Artigo de método

Protocolo para criar feridas crônicas em camundongos diabéticos

DOI:

10.3791/57656

⸱

25 de setembro de 2019

 , 
1Department of Molecular, Cell and Systems Biology, University of California, Riverside

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As feridas crônicas são desenvolvidas a partir de feridas agudas em um modelo de mouse diabético induzindo altos níveis de estresse oxidativo após uma ferida cutânea de espessura total. A ferida é tratada com inibidores para catalase e glutationa peroxidase, resultando em comprometimento da cicatrização e desenvolvimento de biofilme por bactérias presentes no microbioma cutâneo.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As feridas crônicas se desenvolvem como resultado da regulação defeituosa em um ou mais complexos processos celulares e moleculares envolvidos na cicatrização adequada. Eles impactam ~ 6,5 M pessoas e custo ~ $40B/ano nos EUA sozinho. Embora um esforço significativo tenha sido investido na compreensão de como as feridas crônicas se desenvolvem em humanos, questões fundamentais permanecem sem resposta. Recentemente, nós desenvolvemos um modelo novo do rato para as feridas crônicas do diabético que têm muitas características de feridas crônicas humanas. Usando DB/DB-/- camundongos, podemos gerar feridas crônicas induzindo altos níveis de estresse oxidativo (os) no tecido da ferida imediatamente após o ferimento, usando um tratamento único com inibidores específicos das enzimas antioxidantes catalase e glutationa peroxidase. Estas feridas têm níveis elevados de OS, desenvolvem o biofilme naturalmente, tornam-se inteiramente crônicos dentro de 20 dias após o tratamento e podem permanecer abertos mais por mais de 60 dias. Este novo modelo tem muitas características de feridas crônicas diabéticas em humanos e, portanto, pode contribuir significativamente para o avanço da compreensão fundamental de como as feridas se tornam crônicas. Este é um avanço importante porque as feridas crônicas nos seres humanos causam a dor e a aflição significativas aos pacientes e conduzem à amputação se não resolvidas. Além disso, essas feridas são muito caras e demoradas para tratar, e levam a perda significativa de renda pessoal para os pacientes. Avanços neste campo de estudo através do uso de nosso modelo de ferida crônica pode melhorar significativamente os cuidados de saúde para milhões que sofrem esta condição debilitante. Neste protocolo, nós descrevemos em grande detalhe o procedimento para causar as feridas agudas para tornar-se crônico, que não foi feito antes.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A cicatrização de feridas envolve processos celulares e moleculares complexos que são regulados temporalmente e espacialmente, organizados em estágios seqüenciais e sobrepostos que envolvem muitos tipos de células diferentes, incluindo mas não limitados à resposta imune e à do sistema1. Imediatamente após a pele sustém uma lesão, fatores e células sanguíneas agregado ao local da ferida e iniciar a cascata de coagulação para formar um coágulo. Depois que a homeostase é conseguida, os vasos sanguíneos dilatam-se para deixar no local da ferida o oxigênio, os nutrientes, as enzimas, os anticorpos e os Fatores Quimiotáticos que quimioatraem polymorphonucleocytes para cancelar o leito da ferida de restos extrangeiros e secretam enzimas proteolíticas 2. as plaquetas ativadas secretam uma variedade de fatores de crescimento para estimular os queratinócitos na borda da ferida para re-epitelizar a área ferida. Monócitos recrutados para o local da ferida diferenciam-se em macrófagos que bactérias fagoocitose e neutrófilos mortos e secretam fatores adicionais para manter os sinais proliferativos e pró-migratórios de queratinócitos. Na fase de proliferação, enquanto a re-epitelização continua, novo tecido de granulação composto de fibroblastos, monócitos/macrófagos, linfócitos e células endoteliais continuam o processo de reconstrução2. A angiogênese é estimulada pela promoção da proliferação e migração de células endoteliais, resultando no desenvolvimento de novos vasos. A epitelização e a remodelação da matriz extracelular constroem uma barreira contra o meio ambiente. À medida que a ferida cicatrizar e o tecido de granulação evolui para uma cicatriz, a apoptose elimina células inflamatórias, fibroblastos e células endoteliais sem causar dano tecidual adicional. A resistência à tração do tecido é reforçada por fibroblastos remodelando vários componentes da matriz extracelular, como o colágeno, de modo que o tecido recém-formado é quase tão forte e flexível como a pele não ferida2.

