Artigo de método

Isolamento do conteúdo do reservatório glândula Mandibular de Bornean ' explodindo das formigas (Formicidae) para Volatilome análise por GC-MS e MetaboliteDetector

DOI:

10.3791/57652

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26 de agosto de 2018

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1Center for Analytical Chemistry, Department of Agrobiotechnology (IFA-Tulln), University of Natural Resources and Life Sciences Vienna (BOKU), Austria, 2Institute of Chemical, Environmental and Biological Engineering, TU Vienna, Austria, 3Department of Computational Biology of Infection Research, Helmholtz Centre for Infection Research, Germany, 4Institute for Biochemistry, Biotechnology and Bioinformatics, University of Technology (TU) Braunschweig, Germany, 52nd Zoological Department, Natural History Museum Vienna, Austria, 6Chemical Sciences, Universiti Brunei Darussalam, Brunei, 7Environmental and Life Sciences, Universiti Brunei Darussalam, Brunei

Neste artigo

Resumo

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Trabalhadores menores da espécie formiga Colobopsis explodens são dissecados para isolar o conteúdo como cera armazenado em seus reservatórios hipertrofiado glândula mandibular para posterior extração por solvente- e análise por cromatografia gasosa / espectrometria de massa. É também descrita a anotação e identificação de substâncias voláteis, usando o software open-source MetaboliteDetector.

Resumo

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O objetivo deste manuscrito é apresentar um protocolo descrevendo a metabolómica análise de Bornean 'explodindo formigas' pertencente ao grupo Colobopsis cylindrica (COCY). Para este efeito, a espécie de modelo c. explodens é usado. As formigas pertencem à casta de trabalhador menor possuem glândulas mandibulares hipertrofiadas distintivas (MGs). Em combate territorial, eles usam o conteúdo viscoso de seus reservatórios de glândula mandibular alargada (MGRs) para matar rivais artrópodes em características suicidas 'explosões' por ruptura voluntária da pele gastral (autothysis). Mostramos a dissecação de formigas do trabalhador desta espécie para o isolamento da parte gastral do conteúdo MGR de cera-como, bem como a listagem necessárias etapas necessárias para extração por solvente-dos compostos voláteis nele contido com gás subsequentes análise de cromatografia / espectrometria de massa (GC-MS) e putativa identificação de metabólitos contidos no extrato. O procedimento de dissecação é realizado sob condições de refrigeração e sem o uso de qualquer solução de tampão de dissecação para minimizar as alterações na composição química do conteúdo MGR. Após a extração solvente-baseado de metabólitos voláteis nele contidas, são apresentados os passos necessários para a análise das amostras através de injeção líquido-GC-MS. Por último, processamento de dados e identificação do metabólito putativo com o uso do software open source MetaboliteDetector é mostrado. Com esta abordagem, a criação de perfil e identificação de metabólitos voláteis no MGRs de formigas pertencentes a COCY grupo via GC-MS e o software de MetaboliteDetector tornam-se possíveis.

Introdução

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O objectivo geral de fluxo de trabalho aqui apresentado é a investigação geral de composições químicas em secreções de insetos. Isso é feito com o principal objectivo de elucidar as funções ecológicas de secreção como um todo, ou de seus compostos simples. Além disso, estamos interessados em investigar as vias metabólicas subjacentes os compostos encontrados em secreções respectivas. Especialmente glândula conteúdo de formigas (Hymenoptera, Formicidae) ganharam crescente interesse nos últimos anos, porque eles fornecem fontes de até então inexplorado potencialmente bioativas (colas, agentes antimicrobianos, etc.)1, 2. as formigas do trabalhador menor de algumas espécies pertencentes ao grupo COCY3,4 podem fornecer tais compostos contidos em seus MGRs hipertrofiados que se estendem desde o aparelho bucal para a Suíça5,6. Quando ameaçado por inimigos putativos, menores, trabalhadores de c. explodens7 e alguns relacionados a espécie pode fazer uso de seu MGR Sumário de uma forma inusitada: eles se sacrificam por romper sua parede gastral para ejetar o pegajoso conteúdo do MGRs explosivamente para o adversário, whereupon o inimigo putativo é detido e até pode morrer5,6,8,9. A finalidade do desenvolvimento e o uso dos métodos apresentados neste documento foi para ajudar a melhorar a compreensão da composição química e a natureza dos constituintes tentativamente tóxicos da secreção formiga.

Nesse sentido, apresentamos um protocolo para a dissecação de formigas do trabalhador c. explodens para obter a gastral parte do seu conteúdo MGR ceroso com posterior extração por solvente- e análise por GC-MS.

Análise por CG-em é um dos métodos de criação de perfil e identificação de metabólitos voláteis (volatilome) de insetos bem estabelecidos. Típicos analitos de interesse em formigas incluem hidrocarbonetos cuticular10, semioquímicos11e em geral, compostos com atividade biológica12. As amostras podem ser obtidas a partir de animais inteiros ou partes do corpo e fluidos isolados através de dissecação do inseto13,14. Técnicas de preparação de amostra incluem extração dos metabolitos nele contido, com o uso de solventes14 ou headspace-sólido-fase-microextraction (HS-SPME)15.

Para estudos da metabolómica, é vital que as amostras estão congeladas rapidamente diretamente após a amostragem, a fim de minimizar as alterações na composição química e a quantidade dos compostos. As formigas utilizadas para este estudo foram mortas por congelação rápida no local em um saco bem recheado com bolsas de gelo congeladas. As amostras foram então armazenadas em um congelador-20 ° C usando orientado em gerador de eletricidade, antes eles eram transportados para o laboratório em gelo seco. O procedimento de dissecação apresentado aqui oferece a possibilidade de isolar conteúdos MGR sem analisar a formiga inteira ou a Suíça como um todo, como tem sido feito antes por diferentes COCY espécie16,17,18. Além disso, o protocolo apresentado também permite acesso direto e análise da envolvente glândulas e tecidos, como o veneno de glândula (VG)5,8, glândula (DG)8 do Dufourou os intestinos em outros estudos biológicos, ou para verificar possíveis contaminações-Cruz introduzidas durante a manipulação ou dissecação das formigas. Para minimizar as alterações na composição química do conteúdo MGR durante a dissecção, descongelação de amostras ou por usar produtos químicos, o processo de dissecção foi otimizado para ser realizado em uma bolsa de gelo (-20 ° C), sem o uso de qualquer buffers adicionais, soluções de lavagem, ou solventes. As amostras obtidas através deste método são adequadas para responder às perguntas qualitativas e quantitativas.

Análise de dados para fins de identificação e anotação do metabólito putativo é feito através do software de código aberto MetaboliteDetector19, que foi desenvolvido para a análise automática de dados baseados em GC-MS metabolómica. Ele detecta o único íon picos presentes nos cromatogramas, executa uma etapa de deconvolução e extrai os espectros de massa deconvoluted de compostos químicos contidos nas amostras analisadas. Putativa identificação de compostos com MetaboliteDetector baseia-se no índice de retenção determinada (RI; o pode de Kováts RI é calculado automaticamente pelo software), bem como a similaridade dos espectros de massa deconvoluted. RI e factor espectral de fósforo podem ser cruzados ou bibliotecas de referência existentes (que pode ser importadas, se eles estão no formato comum NIST), ou contra uma biblioteca interna estabelecida. Isto é de acordo com as diretrizes para (putativa) composta identificação sugeridas, por exemplo, pela química análise trabalhando Group (CAWG) da iniciativa de padrões o Metabolomics (MSI), onde um mínimo de dois dados independentes e ortogonais em relação a um autêntico composto (aqui retenção tempo /RI (RT) e o espectro de massa) analisados sob condições experimentais idênticas são propostas como necessário para confirmar o não-novela de metabólito identificações20.

