente podem infectar a bexiga não foi relatado. Em geral, um método de entrega com base não-virais seria desejável. Aqui, descrevemos um método inovador desenvolvido no laboratório para entrega eficiente do plasmídeo de DNA para o Urotélio rato através de cateterismo de uretra e eletroporação. Porque a nossa abordagem não implica pré-tratamento químico da camada glicosaminoglicano ou produção de vírus, significativamente simplifica a entrega de plasmídeos de DNA no rato Urotélio de bexiga e deve facilitar estudos em vivo doenças da bexiga.

<table><tbody><tr><td>Seringa BD 1mL TB</td><td>Fisher</td><td>148232E</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Sigma</td><td>B9275-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Pinças</td><td>Roboz Cirúrgica Instr</td><td>RS-5005</td><td>Trate com etanol a 70% antes do uso cirúrgico</td></tr><tr><td>ECM830 SQ Wave Electroporator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450052</td><td></td></tr><tr><td>Exel International Descartável Safelet I.V. Cateteres</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-841-21</td><td>24G, 2,11 cm de comprimento, 0,045 cm de diâmetro externo</td></tr><tr><td>Tesoura de microdissecação extra fina</td><td>Roboz Surgical Instr</td><td>RS-5135</td><td>Trate com etanol a 70% antes do uso cirúrgico</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Vet one</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>K& H Tapete de Descanso Aquecido para Pequenos Animais, 9 Por 12 Polegadas</td><td>Amazon</td><td>n/a</td><td>Cubra o tapete térmico com toalhas de papel</td></tr><tr><td>Pomada oftálmica</td><td>Fisher</td><td>NC0849514</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta 200 &micro; L</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0206</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de Pipeta, Ajuste Universal; 0.1 a 10 &micro; L</td><td>Fisher</td><td>02707438(CS)</td><td></td></tr><tr><td>PIPETMAN NEO P2</td><td>Gilson</td><td>F144561</td><td></td></tr><tr><td>PIPETMAN NEO P200N</td><td>Gilson</td><td>F144565</td><td></td></tr><tr><td>plasmídeo CAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>16664</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de platina 5 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450489</td><td>5 mm de diâmetro</td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>Roboz Surgical Instr</td><td>RS-5880</td><td>Tratar com 70% de etanol antes do uso cirúrgico</td></tr><tr><td>Cordão de corda</td><td>Amazon</td><td>n/a</td><td>Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm costura de costura de couro cordão de corda de linha encerada plana</td></tr><tr><td>Fita, Scotch</td><td>Fisher</td><td>19047257</td><td></td></tr><tr><td>Therio-gel Lubrificante</td><td>Veterinário PBS saúde animal</td><td>353-736</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>V-1 Tampo de mesa sistema de anestesia</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl violeta sutura 18" FS-2 corte 5-0</td><td>Fisher</td><td>NC0578475</td><td></td></tr><tr><td>Walgreens Povidona Iodo 10%</td><td>Walgreens</td><td>953982</td><td></td></tr><tr><td>Clipe de ferida</td><td>Fisher</td><td>018045</td><td></td></tr><tr><td>Aplicador de clipe de ferida</td><td>Fisher</td><td>01804</td><td></td></tr></tbody></table>

novo método de entrega de dna do plasmídeo para mouse bexiga urotélio por eletroporação

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Modelos do rato geneticamente modificados (GEMMs) são extremamente valiosos em revelando romance biológicas insights sobre os mecanismos de iniciação e progressão de doenças como o câncer. Os ratos transgénicos e condicional nocaute foram usados frequentemente para superexpressão do gene ou ablação em tecidos específicos ou célula tipos em vivo. No entanto, gerar modelos de rato germline pode ser demorada e dispendiosa. Recentes avanços no gene edição de tecnologias e a viabilidade de entrega de plasmídeos de DNA por infecção viral permitiram a rápida geração de modelos de câncer não-germline autóctones do mouse para vários órgãos. A bexiga é um órgão que tem sido difícil para vetores virais acessar, devido à presença de uma camada de glicosaminoglicano cobrindo o Urotélio. Aqui, descrevemos um método novo desenvolvido em laboratório para entrega eficiente de plasmídeos de DNA no rato bexiga Urotélio em vivo. Através de instilação intravesical de plasmídeo de DNA pCAG-GFP e eletroporação de bexiga cirurgicamente exposta, nós mostramos que o plasmídeo de DNA pode ser entregues especificamente nas células uroteliais da bexiga para expressão transiente. Nosso método fornece uma maneira rápida e conveniente para superexpressão e nocaute de genes na bexiga do mouse e pode ser aplicado para a construção de GEMMs de câncer de bexiga e outras doenças urológicas.

Para demonstrar o sucesso da entrega do gene para a bexiga Urotélio, usamos o plasmídeo de15 pCAG-GFP para eletroporação. 20 µ l de solução de azul de Trypan e plasmídeo foi injetado através da uretra e 5 pulsos elétricos foram administrados. Após 48 h, nós dissecado a bexiga de rato e observadas manchas de fluorescência de GFP sob um microscópio de fluorescência de dissecação, Considerando que um negativo controlar a bexiga que não sofreu electroporation não mostr...

Nós descrevemos um método novo para a entrega do plasmídeo de DNA em células uroteliais do rato bexiga na vivo através de cateterismo de uretra e eletroporação. Oferece uma maneira rápida e conveniente para gerar modelos de rato autóctone de doenças da bexiga.

