Novo método de entrega de DNA do plasmídeo para Mouse bexiga Urotélio por eletroporação

Nós descrevemos um método novo para a entrega do plasmídeo de DNA em células uroteliais do rato bexiga na vivo através de cateterismo de uretra e eletroporação. Oferece uma maneira rápida e conveniente para gerar modelos de rato autóctone de doenças da bexiga.

O objetivo geral deste método é entregar plasmídeos de DNA no urotélio da bexiga de camundongos vivos in vivo para superexpressão gênica ou edição do genoma. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do câncer de bexiga, como como diferentes mutações genéticas promovem a progressão do câncer de bexiga? A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece uma maneira rápida e conveniente de entregar genes na bexiga sem as preocupações de segurança e barreiras técnicas associadas aos vetores virais.

Tive a ideia para esse método de tentar usar qualquer vírus associado projetado para entrega de DNA, o que não funcionou bem na bexiga. A implicação dessa técnica também pode se estender à terapia gênica porque a eletroporação pode alcançar a entrega eficiente de plasmídeos de DNA nas células uroteliais. Demonstrando o procedimento estarão Ofir Stefanson e Yueli Liu do meu laboratório.

Para iniciar este procedimento, autoclave todos os instrumentos cirúrgicos e esterilize o espaço de trabalho com etanol a 70%. Pulverize instrumentos cirúrgicos e luvas com etanol 70% com frequência ao realizar os procedimentos subsequentes para manter as condições estéreis. Para começar, anestesie o mouse e raspe a área cirúrgica.

Para esgotar a urina, aplique lubrificante no cateter e certifique-se de que sua superfície externa esteja totalmente coberta. Em seguida, insira o cateter na abertura da uretra do mouse e empurre-o lentamente até atingir a bexiga. Pressione suavemente o abdômen para ajudar na depleção da urina.

Em seguida, descarte a urina com uma pipeta em um copo de resíduos e, em seguida, pipete 80 microlitros de PBS na extremidade externa do cateter com a outra extremidade ainda na bexiga. Em seguida, coloque cuidadosamente uma seringa de um milímetro no cateter. Empurre suavemente a seringa para injetar PBS na bexiga.

Deixe um pouco de PBS no cateter para evitar a criação de bolhas de ar na bexiga. Depois, remova a seringa e espere que o PBS seja drenado para fora da bexiga. Pressione suavemente o abdômen para evacuar o PBS e, em seguida, descarte o PBS no cateter com uma pipeta no copo de resíduos.

Repita a lavagem do PBS por mais duas vezes. Para cada bexiga a ser transfecto, prepare pelo menos 20 microlitros de plasmídeo de DNA a um micrograma por microlitro. Em seguida, adicione um microlitro de azul de tripano aos 20 microlitros de solução de plasmídeo e um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e pipeta para misturar bem.

Para entregar o plasmídeo, aplique 70% de etanol no abdômen. Faça uma incisão vertical de um centímetro para abrir a pele abdominal acima da bexiga. Em seguida, corte a camada muscular para expor a bexiga.

Pipete pelo menos 20 microlitros de plasmídeo mais solução de azul de tripano na extremidade externa do cateter e desconecte-o à seringa. Em seguida, injete a solução de plasmídeo na bexiga. Se a bexiga ficar azul, a injeção é bem-sucedida.

Deixe um pouco de líquido no cateter para evitar a criação de bolhas de ar na bexiga. Depois, pegue o orifício uretral externo e remova o cateter e a seringa. Use um barbante para apertar o orifício uretral externo.

Faça dois laços com o barbante e amarre com dois nós. Este é um passo crucial que requer a cooperação de duas pessoas. Certifique-se de que os nós estejam apertados para que os plasmídeos não vazem.

Agora, ligue o gerador de eletroporação. Aperte a bexiga com dois eletrodos e pressione o pedal para realizar a eletroporação. Para manter a bexiga apoiada, pode-se beliscar a parte de trás da incisão abdominal com uma pinça.

Evite qualquer contato entre a pinça e os eletrodos, pois isso pode gerar uma faísca. Quando terminar, suturar a abertura abdominal e cutânea com sutura cirúrgica estéril. Remova a corda e aplique clipes.

Aplique iodo na ferida e, em seguida, remova o animal do sistema isoflurano. Administre o analgésico buprenorfina por via subcutânea para aliviar a dor pós-cirúrgica. Mantenha o animal na almofada de aquecimento e devolva-o à gaiola de casa após a recuperação total.

Verifique o animal pelo menos uma vez ao dia quanto à mobilidade normal, comportamentos de beber e alimentação e nenhum sinal de infecção até que a incisão esteja curada. Então, uma semana depois, remova os clipes. Administre injeções subsequentes de analgésico buprenorfina se o animal apresentar sintomas de dor, como redução da higiene, aumento da agressividade e vocalização.

Para demonstrar a entrega bem-sucedida do gene no urotélio da bexiga, 20 microlitros de plasmídeo pCAG-GFP e solução de azul de tripano foram injetados através da uretra e cinco pulsos elétricos foram administrados. Aqui é mostrada a eletroporação bem-sucedida que tornou a bexiga verde após 48 horas, enquanto uma bexiga de controle negativo que não sofreu eletroporação não mostrou sinal de GFP. A coloração imunofluorescente dos tecidos seccionados da bexiga foi realizada com anticorpos CK5, CK18 e GFP.

Observou-se que o sinal de GFP está presente nas células guarda-chuva, intermediárias e basais, mas não na camada muscular, indicando boa especificidade da entrega de plasmídeo no urotélio. Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada em 15 minutos se executada corretamente. Após seu desenvolvimento, essa técnica abre caminho para que pesquisadores da área de câncer de bexiga construam novos modelos autóctones de camundongos para estudar os mecanismos de progressão da doença.