A experiência completa é conduzida sobre o conteúdo MGR da espécie modelo COCY c. explodens, mas os passos de dissecação também podem ser adaptados para isolar as outras glândulas presentes na Suíça a formiga. Além disso, apresentamos um protocolo para a análise abrangente da volatilome do conteúdo MGR, as partes mais genéricos do fluxo de trabalho descreve o extração, GC-MS medição e avaliação de dados também podem ser usado para análise e (putativo) identificação de metabólitos voláteis em geral.

Como os experimentos descritos neste manuscrito são realizados em insetos, nenhuma aprovação ética é necessária. Trabalho de campo, amostragem de formigas, bem como seu uso para publicação estão em conformidade com as diretrizes de regulação deste projeto através da Universiti Brunei Darussalam, pesquisa do Brunei e centro de inovação e do Brunei departamento florestal, Brunei Darussalam.

Protocolo

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1. coleção de formigas

  1. Colete as formigas do trabalhador menor com o uso de um aspirador (Figura 1).
  2. Imediatamente após a amostragem, as formigas pela congelação rápida a-20 ° C e armazená-los nisso ou uma temperatura mais baixa até a análise.

2. isolamento do conteúdo MGR e DG de formigas

  1. Antes a dissecação das formigas, prepare o seguinte:
    1. Limpe o prato de Petri de vidro e os instrumentos de dissecação, usando uma mistura de metanol-água (MeOH/H2O; 1 + 1 v/v) e tecidos.
      Cuidado: MeOH é tóxico para os seres humanos. Sempre use luvas apropriadas, um jaleco e óculos de proteção e executar a limpeza sob uma coifa.
    2. Congelar a bolsa de gelo e o vidro de Petri a-20 ° C.
    3. Determinar as massas de 1,5 mL frascos de segmento curto incluindo tampas de rosca com septos do silicone/politetrafluoretileno (PTFE) e mantê-los no gelo directamente ao lado do microscópio.
      Nota: A escolha do frasco de amostra é opcional. Aqui, o conteúdo MGR é colocado diretamente em refrigeração 1,5 mL frascos de vidro. Plásticos podem conter compostos (por exemplo, ftalatos) que podem causar artefatos, que interferir com os sinais dos metabolitos alvo.
    4. Coloque a bolsa de gelo congelada em uma caixa feita de espuma de poliestireno extrudida. Coloque o prato de Petri em cima do bloco frio e colocar uma formiga congelada no prato. Monte a caixa sob um microscópio estéreo. Ajuste a ampliação (20 – 40 X) e o foco até a formiga inteira pode ser vista claramente.
  2. Verifique a formiga congelada para a integridade de seus compartimentos gastral. Para dissecação, tome apenas formigas com uma região Suíça intacto (Fig. 2A, B). Exclua as formigas com gasters planas ou traços de conteúdo MGR endurecido em suas superfícies do corpo de uma análise mais adicional (Figura 2, D).
  3. Pegue a formiga selecionada com um par de pinças de ponta fina para o propodeum (primeiro segmento abdominal) e com o outro par de pinças para o pecíolo (segmento segundo abdominal). Desanexe a região Suíça, delicadamente, puxando-o longe do resto do corpo formiga (Figura 3A).
  4. Corrigi a Suíça formiga agora separados, segurando-o com pinça de ponta fina em tergite 4. Com outro par de pinças de ponta fina agarra tergite 1 (localizado ao lado do pecíolo) e removê-lo suavemente por isso descascando (Figura 3B). Repita isto também para mesossoma 2 e 3 (Figura 3, D) até a porção gastral dos MGRs (colorido de amarelo em formigas do trabalhador c. explodens , mas a cor do conteúdo MG pode variar de branco ao longo de amarelo para vermelho em outras espécies) é visível para a maioria parte.
    Nota: Removendo o exoesqueleto, a membrana do MGR também ser parcialmente removida.
  5. Pelo uso de uma agulha de dissecação, suavemente remova o conteúdo de cera, como dos MGRs emparelhados por riscá-los fora do compartimento gastral (Figura 3E). Só remova essas partes do conteúdo MGR que podem ser isolados sem romper outras glândulas presentes na Suíça a formiga. Se mais força ou esforços tem que ser aplicado para obter o conteúdo MGR como um todo, aceite sua remoção incompleta (Figura 4).
  6. Buscar o conteúdo MGR tocando com a ponta da agulha de dissecação até eles grudam nela. Em seguida, transferir o conteúdo MGR dentro de um frasco de segmento curto 1.5 refrigerado com conhecidos tare massa.
    1. Para remover o conteúdo MGR pegajoso da ponta da agulha de dissecação, mova a ponta da agulha para a parede do frasco de amostra e mancha-los na parede. Feche o frasco e colocá-lo no gelo até o próximo conteúdo MGR é isolado.
  7. Para mais tarde verificar possível contaminação da amostra conteúda MGR por compostos provenientes da DG adjacente (secção 6), também colete DGs de formigas, em que eles são ainda intactas (Figura 4) em colocá-los em um frasco separado de HPLC.
  8. Sempre limpe a placa de Petri e instrumentos de dissecção com MeOH/H2O (1 + 1 v/v), quando se muda de glândula de glândula ou da formiga a formiga.
  9. Para uma amostra para análise, combine o conteúdo do reservatório ou glândulas de várias formigas.
    Nota: O número de glândulas ou seus conteúdos utilizados para uma amostra para análise pode variar dependendo do design do experimento. Aqui, conteúdo MGR ou DGs de cinco formigas foram agrupados para obter uma amostra para análise.

3.-extração por solvente de conteúdo glândula isolada

  1. Determine as massas das amostras analíticas (aqui, conteúdo MGR ou glândulas adjacentes em pool de cinco formigas).
  2. Adicionar gelado alta pureza de acetato de etila (AcOEt) em uma proporção constante de 01:14 w/v e vórtice as amostras por 5 min em condições de refrigeração; aqui, realizada a 7 ° C, em um laboratório termostatizado.
  3. Centrifugar as amostras por 10 min a 3.820 x g a 7 ° C e transferir os sobrenadantes (sobre µ l 55-75 para extrair conteúdo de MGR obtido de cinco formigas) em pre-cooled 1,5 mL segmento curto frascos contendo microinserções de 0,1 mL. Sele hermeticamente os frascos com tampas de rosca contendo furos e septos de borracha vermelho/PTFE.
    Nota: Se a análise não pode ser executada imediatamente, mantenha o extrato a-80 ° C de até análise, mas é recomendado para analisar amostras imediatamente após o preparo para minimizar o risco de alterações químicas durante o ciclo de congelamento/descongelamento.

