Novo método de entrega de DNA do plasmídeo para Mouse bexiga Urotélio por eletroporação

Summary

Nós descrevemos um método novo para a entrega do plasmídeo de DNA em células uroteliais do rato bexiga na vivo através de cateterismo de uretra e eletroporação. Oferece uma maneira rápida e conveniente para gerar modelos de rato autóctone de doenças da bexiga.

Abstract

Modelos do rato geneticamente modificados (GEMMs) são extremamente valiosos em revelando romance biológicas insights sobre os mecanismos de iniciação e progressão de doenças como o câncer. Os ratos transgénicos e condicional nocaute foram usados frequentemente para superexpressão do gene ou ablação em tecidos específicos ou célula tipos em vivo. No entanto, gerar modelos de rato germline pode ser demorada e dispendiosa. Recentes avanços no gene edição de tecnologias e a viabilidade de entrega de plasmídeos de DNA por infecção viral permitiram a rápida geração de modelos de câncer não-germline autóctones do mouse para vários órgãos. A bexiga é um órgão que tem sido difícil para vetores virais acessar, devido à presença de uma camada de glicosaminoglicano cobrindo o Urotélio. Aqui, descrevemos um método novo desenvolvido em laboratório para entrega eficiente de plasmídeos de DNA no rato bexiga Urotélio em vivo. Através de instilação intravesical de plasmídeo de DNA pCAG-GFP e eletroporação de bexiga cirurgicamente exposta, nós mostramos que o plasmídeo de DNA pode ser entregues especificamente nas células uroteliais da bexiga para expressão transiente. Nosso método fornece uma maneira rápida e conveniente para superexpressão e nocaute de genes na bexiga do mouse e pode ser aplicado para a construção de GEMMs de câncer de bexiga e outras doenças urológicas.

Introduction

Modelos do rato geneticamente modificados (GEMMs) têm jogado um papel essencial em expandir o nosso conhecimento sobre o desenvolvimento animal, gene funções in vivoe mecanismos de progressão de doença^1,2. GEMMs do germline tradicionalmente são desenvolvidos de duas maneiras. A primeira é a criação de ratos transgênicos por injeção pró-nuclear do plasmídeo de DNA seguido a transplantação de zigotos pseudopregnant mulheres. A outra é a geração de batida-para fora/TOC-em ratos por recombinação homóloga em células-tronco embrionárias e o desenvolvimento de quimeras. Nocaute condicional de genes num tipo ....

Protocol

Todos os procedimentos descritos aqui foram realizados em conformidade com as diretrizes e normas da institucionais Cuidado Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade da Califórnia em Santa Cruz.

1. plasmídeo e preparação de ferramentas

1. Para cada bexiga transfect, preparar pelo menos 20 µ l de DNA do plasmídeo (1 µ g / µ l).
2. Adicione 1 µ l de Trypan azul para a 20 µ l de solução de plasmídeo em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Pipeta para misturar bem.
3. Autoclave cirúrgica todos os instrumentos e esterilizar a área de trabalho com 70% de etanol. Spray instrumentos cirúrgicos e luvas com eta....

Results

Para demonstrar o sucesso da entrega do gene para a bexiga Urotélio, usamos o plasmídeo de¹⁵ pCAG-GFP para eletroporação. 20 µ l de solução de azul de Trypan e plasmídeo foi injetado através da uretra e 5 pulsos elétricos foram administrados. Após 48 h, nós dissecado a bexiga de rato e observadas manchas de fluorescência de GFP sob um microscópio de fluorescência de dissecação, Considerando que um negativo controlar a bexiga que não sofreu electroporation não mostr.......

Discussion

Electroporation aumenta a permeabilidade da membrana celular e é uma tecnologia poderosa para gene electrotransfer¹⁶. Entrega do gene em roedores vivos por eletroporação tem sido frequentemente usada em neurobiologia campos^{17,18,19,20,21}. Suas aplicações potenciais em muitos outros órgãos não tem sido exploradas extensivamente. A nosso .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seringa BD 1mL TB	Fisher	148232E
Buprenorfina	Sigma	B9275-50MG
Dumont Pinças	Roboz Cirúrgica Instr	RS-5005	Trate com etanol a 70% antes do uso cirúrgico
ECM830 SQ Wave Electroporator	Harvard Apparatus	450052
Exel International Descartável Safelet I.V. Cateteres	Fisher Scientific	14-841-21	24G, 2,11 cm de comprimento, 0,045 cm de diâmetro externo
Tesoura de microdissecação extra fina	Roboz Surgical Instr	RS-5135	Trate com etanol a 70% antes do uso cirúrgico
Isoflurano	Vet one	501017
K& H Tapete de Descanso Aquecido para Pequenos Animais, 9 Por 12 Polegadas	Amazon	n/a	Cubra o tapete térmico com toalhas de papel
Pomada oftálmica	Fisher	NC0849514
PBS, pH7.4	Life Technologies	10010049
Pontas de pipeta 200 µ L	USA Scientific	1111-0206
Pontas de Pipeta, Ajuste Universal; 0.1 a 10 µ L	Fisher	02707438(CS)
PIPETMAN NEO P2	Gilson	F144561
PIPETMAN NEO P200N	Gilson	F144565
plasmídeo CAG-GFP	Addgene	16664
Pinça de platina 5 mm	Harvard Apparatus	450489	5 mm de diâmetro
Tesoura	Roboz Surgical Instr	RS-5880	Tratar com 70% de etanol antes do uso cirúrgico
Cordão de corda	Amazon	n/a	Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm costura de costura de couro cordão de corda de linha encerada plana
Fita, Scotch	Fisher	19047257
Therio-gel Lubrificante	Veterinário PBS saúde animal	353-736
Trypan Blue Stain	Life Technologies	15250061
V-1 Tampo de mesa sistema de anestesia	VetEquip	901806
Vicryl violeta sutura 18" FS-2 corte 5-0	Fisher	NC0578475
Walgreens Povidona Iodo 10%	Walgreens	953982
Clipe de ferida	Fisher	018045
Aplicador de clipe de ferida	Fisher	01804