Qualquer desvio desta progressão altamente concertada para o fechamento da ferida leva a feridas danificadas e/ou crônicas3. As feridas crônicas são caracterizadas pelo aumento do estresse oxidativo, inflamação crônica, microvasculatura danificada e matriz de colágeno anormal na ferida4. Estresse oxidativo, especialmente na ferida, pode atrasar o fechamento da ferida2,5. Quando, na primeira fase da cicatrização de feridas, a fase inflamatória torna-se regulamentada, o tecido hospedeiro assume extensos danos devido a um influxo contínuo de células inflamatórias5 que liberam enzimas citotóxicas, um aumento nos radicais livres de oxigênio, e mediadores inflamatórios não regulamentados, resultando em morte celular6,7.

Neste microambiente destrutivo, bactérias formadoras de biofilme aproveitam os nutrientes do hospedeiro e contribuem para o dano do tecido hospedeiro2. Estes biofilmes são difíceis de controlar e remover porque as substâncias poliméricos extracelular hidratadas compor das proteínas, do ADN, do RNA, e dos polisacáridos permitem que as bactérias abrigaram dentro para ser tolerantes às terapias antibióticas convencionais e iludir o resposta imune inata e adaptativa do hospedeiro2,8,9.

Estudar feridas crônicas é crucial porque impactam ~ 6,5 milhões pessoas e custam ~ $40000000000 por ano nos EUA sozinhos10. Pacientes com diabetes têm aumentado os riscos para o desenvolvimento de feridas crônicas que necessitam de amputação, a fim de conter a propagação da infecção. Estes pacientes têm um risco de mortalidade de 50% dentro de 5 anos da amputação que é atribuída ao mecanismo da patofisiologia do diabetes11. A relação entre o sistema imunológico do hospedeiro e o microbioma na cicatrização de feridas é um tema vital da pesquisa em andamento, pois as conseqüências de feridas crônicas, se não resolvidas, incluem amputação e morte12.

Embora um esforço significativo tenha sido investido na compreensão de como as feridas crônicas se desenvolvem em humanos, ainda não está claro como e por que as feridas crônicas se formam. Experimentos para estudar os mecanismos de cicatrização prejudicada é difícil de conduzir em seres humanos, e os especialistas em cicatrização de feridas só vêem pacientes com feridas crônicas que já atingiram cronicidade por semanas a meses. Assim, os especialistas são incapazes de estudar o que os processos deu errado que levam a ferida a desenvolver para se tornar crônica2. Há uma falta de modelos animais que recapitulam a complexidade das feridas crônicas humanas. Até que nosso modelo estêve desenvolvido, nenhum modelo para estudos crônicos da ferida existiu.

O modelo de ferida crônica foi desenvolvido em camundongos com mutação no receptor de leptina (DB/DB-/-)13. Estes camundongos são obesos, diabéticos, e têm dificuldades de cicatrização, mas não desenvolvem feridas crônicas14. Níveis de glicose no sangue média em torno de 200 mg/dL, mas pode ser tão alto quanto 400 mg/dL15. Quando altos níveis de estresse oxidativo (SO) no tecido da ferida são induzidos imediatamente após o ferimento, a ferida torna-se crônica16. As feridas DB/DB-/- são consideradas crônicas por 20 dias e permanecem abertas por 60 dias ou mais. Biofilme produzido por bactérias pode ser visto desenvolvendo início três dias após o ferimento; um biofilme maduro pode ser visto 20 dias após ferir e persistir até qualquer fechamento da ferida. As bactérias formadoras de biofilme que encontramos nesses camundongos também são encontradas em feridas crônicas diabéticas humanas.