4. GC-MS

  1. Para uma completa sequência de medição de GC-MS, prepare as seguintes soluções, cada um em um frasco de segmento curto de 1,5 mL:
    1. Prepare uma mistura de calibrant de RI, diluição das soluções-padrão alcano comercialmente disponível para uma concentração final de 8 mg/L por composto usando hexano.
    2. Prepare um espaço em branco-solvente consistindo de AcOEt puro.
  2. Lugar os frascos contendo 1) solvente-branco, mistura de calibrant 2) RI, 3) MGR conteúdo extrair e 4) a DG conteúdo extraem na bandeja de refrigeração (10 ° C) do mostruário automático acoplado ao cromatógrafo a gás (GC).
    Nota: É recomendável para minimizar o tempo que cada frasco é mantido no mostruário antes da medição. Para amostras de críticas, como a amostra de conteúdo MGR, o frasco pode ser colocado no mostruário imediatamente antes da análise.
  3. Para cada amostra, injetar uma alíquota 1 µ l do GC-MS para separação cromatográfica em uma coluna apropriada para os compostos alvo (aqui: coluna HP - 5MS UI).
    1. Defina os parâmetros adequados de GC, que podem ter a seguinte aparência:
      1. Uso de hélio como gás de transporte e definir um fluxo constante de coluna de 1 mL/min. conjunto uma rampa de temperatura do forno a partir 40 ° C com uma preensão por 2 min, seguido por uma rampa de 10 ° C/min até 330 ° C, com um tempo de espera de 7 min. definir a temperatura de admissão de 270 ° C.
      2. Escolha e, se necessário, ajuste os rácios de divisão para injeção de GC-MS que resultam em formas de pico adequado e intensidades para compostos de interesse (Figura 5).
        Nota: No exemplo apresentado foi necessário medir o extrato DG em uma relação de divisão de 2:1 e a mistura de calibrant de RI no modo splitless. O extrato de conteúdo MGR foi analisado em uma relação de divisão de 2:1 e uma segunda vez no 50: 1.
      3. Definir a temperatura auxiliar a 350 ° C.
    2. Definir os parâmetros do espectrômetro de massa (MS) da seguinte forma: MS fonte temperatura de 230 ° C, temperatura de MS Quad 150 ° C, faixa de varredura de baixa massa 30 a 500, solvente de alta massa atrasar 4.1 min (para amostras de solvente-blank e experimentais) ou 6,1 min (para mistura de calibrant de RI) , respectivamente. Defina a taxa de varredura de aproximadamente 3 exames/s.
      Nota: Os parâmetros de MS, especialmente o MS varredura-, taxa, de amostragem e tempo de ciclo pode afetar a colheita de pico e deconvolução de espectro e devem ser considerados ao selecionar configurações de parâmetro para a avaliação adequada de dados com o software MetaboliteDetector.
  4. Quando a medição estiver concluída, exporte os dados como. AIA do projeto arquivo (realizado aqui com o uso de software de análise a dados entregue com o GC) em um dispositivo de armazenamento de dados portáteis.
    1. Selecione o arquivo | Exportar dados para o formato AIA..., em seguida verificar criar novo diretório e clique em Okey. Selecione o local de armazenamento desejado (por exemplo, unidade flash USB) e clique em abrir. Selecione os arquivos a ser exportado e clique no ícone do ---> . Confirme com clicando em processo.

