Reparação de quebras de DNA dobro-costa é um processo dinâmico, que exige não só a formação de complexos de reparação em intervalos, mas também sua resolução após a lesão é dirigida. Aqui, usamos microscopia de imunofluorescência para quebras de dupla-hélice transitórias e duradouro como uma ferramenta para dissecar esse mecanismo de manutenção do genoma.
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Artigo de método
Caracterizando os processos de reparação do DNA no transitório e duradouro dobro-Costa quebras de DNA pela microscopia de imunofluorescência
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O reparo de quebras de dupla-hélice (DSBs) no DNA é um processo altamente coordenado, exigindo a formação e a resolução de complexos de proteína multi reparo. Este processo é regulado por uma miríade de proteínas que promovem a associação e dissociação de proteínas para essas lesões. Graças, em grande parte para a capacidade de executar telas funcionais de uma vasta biblioteca de proteínas, há uma maior valorização dos genes necessários para a reparação de ruptura do DNA dobro-costa. Telas de inibidor frequentemente nocaute ou química identificam proteínas envolvidas em processos de reparação usando toxicidade aumentada como um marcador para uma proteína que é necessária para o reparo de ORL. Embora úteis para identificar novas proteínas celulares envolvidas na manutenção da fidelidade do genoma, análise funcional exige a determinação de se a proteína de interesse promove a resolução de complexos de reparação, formação ou localização.
O acúmulo de proteínas de reparo pode ser prontamente detectado como distintos focos nucleares pela microscopia de imunofluorescência. Assim, a associação e dissociação destas proteínas nos locais de dano do ADN podem ser acessados por observando estes focos nucleares em intervalos representativos após a indução de quebras de DNA dobro-costa. Esta abordagem também pode identificar proteínas fator de reparação mal localizadas, se a reparação de defeitos não ocorrer simultaneamente com incompletos atrasos na reparação. Neste cenário, quebras de DNA dobro-Costa duradouro podem ser projetadas por expressando uma endonuclease corte raros (por exemplo, eu-SceI) nas células onde o site de reconhecimento para a referida enzima foi integrado no genoma celular. A lesão resultante é particularmente difícil de resolver como fiel reparação irá reintroduzir o sítio de reconhecimento da enzima, solicitando mais uma rodada de clivagem. Como resultado, as diferenças na cinética de reparação são eliminadas. Se não são formados complexos de reparação, localização tem sido impedida. Este protocolo descreve a metodologia necessária para identificar alterações na cinética de reparação, bem como a localização da proteína de reparo.
Introdução
Cada dia, cada célula no corpo humano é bombardeada com um número estimado de 10.000 DNA lesões1. Esta ameaça existencial coloca-nos em risco de mutações, mixomas, bem como a célula morte. Para proteger a fidelidade do genoma, células de mamíferos evoluíram para responder ao dano do ADN com uma complexa série de associações de proteína e modificações. Esta resposta é organizada em várias vias, conhecidas coletivamente como o DNA danos resposta (DDR)2,3. A DDR consiste em acúmulo de proteínas de reparo do DNA em lesões do ADN, coordenadas tanto temporal e espacialmente. DDR frequentement....
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Protocolo
Note-se, este protocolo escrito para U2OS células contendo um eu-SceI reconhecimento local18. As células não precisam ser U2OS, mas devem conter o site eu-SceI. O protocolo pode precisar ser ajustada (por exemplo, número de células semeadas e tempos de incubação) dependendo do tipo de células utilizadas.
1. definir a cinética de ORL reparação complexante
- Desenvolvem-se células de U20S-DRGFP em uma placa de cultura de tecido de 10cm até 85-90% confluentes.
- Remova a mídia e incubar à temperatura ambiente (RT) em 3 mL de EDTA por 2 min.
- Substituir o EDTA com 1 mL de tripsina e incu....
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Resultados
Figura 1 descreve a seleção da discriminação correta do ruído para quantificação de maxima/focos usando o ImageJ. As imagens mescladas de DAPI e a proteína de reparo de interesse estão no painel esquerdo. A figura 1A mostra uma discriminação de ruído de 90 e marca o número correto de focos. Núcleos na borda (retratado com uma flecha-de-rosa) e focos fora dos núcleos (representados com uma seta amarela) não são contados durante a .......
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Discussão
A análise do DNA reparação de danos em geral e o reparo de quebras de DNA dupla-hélice especificamente é uma área ativa de pesquisa porque suas consequências abrangem tumorigênese de biologia básica6,20. Este detalhes de manuscrito, uma abordagem que disseca com precisão a contribuição das proteínas RAD51 e γ-H2AX para a resolução de DSBs através de HR olhando para a frente, esse método pode ser usada para elucidar as funções adicionais de proteínas de reparo no .......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos Joel Sanneman e Dr. Philine Wangemann do núcleo microscopia Confocal, financiado pelo Kansas estado Universidade faculdade de medicina veterinária, pelo apoio dos esforços para desenvolver esta técnica. pCBASceI foi um presente de Maria Jasin (plasmídeo Addgene # 26477) 30. U2OS DR-GFP células foram um presente tipo de Maria Jasin18.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 12 mm Lamínulas | VWR | 89015-725 | |
| 16% Paraformaldeído (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| Placa de 24 poços | VWR | 82050-892 | |
| Placa de fundo de vidro de 96 poços | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| Anti-H2AX Alexa488 | EMD Millipore | 05-636-AF488 | |
| Anti-Rad51 (D4B10) | Cell Signaling Technology | 8875S | |
| Bio-formats plugin para ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| Albumina de soro bovino (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, Glicose alta | ThermoFisher Scientific | 12100046 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| Soro fetal bovino (FBS) | VWR | 89510-194 | |
| IgG Anti-Coelho para Cabras Alexa594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Peróxido de Hidrogênio | sigma-Aldrich | 216763-100ML | |
| Software ImageJ | Instituto Nacional de Saúde (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| I-SceI Expression Vector | Addgene | 26477 | |
| Esmalte de Unhas- Insta Dri Sally | e Hansen | Claramente Rápido (103) | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Bio Basic | PD8117 | |
| ProLong Gold Antifade Reagente | Life Technologies | P36930 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Tripsina-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| Reagente de Transfecção TurboFect | ThermoFisher Scientific | R0531 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |
Referências
- Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
- Branzei, D., Foiani, M. Regulation of DNA repair throughout the cell cycle. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 297-308 (2008).
- Ciccia, A., Elledge, S. J.
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Reimpressões e permissões