O estresse oxidativo é induzido pelo tratamento das feridas com dois inibidores de enzimas antioxidantes, catalase e glutationa peroxidase, duas enzimas com a capacidade de quebrar o peróxido de hidrogênio. O peróxido de hidrogênio é uma espécie reativa de oxigênio e pode causar danos celulares através da oxidação de proteínas, lipídios e DNA. Catalase cataliza a decomposição do peróxido de hidrogênio em menos produtos químicos nocivos de oxigênio e água. 3-amino-1, 2, 4-triazol (ATZ) inibe a catalase ligando especificamente e covalentemente ao centro ativo da enzima, inativando-o17,18,19. ATZ tem sido utilizado para estudar os efeitos do estresse oxidativo tanto in vitro como in vivo através da inibição da catalase20,21,22,23,24. A glutationa peroxidase catalisa a redução do peróxido de hidrogênio através do antioxidante, glutationa, e é uma importante enzima que protege a célula contra o estresse oxidativo25. O ácido mercaptosuccinic (MSA) inibe a glutationa peroxidase ligando-se ao local ativo da selenocisteína da enzima com tiol, inativando-o26. A MSA tem sido utilizada para estudar os efeitos do estresse oxidativo in vitro e in vivo , bem como20,27,28.

Este novo modelo de feridas crônicas é um modelo poderoso para estudar, pois compartilha muitas das mesmas características observadas em feridas crônicas diabéticas humanas, incluindo inflamação prolongada do sistema operacional aumentado e formação de biofilme natural do microbioma cutâneo. As feridas têm a interação cutâneo-epidérmica danificada, o depósito anormal da matriz, a angiogênese pobre e o vasculature danificado. As feridas crônicas se desenvolverão em camundongos machos e fêmeas, de modo que ambos os sexos podem ser usados para estudar feridas crônicas. Conseqüentemente, o modelo crônico da ferida pode contribuir significativamente para avançar a compreensão fundamental de como tais feridas começam. Usar este modelo crônico da ferida pode fornecer respostas às perguntas fundamentais sobre como o cronicidade é iniciado/conseguido com as contribuições da fisiologia da cura danificada da ferida e do microbioma do anfitrião.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os experimentos foram concluídos de acordo e conformidade com os regulamentos federais e da Universidade da Califórnia política e procedimentos foram aprovados pela Universidade da Califórnia, Riverside IACUC.

1. o animal

  1. Use diabéticos e obesos B6. BKS (D)-LeprDB/j camundongos para o modelo de ferida crônica. As opções de compra incluem heterozigotos para reprodução ou homozigotos diretamente para experimentos.
  2. Raça heterozygote machos e fêmeas para produzir descendentes. Apenas um quarto da maca, estatisticamente, crescerá para se tornar diabético e obeso (DB/DB-/-).
  3. Wean e casa DB/DB-/- ratos junto com seus littermates 3 semanas após o nascimento. Separe DB/DB-/- camundongos de seus littermates 5 semanas após o nascimento e casa com outros DB/DB-/- camundongos até que eles são 5-6 meses de idade e pode ser usado para o modelo de ferida crônica. Durante este tempo, um microbioma maduro e complexo da pele pode desenvolver-se.
    Nota: os ratos DB/DB-/- são facilmente identificados visualmente a partir de littermates entre 3-5 semanas de idade. O DB/DB-/- camundongos são obesos, são diabéticos, e será significativamente maior e mais redondo do que o tipo selvagem e littermates heterozygous. Seu abdômen pode aparecer ligeiramente Pinker e seus quadris maiores. O aumento do peso deve ser confirmado antes da cirurgia. Além disso, é possível medir altos níveis de glicose no sangue e genótipo do mouse para confirmar a mutação no receptor de leptina.

2. Vivarium e husbandry

  1. Casa DB/DB-/- camundongos em um Biotério convencional (não uma barreira/patógeno específico livre facilidade) para que uma microflora pode ser estabelecida na pele de DB/DB-/- camundongos. Para modelar especificamente os seres humanos que sofrem de feridas crônicas, não tome precauções especiais para evitar a exposição a patógenos.
  2. Proteja as gaiolas com micro isolador tops para minimizar a propagação da infecção dentro do Vivarium. Mude as gaiolas duas vezes por semana com a cama nova e alimente os ratos com o Chow regular do biotério. Não autoclave nem a cama ou o alimento.
  3. Defina a temperatura ambiente para variar entre 21 e 24 ° c, com pequenas flutuações dependendo da época do ano. A humidade, reflectora do clima e da localização, irá variar entre 19 e 70%.