5. metabólito deteção e a identificação com o uso do Software MetaboliteDetector

  1. Antes de iniciar a análise dos arquivos de dados, abra MetaboliteDetector, escolha ferramentas | Configurações dee definir os parâmetros necessários como segue (folhas individuais de MetaboliteDetector são indicadas em negrito):
    1. Na folha de aparência, defina a escala de tempo para Min e habilitar a opção de rótulos de eixos.
    2. Na folha de deconvolução, definir os parâmetros para as configurações de pico: limiar de pico: 10 e a altura do pico mínimo (unidades de ruído): 10. Desmarque a opção Habilitar de ajuste de linha de base. Definir os parâmetros para a deteção de metabólito para: varredura/escaninhos: 10, largura de deconvolução (varreduras): 5, intensidade necessária (% da base pico): 0 e o número necessário de picos: 10.
    3. Na folha de identificação, defina a opção de pesquisa da biblioteca de: Lib composto: 'CalibrationLibrary_Alkanes' e ao NIST (uma biblioteca sqlite do NIST pode ser incluída no formato .lbr). Definir os parâmetros da seguinte forma: Max. Diferença de RI: 10, pontuação de corte: 0.9, puro/impuro composição: 0.5, número de fragmentos: 2, número mínimo de idêntico frag.: 1. uso dimensionado lib: assinalada; Pontuação de similaridade: Semelhança de caracteristicas; Filtro de massa: m/z 207, 221, 281, 355 e 1147 (para contaminantes conhecidos decorrentes da fase estacionária da GC-coluna).
    4. Na folha de quantificação definir os parâmetros para: número de íons de quantificação: 3, uma distância mínima entre os íons subsequentes: 5 e o índice de qualidade mínima requerida: 1. excluir os íons de quantificação 207, 221, 281, 355 e 1147.
      Nota: No caso de dados de MS de alta resolução, além disso definir os seguintes parâmetros na folha de centroide para: limiar pico começar: 10, final de limiar de pico: -5 e a distância máxima da linha de base: 30, FWHM: 0,5.
  2. Importar os arquivos na. Formato CDF contido no gerados. Arquivo de projeto AIA como. NetCDF no software MetaboliteDetector, selecionando arquivo | Importação | NetCDF importação. Escolha o ícone em forma de pasta e selecione os arquivos para as categorias de amostra a ser importado e processado: 1) solvente-branco, 2) RI calibrants, extrato de conteúdo 3) MGR e extrair conteúdo 4) DG. Confirme com Okey para iniciar o processamento de dados. Após o processamento, selecione fechar na janela aparecendo.
  3. Para a calibração do RI e determinação dos valores do RI para compostos contidos no extrato MGR, selecione arquivo | Abra e escolha o arquivo que contém os dados do calibrants a RI.
    1. Depois que o arquivo de calibrant de RI é aberto, selecione o ícone de lupa . Confirme a janela aparecendo com Okey.
    2. Para a calibração adequada de RI, verifique a gama de alcanos detectáveis no arquivo calibrant RI.
      1. Para este efeito, selecione o triângulo aparecendo por baixo o máximo, o primeiro pico, provenientes do primeiro alcano (com o menor RT, Figura 6) detectável clicando uma vez nele.
      2. Verificar o sucesso com a mais alta similaridade de espectro ('Sim especs.', pontuação máxima = 1) em comparação com as entradas de biblioteca do alcano (Figura 6).
      3. Para verificar a identidade do alcano sugerido composto, compare seu espectro de massa para o espectro de massa dado na literatura, por exemplo, NIST WebBook de química22.
      4. Determine o último alcano detectável na mistura calibrant RI contando até o último pico de alcano aparecendo no cromatograma.
    3. Para a calibração de RI, selecione Ferramentas de | Assistente de calibração RI. Selecione próximo.
    4. Clique sobre o ícone em forma de pasta e selecione o arquivo que contém o cromatograma da mistura de calibrant de RI. Selecione próximo.
    5. Selecione a biblioteca que contém as entradas para o alcano calibrants na janela apareceu.
    6. Selecione as entradas da biblioteca de todos os alcanos detectáveis no arquivo calibrant RI e clique o >> ícone. Depois de selecionar >>, escolher próxima.
    7. Verifique os RTs listados para cada alcano detectável na tabela aparecendo. Para este fim, verificar os RTs retratados na janela principal para cada alcano clicando sobre o respectivo triângulo (Figura 7). Se necessário (Figura 8), corrigir o RT na tabela de calibragem manualmente clicando duas vezes no respectivo campo, selecionando o menu drop-down e escolher que o correto sugeriu RT. como alternativa, digite o RT com a ajuda do teclado ( A Figura 9).
    8. Quando o RT para cada alcano é correto, selecione próximo. Clique em Next na janela aparecendo mostrando a tabela de calibração do RI.
    9. Selecione o símbolo verde + na janela de Seleção de cromatograma aparecendo, escolher o arquivo de dados do solvente-branco e os arquivos da glândula extratos e selecione próximo. Defina as configurações de parâmetro na janela aparecendo como segue: desativação do ajuste da linha de base, limiar de pico: 5, altura mínima: 5, escaninhos/Scan: 10 e largura de deconvolução: 5. próxima e depois Iniciar para executar o cálculo de RI de os compostos contidos nos arquivos de amostra seleccionada.
  4. Para anotação e identificação dos metabolitos escolhidos no extrato MGR, abra o arquivo de dados do extracto conteúdo MGR medido, para que o RIs foi calculado como descrito acima (passo 5.3.9), selecionando arquivo | Abra e escolha o arquivo de dados desejado.
    1. Selecione ferramentas | Configurações | Deconvolução e alterar o limiar de pico, bem como a mínimo altura do pico (unidades de ruído) ambos para 5. Selecione o ícone de lupa e confirme a janela de aviso aparecendo novamente com Okey.
    2. Clique em um triângulo aparecendo por baixo o máximo de um pico de interesse e comparar o seu espectro de massa com aqueles armazenados na biblioteca do NIST, selecionando o ícone do NIST .
    3. Selecione o primeiro hit resultante da NIST-pesquisa (Figura 10).
    4. Se a similaridade de espectro resultante do composto de interesse está acima da Pontuação de similaridade de espectro escolhido (aqui ≥ 0,9) em comparação com uma entrada de NIST (Figura 10), procure o RI (semelhante fase estacionária do GC coluna, espessura de película e coluna diâmetro) dado para este composto na literatura (por exemplo, NIST WebBook de química22).
    5. Calcule a diferença relativa entre a referência do NIST RI (ou o RIs em média quando vários valores do RI são dadas) e o RI derivado experimentalmente. Se a diferença for igual ou menor que o valor especificado pelo usuário máximo tolerado (aqui, ≤ ± 1%), designar o composto como 'anotadas'.
    6. Repita as etapas 5.4.2–5.4.5 para todos os compostos de interesse contidos no arquivo de amostra MGR.
    7. Para identificação de compostos, comparar o RI e espectros de massa das soluções-padrão (por exemplo, 2-100 mg/L) medidos nas mesmas condições, conforme descrito na seção 4 dos compostos anotados.
    8. Analisar o padrão, conforme explicado na seção 4 e processar os dados resultantes, conforme descrito para o alcano - MGR glândula conteúdo dados e nas etapas 4.4 e 5.2.
    9. Calibrar os dados adquiridos do padrão selecionando Ferramentas de | RI-calibração assistente | Próxima e escolhendo o mesmo arquivo de calibrant RI como usado antes. Selecionar próxima, então novamente próxima e selecione o arquivo que contém os dados adquiridos a partir da solução padrão clicando no símbolo verde + . Bateu próximo e então começar a calcular o RI para o composto padrão.
      Nota: Se a análise da norma não pode ser executada imediatamente após a análise da amostra, é recomendável analisar calibrants RI novamente e realizar nova calibração do RI e cálculo para o padrão.
    10. Abrir o respectivo ficheiro para o padrão e confirmar a sua identidade por comparação de seu espectro com o NIST-biblioteca, conforme explicado na etapa 5.4.2.
    11. Após a confirmação da identidade do padrão, adicione o espectro de massa e RI do padrão composto à biblioteca in-house. Para este efeito, clique sobre o símbolo verde + e insira o nome preferencial de entrada da biblioteca. Confirme com Okey para adicionar o espectro de massa e o RI do composto para a biblioteca padrão. Se a nova entrada não pode ser vista na biblioteca, ative o botão Atualizar .
      Nota: Se a calibração do RI foi executada com êxito, o RI determinado pelo MetaboliteDetector vai aparecer na biblioteca-entrada respectiva. Depois de criar a entrada da biblioteca para o padrão, a identificação deste metabólito no extracto de MG com base em uma combinação do RI e espectros semelhança é possível.
    12. Abra o arquivo de dados de conteúdo do MGR novamente. Selecione ferramentas | Configurações | Identificação. Agora, como o RI do padrão composto é calculado e adicionado à entrada da biblioteca, altere a Pontuação de similaridade de Similaridade de espectro para Pontuação combinada.
    13. Clique no ícone da lupa e selecione o triângulo abaixo o composto que tenha sido anotado na etapa 5.4.5.
    14. Clique sobre o hit e verificar o valor dado para a pontuação de similaridade' geral' (OSS, abreviado por Detector de metabólito como 'Global simil.'), considerando-se uma combinação de espectro semelhança e similaridade de RI Pontuação (Figura 11).
      Nota: Se uma batida foi encontrada na biblioteca de portas adentro, ele será exibido no lado direito da janela principal.
    15. Se o OSS é acima do limiar definido pelo usuário (aqui ≥ 0,9, também indicado pela cor verde do triângulo), designe o composto como 'identificados' (Figura 11).

6. verificação do extrato de MGR conteúdo para contaminações por DG conteúdo

  1. Abra o arquivo calibrado da DG amostra para que o RIs dos compostos já foram calculado com MetaboliteDetector (etapa 5.3.9).
  2. Para uma sobreposição do cromatograma obtido após a medida da amostra conteúda MG e a amostra DG, selecione Ferramentas de | Cromatograma sobreposição e escolher os dois arquivos respectivos através do ícone verde + . Confirme com Okey.
  3. Para exibir a sobreposição, selecione a folha de Sobreposição do cromatograma aparecendo na parte inferior da janela.
  4. Seleção para sobreposição de compostos entre o conteúdo MGR extrair (Figura 12) e o conteúdo DG extrair e excluir sobreposição compostos de posterior análise de conteúdo MGR.

Resultados

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Um fluxo de trabalho esquemático, listando as etapas experimentais à identificação de metabólito putativo nas secreções das glândulas de c. explodens é mostrado na Figura 13. Além disso, uma visão geral esquemática das partes do corpo mais importantes de formigas do trabalhador COCY usadas para o experimento apresentado é fornecida como complementar S1 Figura A, B. As principais etapas da dissecação das formigas até identificação de metabólito putativo no conteúdo MGR são ilustradas no Complementar figura S2.