Novo método de entrega de DNA do plasmídeo para Mouse bexiga Urotélio por eletroporação

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

O objetivo geral deste método é entregar plasmídeos de DNA no urotélio da bexiga de camundongos vivos in vivo para superexpressão gênica ou edição do genoma. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do câncer de bexiga, como como diferentes mutações genéticas promovem a progressão do câncer de bexiga? A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece uma maneira rápida e conveniente de entregar genes na bexiga sem as preocupações de segurança e barreiras técnicas associadas aos vetores virais.Tive a ideia para esse método de tentar usar qualquer vírus associado projetado para entrega de DNA, o que não funcionou bem na bexiga. A implicação dessa técnica também pode se estender à terapia gênica porque a eletroporação pode alcançar a entrega eficiente de plasmídeos de DNA nas células uroteliais. Demonstrando o procedimento estarão Ofir Stefanson e Yueli Liu do meu laboratório.Para iniciar este procedimento, autoclave todos os instrumentos cirúrgicos e esterilize o espaço de trabalho com etanol a 70%. Pulverize instrumentos cirúrgicos e luvas com etanol 70% com frequência ao realizar os procedimentos subsequentes para manter as condições estéreis. Para começar,

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um método de transferência de genes no cérebro do rato em desenvolvimento é descrito usando um único método cirúrgico ea forma especial de eletrodos. Esta técnica exclusiva permite a transfecção de DNA plasmídeo temporal e espacialmente, o que ajudará muitos neurocientistas em estudar o desenvolvimento do cérebro.

Mouse No Utero Eletroporação: Transfecção Gênica Controlled Spatiotemporal

Neste vídeo, descrevemos um procedimento baseado em cateter para esvaziar e enxaguar a bexiga urinária de um modelo de camundongo. O mouse preparado pode então ser usado para outros procedimentos experimentais.

Depleção de urina e enxágue da bexiga em modelo de camundongo: um procedimento baseado em cateter para esvaziar e lavar a bexiga urinária murina

Este vídeo demonstra a entrega de plasmídeo de DNA no urotélio da bexiga do camundongo usando uma combinação de técnicas de cateterismo uretral e eletroporação. O procedimento descrito permite a geração de modelos de câncer de bexiga de camundongos.

Entrega de plasmídeos de DNA no urotélio da bexiga de camundongo: um procedimento baseado em eletroporação para entregar plasmídeos de DNA de forma eficiente em células uroteliais da bexiga murina para gerar modelos geneticamente modificados

Neste vídeo, apresentamos o protocolo de injeção hidrodinâmica de plasmídeos na pelve renal do rim de camundongo para transfecção de ácido nucleico. Essa técnica permite a entrega de plasmídeos específicos do órgão, utilizando o princípio da alta pressão hidrostática, que impulsiona com força os plasmídeos para o local específico sem causar lesão tecidual.

Injeção hidrodinâmica da pelve renal: uma técnica para entregar DNA diretamente em células renais de modelo murino

Este vídeo demonstra a entrega de DNA de plasmídeo em células neuronais cerebelares de embriões murinos usando eletroporação in utero. Este método é útil para obter compreensão da função in vivo dos genes no desenvolvimento normal do cérebro e as mudanças na expressão gênica das células dos neurônios durante a progressão do tumor.

Entrega de genes baseada em eletroporação in utero: uma técnica para injetar DNA de plasmídeo em células cerebelares embrionárias de embriões murinos

Este vídeo demonstra a técnica de eletroporação que introduz o DNA do plasmídeo codificador de proteínas fluorescentes em precursores de células granulares cerebelares primárias de camundongos.

Entrega de genes in vitro mediada por eletroporação: uma técnica de pulso elétrico para introduzir plasmídeos codificadores de proteínas repórter fluorescentes em células cultivadas

Implantação de células cancerosas para o órgão de origem pode servir como um modelo pré-clínico útil para avaliar novas terapias. Células de carcinoma da bexiga MB49 pode ser cultivada no interior da bexiga, após a instilação intravesical. Este protocolo demonstra a cateterização da bexiga do rato com a finalidade de implantação do tumor e entrega adenoviral.

Um modelo de cancro da bexiga para Ortotópico Gene Estudos de entrega

A superfície pial é uma zona de progenitor original no SNC, que está a receber cada vez mais atenção. Aqui, detalhamos um método para manipulação genética rápida desta zona progenitor usando um método de eletroporação modificado. Este procedimento pode ser usado para investigações celulares e moleculares de linhagens celulares e vias de sinalização envolvidas na diferenciação celular e para esclarecer o destino e as propriedades das células-filhas.

Neonatal Pial Superfície Eletroporação

Este artigo descreve a microinjecção e a electroporação de testículo do rato in vivo, como uma técnica para a transfecção de células de testículo de rato para estudar os processos exclusivos da espermatogénese. O protocolo apresentado envolve os passos de preparação de capilar de vidro, através da conduta de microinjecção eferente, e transfecção por electroporação.

In Vivo microinjeção e Eletroporação de testículos de camundongo

A eletroporação do DNA plasmídeo no músculo esquelético é um método viável para modular a expressão genética sem comprometer a contratilidade muscular em camundongos.

Eletroporação do DNA plasmídeo no músculo esquelético do rato

São descritos métodos para a geração de grandes quantidades de adenovírus recombinantes, que podem então ser usados para transduzir o urotélio nativo de roedores, permitindo a expressão de transgenes ou downregulation de produtos gênicos endógenos.

Expressão de Transgenes no Urotélio da Bexiga Nativa utilizando Transdução Mediada por Adenovírus

Aprenda a entregar plasmídeos de DNA no urotélio da bexiga de camundongos por eletroporação in vivo. Este método rápido e eficiente permite a superexpressão gênica e edição de genoma para pesquisa em câncer de bexiga.

Novo método de entrega de DNA do plasmídeo para Mouse bexiga Urotélio por eletroporação

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