3. requisitos para o desenvolvimento de feridas crônicas

  1. Use apenas camundongos machos e fêmeas que são fenotipicamente obesos, diabéticos, e pelo menos 5-6 meses de idade para o desenvolvimento de feridas crônicas. O peso destes ratinhos deve variar entre 40-80 g, com uma média de cerca de 60 g.
  2. Não use camundongos que são considerados obesos, mas pesar menos de 50 g.
    Nota: todos os ratos referidos neste protocolo passam as qualificações descritas aqui, salvo indicação em contrário.

4. barbear e aplicação de loção depilatória

Nota: remover pêlos indesejados no dorso do mouse antes de ferir. O procedimento a seguir é feito em Live DB/DB-/- camundongos que não estão anestesia no dia anterior à cirurgia. Tome precauções para evitar o stress e o dano ao animal.

  1. Barbear
    1. Coloque o mouse sobre uma superfície limpa e segure a base da cauda do mouse com o polegar e o segundo dedo para fixar a posição do mouse. O rato pode saltar ou fazer movimentos bruscos; Se ele faz, rapidamente responder e puxar para trás os cortadores para evitar ferimentos.
    2. Raspar o cabelo do rato com uma tosquiadeira de cabelo (Figuras 1A, 1B). Posicione a lâmina paralela à pele do mouse e raspar toda a volta do pescoço para a cauda, incluindo toda a volta da cauda, para permitir uma grande área de superfície suficiente para colocar um curativo de filme transparente (ver tabela de materiais). Leve a lâmina contra a direção do crescimento do cabelo para o corte mais eficiente. (Figura 1B).
      1. Não pressione a lâmina profundamente na pele, uma vez que pode danificar a pele por nódoas negras ou corte.
  2. Aplicação de loção depilatória
    Nota: Use loção depilatória para obter uma pele muito lisa para que o curativo transparente pode aderir firmemente.
    1. Mergulhe a pele do rato com água para evitar queimaduras químicas pressionando levemente um papel encharcado limpe contra a pele raspada com pressão suficiente para molhar o cabelo já cortado para baixo contra a pele.
    2. Enquanto a pele está molhada, esfregue levemente a pele do rato com um pequeno montão de loção depilatória (ver tabela de materiais) para 15-20 s (figuras 1C, 1D). Espalhe a loção completamente sobre onde quer que o cabelo foi cortado curto. Use mais loção se o mouse é maior.
    3. Não aplique loção nas orelhas do mouse, cauda, ou em qualquer lugar perto do rosto. Se a loção fica sobre as orelhas ou cauda, Basta limpar com um papel molhado limpe até enxaguar. Se a loção fica na face do rato, lave imediatamente o rato a torneira running ou a água deionizada para impedir dano aos olhos, ao nariz, e à boca.
    4. Deixe a loção para reagir com o cabelo para um adicional de 20-45 s após a aplicação.
    5. Antes deenxaguar, verifique a conclusão da reacção depilatória, enxugando levemente a loção da pele em vários locais (Figura 1E) com um dedo enluvado ou uma espátula metálica fina. A reação é completa se a pele é rosa sem a presença de cabelo preto. É melhor verificar rapidamente que o cabelo foi realmente removido antes de enxaguar do que enxaguando prematuramente e, em seguida, ter que aplicar loção novamente.
  3. Enxaguar
    Nota: uma vez que a conclusão da reação da remoção do cabelo foi verificada, lave o rato com a torneira running ou a água deionizada para remover a loção depilatórios e para impedir queimaduras químicas.
    1. Coloc o rato na mão gloved esquerda e pressione a base da cauda de encontro à palma com o polegar esquerdo para impedir que o rato se mova ao redor. Feche e endireite o resto dos dedos esquerdos para evitar que o rato morda.
    2. Posicione o mouse para que a região da face/cabeça esteja longe do córrego da água e o córrego da água morna possa cair atrás da cabeça e somente na parte traseira. Rapidamente, mas gentilmente esfregar a parte de trás do mouse com a mão direita gloved para lavar afastado a loção.
    3. Uma vez que a pele do mouse está livre da loção, limpe rapidamente o mouse com uma toalha de papel para absorver a maior parte da água (Figura 1F).
  4. Cuidados após o barbear e depilação
    1. Verifique e limpe qualquer loção depilatória residual que pode permanecer nas orelhas e cauda com uma limpeza de papel molhado.
    2. Coloque o mouse de volta em sua gaiola individual e coloque a gaiola em uma almofada de aquecimento (40-45 ° c) por cerca de 30 min. O rato deve retornar ao comportamento normal, scurry ao redor, e o noivo próprio dentro de alguns minutos.
    3. Casa cada rato em uma gaiola separada durante toda a duração do experimento. A pele dos ratos não é mais protegida e pode ser facilmente arranhada e mordida por outros ratos.
    4. Uma vez que a loção depilatória pode ter efeitos irritantes leves que podem interferir com ou alterar o processo de cicatrização de feridas, aguarde 18-24 h antes da cirurgia para permitir que a pele do mouse para acalmar e o mouse para ajustar a falta de cabelo em suas costas.
  5. Removendo o cabelo da pele com pigmentação escura
    Nota: alguns DB/DB-/- camundongos potencialmente terão manchas escuras na pele que terá o cabelo crescendo de volta mais rápido e mais forte do que a pele sem esses patches. (Figura 2A). Estas áreas escuras da pele aparecem mais escuras na cor devido aos folículos de cabelo do estágio do Mid-Late anágena e/ou ao incontinence do pigmento29,30.
    1. Se manchas escuras são notadas, aplique loção depilatória novamente, mas apenas nessas áreas, e repita o passo 4,2 e 4,3 (figuras 2B, 2C).
      Nota: os remendos escuros da pele crescerão o cabelo mais rapidamente durante todo a duração do experimento, assim que Grampeie o cabelo curto cada 3-5 dias, quando necessário. Um remendo ou dois longe da posição desejada da ferida é aceitável. Se a parte de trás do mouse é significativamente coberto por esses patches escuros, não use este mouse para o modelo de ferida crônica.