Para isolar o conteúdo MGR adequado para análise de volatilome, um estado de refrigeração foi mantido durante o transporte, armazenamento e também durante o processo de dissecção. Para este efeito, as formigas estavam congeladas imediatamente após sua coleção com o uso de um aspirador de insetos (seção 1 e Figura 1) em situ. Após armazenagem por 2 dias no congelador-20 ° C, as amostras de formiga foram transportadas em gelo seco para a Áustria, onde foram imediatamente colocadas a-80 ° C até posterior análise. Adequado para ser escolhido para o isolamento de seu conteúdo MGR de formigas apresentam uma região da Suíça que é redonda e intacta (Figura 2A) e na melhor das hipóteses bem abastecido com conteúdo MGR, conforme indicado pelo MGR visível entre a mesossoma (Figura 2B). Gasters de formigas que não são adequadas para posterior análise são mostrados na Figura 2, D. As principais etapas (passos 2.3-2.6) envolvidas no processo de isolamento dos conteúdos MGR de formigas COCY são ilustradas na Figura 3. O conteúdo MGR isolado (amarelo no caso de c. explodens, mas as cores pode variar de branco ao vermelho em outras espécies pertencentes ao grupo COCY) é mostrado na Figura 14.

Quando as formigas para seu conteúdo MGR de dissecação, deve ter cuidado para não perfurar ou romper qualquer outras glândulas ou dos intestinos (etapa 2.5). A Figura 4 mostra uma Suíça dissecado formiga que contém ainda duas outras, intactas glândulas (DG e VG) após o isolamento do conteúdo MGR. Um exemplo de contaminação visível pelo conteúdo dos intestinos formiga é mostrado na Figura 15. Desde que a contaminação cruzada com conteúdo DG, localizado sob o MGR, não pode ser evitada completamente, uma parte do protocolo é retratada para analisar estas glândulas para comparação dos sinais resultantes com os sinais a partir do extrato de conteúdo MGR (secção 6). Quando o procedimento de dissecação é feito corretamente, é possível obter cerca de 0,75-1,2 mg de conteúdo MGR por formiga. Para o protocolo descrito aqui, conteúdo MGR de cinco formigas foram agrupado para receber amostras repetitivas de 3,9-5,9 mg cada.

O conteúdo do reservatório isolado glândula foram extraído com AcOEt (seção 3) e analisado por GC-MS (secção 4). A medição do conteúdo o MG de extracto de explodens c. formigas do trabalhador resulta em um cromatograma, constituído de picos e espectros de massa para dezenas de putativos compostos de conteúdo MGR (Figura 5). Os dois metabólitos dominante 1-(2,4,6-trihydroxyphenyl)-ethanone (ID 4) e 5,7-dihydroxy-2-methylchromen-4-one (5 ID) no MG conteúdo extrato causado sobrecarga de coluna, é por isso que a mesma amostra foi analisada novamente no maior dividido ratio de 50: 1 ( Figura 5, inserir). Por exemplo, possível contaminação do conteúdo pelos constituintes da DG MGR seria visível como adicionais picos no cromatograma GC-MS exibindo atrasados RTs, a partir de cerca de minuto 29 (Figura 12). Também excluir picos cromatográficos e espectros de massa de compostos encontrados no solvente-branco, originário da fase estacionária da coluna GC, ou do conteúdo da DG presente na Suíça a formiga e posterior processamento com o MetaboliteDetector software resultou em cerca de 110 compostos de conteúdo MGR com um sinal-ruído relação ≥ 10. Para posterior anotação metabólito e identificação com o software MetaboliteDetector, os cromatogramas foram calibrados e os valores de RI foram determinados para os arquivos de amostra medido (etapa 5.3 e subetapas, Figura 6, Figura 7 , Figura 8 , A Figura 9). Os detectados metabolitos putativos MGR conteúdos foram anotados com base em uma combinação de similaridade de espectro para a NIST-biblioteca, que formou uma parte integrante do software MetaboliteDetector no exemplo apresentado (passo 5.4 e subetapas, Figura 10 ). Além disso, RI valores encontrados na literatura para a fase estacionária iguais ou comparável, espessura de película e diâmetro da coluna GC foram consideradas para anotação composta (etapas 5.4.4 e 5.4.5). Depois de definir critérios de correspondência estritos e confirmação do RIs e espectros de massa pelo uso de padrões, conforme explicado na seção de protocolo para um padrão composto (5.4.7-5.4.15 passos e Figura 11), foi possível confirmar a identidade de cerca de 10 % dos metabolitos detectados. Desde que um relatório pormenorizado sobre a volatilome do conteúdo de explodens c. MGR será publicado em outro lugar, o presente estudo centrou-se esses metabólitos que já foram descritos em uma publicação anterior por Jones et al . 17 (espécie neste documento designado como KB02-108; ver também Cook et al 23). a tabela 1 fornece uma visão geral destes compostos identificados.

Diagrama de configuração experimental de um tubo em malha com T1 e T2 em sistema de cromatografia.
Figura 1: esquemático, desenho de um inseto sugador. Em uma tampa que sela um frasco ou recipiente, são feitos dois orifícios, onde dois tubos flexíveis são colocados através de. A abertura de um tubo (T1) voltada para o interior do frasco é selada com uma malha fina o suficiente bloquear os insetos. Além disso, buracos são feitos no tubo para facilitar a troca de ar. A extremidade do tubo T2 é apontada perto para os insetos que são sugados para o frasco de amostragem aspirando através de T1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Diagrama de segmentação do abdome de formigas com tergitos marcados T1-T5; análise microscópica em escala de 1 mm.
Figura 2: intacta contra Suíça quebrada. (A) intacta gaster apropriado para dissecação. Gaster intacto (B) quase totalmente preenchido com conteúdo MGR, também adequado para dissecação. (C) e (D) quebrado gasters da formiga com conteúdo MGR ejetado e endurecido (amarelo), possivelmente quebrados durante a ruptura do tegumento da Suíça durante a amostragem. Estas formigas são excluídas da dissecação, extração e posterior análise. T: tergite. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Processo de dissecção do abdômen do inseto, imagem do microscópio, identificação da ferramenta, segmentos marcados T1-T4.
Figura 3: principais etapas envolvidas no processo de dissecação. (A) separação da região Suíça do resto do corpo da formiga. (B) descascando o exoesqueleto: tergite 1 tergite 2 (C) e tergite 3, após o qual o conteúdo das MGRs coloridos amarelos emparelhados é quase completamente visível (D). (E) removendo o conteúdo MGR pegajoso com a ajuda de uma agulha de dissecação. T: tergite. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Imagem micrográfica da anatomia dissecada de Drosophila mostrando glândulas (DG) e vesículas (VG), marcadas.
Figura 4: gaster formiga após isolamento dos conteúdos MGR. As duas outras glândulas presentes na Suíça (VG: glândula de veneno e DG: glândula de Dufour) pode ser visto. Após a remoção do conteúdo MGR (sobras após isolamento pode ser visto em amarelo), ambos os compartimentos devem estar intactos. Estas glândulas podem ser analisadas da mesma forma como o conteúdo MGR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Gráfico de cromatografia, mostrando abundância de compostos vs. tempo de retenção, destacando picos de Noreugenina.
Figura 5: cromatograma de (TIC) atual representante íon total do extrato conteúdo MGR. Os dois picos mais abundantes de GC-MS resultaram em mais simetricamente em forma de picos cromatográficos, quando uma maior taxa de divisão (50: 1) foi escolhida em vez da proporção de 2:1 regular (ver em baixo-relevo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados da cromatografia gasosa; tempo de retenção e análise espectral para compostos de alcanos, m / z 128.
Figura 6: determinação da primeira alcano detectável no cromatograma do calibrant RI. O triângulo abaixo o máximo de pico do primeiro pico de alcano é selecionado. O alcano elutes min 6,31 e mostra a maior similaridade de espectro (aqui, 'Sim especs.') para a entrada da biblioteca 'Alkane_C09'. Para confirmar a identidade do alcano, o espectro de massa é comparado a uma biblioteca (por exemplo, NIST WebBook de química22). No exemplo apresentado, nonano é identificado pelo seu íon molecular com um valor de m/z de 128. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Gráfico de cromatografia com tabela de calibração; análise do tempo de retenção para separação de compostos.
Figura 7: calibração de RI com o uso de uma mistura padrão de n-alcanos. O RI calibrant arquivo de dados foi aberto e a função de 'RI--assistente de calibração' escolhido. A correspondência correta do tempo de retenção para o RI retratado na tabela de calibração deve ser verificado. O RT de 6,31 min para alkane_C09 (nonano) é exibido corretamente na tabela. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Análise por cromatografia gasosa; Diagrama dos tempos de retenção dos compostos e dos dados de calibração dos alcanos.
Figura 8: errado RTs são exibidas na tabela de calibração. Os RTs não são exibidos corretamente (seja indicado por um valor errado de RT ou por um valor de RT ausente exibido como -1). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Análise por cromatografia; Gráfico TIC; configuração de calibração; dados de tempo de retenção; espectrometria de massa.
Figura 9: correção Manual de RTs errados na tabela de calibração. Os valores errados podem ser corrigidos manualmente, inserindo o RT correto para o alcano respectivo, conforme mostrado aqui para Alkane_C39. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Análise por espectrometria de massas; TIC e gráfico de espectros; processo de identificação do composto mostrado.
Figura 10: comparação do espectro de massa do composto escolhido para entradas do NIST-biblioteca. Depois de selecionar o pico máximo de eluição em 6,16 min (RI 891) e ativação da função 'NIST-pesquisa' (círculo vermelho), é exibida uma similaridade de espectro de 0,99 para 2-heptanone. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Diagrama de cromatografia, TIC, comparando compostos detectados vs. de biblioteca para análise de similaridade espectral.
Figura 11: identificação de metabólito no extracto de conteúdo de MGR. O espectro de massa e o RI proveniente do composto de eluição em 891 RI no cromatograma da amostra são comparados com as entradas de portas adentro biblioteca contendo RIs e espectros de compostos padrão medidos. Se a 'semelhança pontuação geral' (OSS, abreviado em metabólito Detector como 'Global simil.' implementação de espectro de massa e RI) entre um composto na biblioteca interna e um composto na amostra de arquivo é ≥ 0,9, o composto é designado como 'identificado'. Aqui, a OSS entre a entrada da biblioteca interna da 2-heptanone e o composto de eluição em 891 RI é 0,96, extrair o que resulta na identificação de 2-heptanone no conteúdo MGR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Gráfico de cromatografia; Extratos de glândula mandibular de Dufour; comparação de pico, análise do tempo de retenção.
Figura 12: sobreposição de seções do cromatograma TIC (min 29 para min 35) do conteúdo DG extrair (vermelho) e o conteúdo MGR extrair (azul). Áreas de pico correspondente à sobreposição de compostos (putativos) são mais elevadas em conteúdo, extraia o extrato do que no conteúdo MGR; a DG Estes compostos potencialmente originam o DG e, portanto, são considerados como contaminantes (menores) no conteúdo MGR extrato. No caso do extracto de conteúdo explodens c. MGR, os picos cromatográficos provenientes de uma contaminação de DG putativa podem ser encontrados em cerca de 29 min, e esta parte do cromatograma pode ser excluído da posterior análise do conteúdo MGR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Fluxograma de análise de secreção de formigas; GC-MS, processo de identificação de metabólitos, etapas de extração da glândula.
Figura 13: trabalho esquemático de amostras de formiga a metabólito anotação/identificação no conteúdo do reservatório de glândula extrai após análise de GC-MS. O protocolo apresentado aqui explica tudo experimentais passos a partir de isolamento dos conteúdos através de dissecação da formiga e análise por CG-em MGR bem como avaliação de dados (indicada em preto). Como alternativa, a secreção de insetos também pode ser gerados e coletados em situ (indicadas em cinza). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Diagrama de desenvolvimento de sementes; comparação na escala de ~ 1 mm; microscopia para estudos botânicos.
Figura 14: isolado ceroso conteúdo MGR antes da extração. (A) o conteúdo do MGRs dois juntos, mas (B) também podem ser separados após o isolamento. Em c. explodens, a cor do conteúdo MGR é laranja-amarelado, mas pode variar do branco ao vermelho em outras espécies do grupo COCY. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Close-up da amostra de tecido (~ 1 mm) mostrando danos por queimadura, usado em análise forense e teste de material.
Figura 15: ilustração de uma secreção de MGR isolada Cruz-contaminados por constituintes do intestino do inseto (marrom). Esses tipos de MGR isolados são excluídos de extração e posterior análise. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

IDMetabólitoNome trivialSequência de caracteres InCHIFórmula da soma
1Heptan-2-onaInChI=1S/C7H14O/c1-3-4-5-6-7 (2) 8/ h3 - 6H 2, 1-2H 3C7H14O
2n-undecanoInChI=1S/C11H24/c1-3-5-7-9-11-10-8-6-4-2/h3-11H2,1-2H3C11H24
3n-HeptadecaneInChI=1S/C17H36/c1-3-5-7-9-11-13-15-17-16-14-12-10-8-6-4-2/h3-17H2,1-2H3C17H36
41-(2,4,6-Trihydroxyphenyl)-ethanoneMonoacetylphloroglucinolInChI = 1S/C8H8O4/c1-4 (9) 8-6 (11) 2-5 (10) 3-8 12/h2-3,10-12 H, 1 H 3C8H8O4
55,7-dihydroxy-2-methylchromen-4-OneNoreugeninInChI = 1S/C10H8O4/c1-5-2-7 (12) 10-8 (13) 3-6 (11) 4-9 (10) 14-5/h2-4,11, 13H, 1H 3C10H8O4

Tabela 1: metabólitos identificados no AcOEt extrair o conteúdo de MGR isoladas de formigas do trabalhador menor de c. explodens . Metabolitos selecionados são apresentados.

Figura complementar S1. Visão geral das partes do corpo mais importantes pertencentes a formigas COCY (trabalhadores menores) apresentados neste manuscrito. (A) The MGRs são mostrados em amarelo. Sua porção gastral é usada para análise de volatilome. (B) a porção gastral dos MGRs situa-se abaixo mesossoma 1 a 3. T: tergite. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura complementar S2. Visão esquemática do experimento apresentado. As principais etapas de dissecação da formiga até putativa identificação de metabólitos presentes no conteúdo MGR são ilustradas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este manuscrito, apresentamos um protocolo completo para analisar a volatilome do conteúdo encontrado nos hipertrofiado MGRs de formigas do trabalhador menor de c. explodens . Desde as formigas usadas aqui podem 'explodir' e ejetar seu conteúdo MGR de forma descontrolada quando tocou com fórceps, é recomendável usar uma técnica de coleção 'suave', tal como previsto por um aspirador de insetos (Figura 1). Para algumas espécies de formigas, incluindo formigas COCY, pode ser necessário limitar o número máximo de formigas de cinco indivíduos por frasco de 50 mL, pois caso contrário auto-envenenamento das formigas (por exemplo, pelo acúmulo de ácido fórmico no headspace) pode ocorrer. Para congelar as formigas no campo, pode ser utilizado um saco bem recheado com bolsas de gelo congeladas. As amostras devem ser rapidamente congeladas e conservadas sob condições de refrigeração (por exemplo, -20 ° C, melhor a-80 ° C), mas não é recomendável para matar e armazenar as formigas em nitrogênio líquido, desde que foi observado aumento de dano de suas glândulas com este método.

A metodologia de dissecação apresentados reserva - e solventes é adequada para obter o conteúdo do reservatório de cera, como glândula mandibular, bem como outras glândulas presentes em formigas do trabalhador congelado. Para análise de volatilome de conteúdo MGR de c. explodens, os principais aspectos a considerar durante a dissecção são resfriamento contínuo da formiga (etapa 2.1.4) e minimizando a Cruz-contaminações das amostras com outros conteúdos/fluidos de glândula presentes em MG a Suíça de formiga (passo 2.5, Figura 4e Figura 15). Uma fração considerável das formigas congeladas pode ser danificada, ou porque as formigas 'explodiram' durante a amostragem ou foram danificadas durante o transporte em gelo seco do local da recolha de amostras para o laboratório. Se a região Suíça é quebrada, estas formigas não são adequadas para posterior análise (Figura 2, D). Se apenas antenas e pernas estão faltando ou quebrado, estas formigas ainda podem ser utilizadas para a extração do conteúdo MGR e posterior análise. Desde que o conteúdo MGR de refrigeração explodens c. formigas têm uma consistência de cera é direta para isolá-los com o uso de agulhas de dissecação (etapa 2.5 Figura 3Ee Figura 14). Cuidado adicional deve ser tomado durante a manipulação o MGR pegajoso conteúdo. Ele pode aderir a qualquer coisa entrar em contato físico com ele e muitas vezes também vai aderir a pinça de dissecação, o que aumenta o risco de contaminação de outras amostras. É necessário apenas tocar o conteúdo MGR com a agulha de dissecação e imediatamente transferi-lo para os frascos de vidro utilizados para a extração (passos, 2.5 e 2.6). Além disso, é recomendável limpar o equipamento de dissecação com uma mistura de2O MeOH/H ao alternar entre formigas ou tipos de glândula (etapa 2.8).

Conteúdo de glândula de outras espécies de formigas pode estar presente em estado líquido nem durante o resfriamento com bolsas de gelo. Neste caso, a glândula inteira, incluindo a membrana primeiro de maio ser isolada e perfurou-se depois para obter o conteúdo. Secreções de líquido também podem ser obtidas com a ajuda de pipetas capilares bem. Com um comprimento de corpo médio de cerca de 4-5 mm (sem antena), trabalhadores de c. explodens pertencem à espécie menor do grupo COCY. Sua muitas vezes inchada Suíça é composto por cerca de 2 a 2,5 mm de comprimento e 1 a 1,5 mm de largura. Trabalhadores da tão longe maior espécie conhecida do grupo COCY podem atingir um tamanho de cerca de 8 mm de comprimento, com um tamanho de Suíça de cerca de 3 mm de comprimento e 2,5 mm de largura. Desde que o protocolo é bem adequado para dissecar e investigar as formigas individuais e gasters do que o tamanho de diferentes espécies COCY, o aqui utilizaram instrumentos de dissecção e microscópio pode ter que ser adaptado para ser aplicável para formigas menores ou órgãos menores. Além disso, o número de formigas por amostra analítica pode ter que ser aumentado também.

Ao mesmo tempo dissecando a formiga para o conteúdo MGR, é fundamental para não danificar qualquer outras glândulas ou intestinos - cujo conteúdo pode Cruz-contaminar a amostra (etapa 2.5, Figura 4 e Figura 15). No caso ideal, após a extração do conteúdo MGR, a DG, bem como o VG são visivelmente mantido intacto (Figura 4). Contaminações com o conteúdo da DG, que está localizado abaixo do MGRs, são difíceis de evitar completamente. Razões para isso também podem incluir o rompimento parcial da integridade da glândula durante o transporte em gelo seco de amostragem-site para o laboratório. Também é possível que a DGs danificadas durante a amostragem ou no processo de explosão, como temos notado para o MGR em um número de formigas investigadas. Desde que o conteúdo do DG pode ser analisado da mesma forma como o MGR Sumário (seções 3 e 4), os resultados podem ser comparados com os dados resultantes após a análise das amostras de conteúdo MGR (secção 6). No caso de extratos de conteúdo MGR obtidos de formigas de c. explodens , os compostos também contidos o DG começam a eluir tarde no cromatograma (Figura 12). Para evitar confundir DG compostos para constituintes MGR, os respectivos metabolitos podem ser excluídos da análise adicional. De estudos em outras espécies de formiga é conhecido que DGs podem também conter compostos voláteis (altamente)1,24, que tipicamente eluir cedo no GC-cromatograma.

Em estudos anteriores, a lidar com a composição química do conteúdo do COCY MGR formigas, formigas toda ou suas gasters todo foram analisados16,17,18,23, Considerando que o conteúdo aqui o MGR se foram obtidos através de dissecação das formigas.

Analisando dissecado MGR de conteúdo permite que os investigadores realizar uma ampla gama de estudos bioquímicos, incluindo a identificação dos metabolitos nele contidas. Desde que o estudo realizado aqui focado na identificação das substâncias voláteis contidos o MGR de c. explodens, GC-MS foi escolhido pela sua análise (secção 4). Para isso, os extratos devem idealmente ser medidos imediatamente após o preparo ou armazenados a-80 ° C até análise. Note-se que o armazenamento (estendido) podem causar alterações químicas dos extratos (ver notas após passos 3.3 e 4.2). Desde que a concentração dos conteúdos MGR pode abranger uma gama de várias ordens de magnitude, pode ser necessário analisar os extratos MGR no GC diferente rácios de dividir. Desde que os dois principais compostos no conteúdo MGR extrair das formigas tomadas para exemplificar o protocolo causado a coluna sobrecarga quando utilizou-se uma relação de divisão de 2:1, esta amostra foi analisada uma segunda vez em uma maior taxa de divisão de 50: 1 (passo 4.3.1.2and Figura 5). As configurações de parâmetro de GC-MS apresentadas na seção 4 são apropriadas para dados gerados com os dispositivos de GC-MS especificados na Tabela de materiais. Ao lado do RI calibrants (etapa 4.1.1), um solvente-branco (etapa 4.1.2) também deve ser analisado para reconhecer os artefatos não-biológicos e contaminantes durante a análise de dados subsequentes. Para identificação do metabólito, também é importante medir padrões autênticos de compostos anotados sob as mesmas condições de GC-MS utilizado para analisar os extratos de amostra (a seguir 5.4.7and passos). Para melhorar a precisão e a confiabilidade dos dados finais, é aconselhável analisar todas as categorias de amostra (solvente-branco, RI calibrants, extratos de amostra e padrões) dentro da mesma sequência de medição. Além disso, os padrões de fé devem ser analisados em concentrações comparáveis às observadas para os extratos de amostra. Isso ajuda a melhorar a precisão dos valores de RI e a similaridade entre a amostra e espectros de massa padrão, que vão finalmente levar a anotação/identificação do metabólito maior e mais significativo. Para este fim, as normas podem ser repetidamente medidas utilizando factores de divisão diferente.

Para identificação do metabolito, o software sofisticado, MetaboliteDetector é usado para comparação de espectros e RI e deconvolução de espectros para um implementado NIST-biblioteca, bem como uma biblioteca interna estabelecida (secção 5). Recomenda-se para executar o MetaboliteDetector em um de 64 bits baseados em LINUX sistema operacional (por exemplo, KUBUNTU) e copiar o gerado *. Arquivos de dados do CDF (etapa 4.4) do dispositivo de armazenamento portátil de dados para o disco rígido local. MetaboliteDetector é capaz de importar dados brutos do GC-MS no centroide ou perfil netCDF formato. O software da maioria dos instrumentos de GC-MS deve ser capaz de converter os dados gravados neste formato19. Antes de iniciar a análise dos dados, é altamente recomendável ler a literatura disponível para versões anteriores do software MetaboliteDetector para se familiarizar com os recursos e os de19,de interface gráfica do usuário25, 26.

Para a calibração do RI e subsequente cálculo de valor RI dos picos de compostos presentes nos extratos de amostra, uma biblioteca que contém RIs e espectros de RI calibrants (aqui, n-alcanos) é usada. Uma biblioteca pode ser Self estabelecida, ou um preexistente ('CalibrationLibrary_Alkanes') pode ser baixado27. A biblioteca de calibrant padrão fornecido contém RIs e espectros para n-alcanos variando de C09 a C39 que foram analisados conforme descrito na seção 4. A biblioteca fornecida permite que os usuários trabalham com Detector de metabólito para iniciar diretamente com o processo de calibração de seus dados. Se necessário, esta biblioteca também pode ser estendida com entradas adicionais para mais alcanos. Com base na similaridade de referência e RIs derivadas experimentalmente e espectros de massa (veja etapa 5.3 e subetapas, Figura 7, Figura 8, Figura 9), anotação ou identificação dos compostos pode ser executada (passo 5.4 e subetapas, A Figura 11). Também é crucial que após tratamento automatizado de dados com MetaboliteDetector, o usuário manualmente vai verificar para pico correta colheita e espectro deconvolução inspecionando espectros de massa subjacente o "triângulo" para cada composto putativo de interesse. Além disso, dependendo da instrumentação de GC-MS e as configurações de parâmetro usadas para geração de dados, podem ser necessárias adaptações das configurações MetaboliteDetector apresentadas. O software MetaboliteDetector é capaz de realizar muitas operações mais útil do que este manuscrito, por exemplo, a exibição de cromatogramas de (EIC) atuais extraído do íon, exportação de cromatogramas explicada como CSV, lote-quantificação automática de compostos e muitos mais.

O protocolo apresentado neste manuscrito pode servir como sugestão para experimentos realizados por outros pesquisadores, com foco em isolamento de glândulas ou conteúdo de glândula de insetos, volatilome análise, bem como a identificação do metabólito.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Financiamento para este estudo foi obtido através da ciência de Viena e o fundo de tecnologia (WWTF) LS13-048 DSi. Agradecimentos especiais vão para Diane W. Davidson (Universidade de Utah; agora aposentado) por compartilhar seu conhecimento sobre as formigas Bornean COCY conosco. Nós apreciamos as administrações do Kuala centro de estudos de campo Belalong (KBFSC) e Universiti Brunei Darussalam (UBD) para aprovação do projeto, bem como do Brunei departamento florestal e do Brunei pesquisa e centro de inovação, solicitando permissão para coletar formigas e aprovação e emissão de licenças de exportação. Agradecimentos especiais vão para UBD e KBFSC pessoal, especialmente morcego Santos de Muhammad bin Abdullah, Teddy Chua Wee Li, Masnah Mirasan, Rafhiah Kahar, Roshanizah Rosli, Rodzay Wahab, Chan Chin Mei e Kushan Tennakoon para facilitar a nossa investigação.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo 50 ml, 115 x 28 mm, fundo plano/cônico PPSarstedt62.559.001ver Figura 1 no manuscrito
Tubos de PVCRehau290 4489ver Figura 1 no manuscrito
Malha, aço inoxidável, malha de 0,63 mmAntstore1000378ver Figura 1 no manuscrito
FreezerSeverinKS 9890 -20 & Caixa
espuma de poliestireno C ou inferior, dimensões internas 155 mm x 100 mm x 45 mmThorsten Koch4260308590481
Placa de Petri, vidro, 100 mm x 15 mmAldrichBR455742
Cold pack 150 mm x 100 mmElite Bags1998congelar para -20 ° C
Balde com gelo
Frascos de rosca curta de 1,5 mL, 32 x 11,6 mm, vidro transparente, 1ª classe hidrolítica, aberturaampla La-Pha-Pack11090500
Tampas de rosca para frascos de rosca curta de 1,5 mL, fechado, septo branco de silicone/PTFE vermelho, 55° shore A, 1,0 mmLa-Pha-Pack9151799
EstereomicroscópioBresser5806100
Fórceps, Ponta Superfina curvadaMedizinische Instrumente May, Norman MayPI-0005B
Fórceps, Ponta Superfina retaazulINOXBL-3408
Agulha de dissecção 140 mm, pontiaguda, retaHeinz Herenz Medizinalbedarf GmbH1110301
Metanol, LC-MS CHROMASOLV, Honeywell Riedel-de Haë nfisher scientific15654740
Água
Rotizell-Tissue-Tü cherCarl Roth GmbH + Co.KG0087.2
Éster etílico de ácido acético ROTISOLV ≥ 99,8 %Carl Roth GmbH + Co.KG4442.1congelar para -20 &graus; C
Vortex Genie 2neoLab7-0092
Micro-inserts de 0,1 mL para Frascos de Rosca Curta de 1,5 mL, 31 x 6 mm, vidro transparente, 1ª classe hidrolítica, ponta de 15 mm La-Pha-Pack06090357
tampas de rosca para frascos de rosca curta de 1,5 mL, com furo, septo de Borracha Vermelha/PTFE,  45° shore A, 1,0 mmLa-Pha-Pack9151819
solução padrão de alcano C8-C20Sigma-Aldrich 04070
Solução padrão de alcano C21-C40Sigma-Aldrich 04071
n-Hexano SupraSolvMerck104371
GC-amostrador automático, por exemplo, MPS2XL-TwisterGerstel
Agilent Cromatógrafo gasoso 6890 NAgilent
Gooseneck splitless linerRestek22406
Hélio (5.0 - F50)Messer102532501
coluna capilar GC HP-5MS UI 30 m × 0,25 mm e vezes; 0,25 µ mAgilent19091S-433UI
Agilent Detector Seletivo de Massa 5975BAgilent
MSD ChemStation Análise de Dados Software de aplicação Software Agilent
MetaboliteDetector (3.1.Lisa20170127Ra-Linux)Hiller Kdownload de: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10
Biblioteca de calibração para MetaboliteDetectorHiller Kdownload de: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10
Ferramenta de conversão MD para biblioteca NISTHiller Kdownload de: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10
de picadodestilada

Referências

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