5. configuração do reagente

Nota: o desenvolvimento de feridas crônicas em camundongos DB/DB-/- é realizado por tratamento com inibidores específicos para catalase e glutationa peroxidase, 3-amino-1, 2,4-triazol (ATZ) e ácido mercaptosuccinic (MSA), respectivamente16 . O procedimento seguinte detalha a dose e a administração da analgesia e dos inibidores baseados no peso do rato.

  1. Injete o analgésico Buprenex via intraperitoneal em 0, 5 mg/kg de rato em PBS estéril. Injete um volume de 120 μL para um rato de 60 g aproximadamente 30 minutos antes da cirurgia. Administrar outra dose 6 h após a cirurgia. Uma dose extra pode ser administrada conforme necessário.
  2. Injete ATZ intraperitonealmente a 1 g/kg de rato em PBS estéril. Injete um volume de 480 μL para um rato de 60 g aproximadamente 20 minutos antes da cirurgia. Injete metade do volume no lado esquerdo do abdômen e a outra metade no lado direito.
  3. Deposite MSA topicamente na ferida entre o curativo transparente e o tecido da ferida em 150 mg/kg de rato em PBS estéril. Administrar um volume de 60 μL para um rato de 60 g dentro de 10 minutos após a cirurgia.

6. cirurgia

Nota: o sucesso do modelo de ferida crônica depende de condições não estéreis. Estes camundongos não são livres de germes e estão alojados em um Vivarium convencional. O microbioma das bactérias que reside na pele é crucial para a iniciação e o desenvolvimento subseqüentes de feridas crônicas em cima do tratamento com os nervos inibidores de enzimas antioxidantes. Portanto, a preparação pré-cirúrgica tradicional do local é contraindicindicada.

  1. Injeção intraperitoneal
    1. Prenda o rato na porção inclinada da cremalheira da gaiola e segure a cauda com o rato confortavelmente de pé com a cabeça mais baixa do que o corpo do rato. Isto assegura-se de que nós tentamos mover os órgãos internos tão faraway do ponto da injeção possível.
    2. Insira a agulha no quadrante inferior direito do abdômen para evitar a injeção na bexiga, ou outros órgãos abdominais.
    3. Aspirar a agulha antes da injecção.
  2. Tratamento e anestesia
    1. Administrar Buprenex 30 min e ATZ 20 min antes da cirurgia, conforme descrito nas etapas 5,1 e 5,2.
    2. Coloque o mouse em um pequeno recipiente de plástico em cima de uma almofada de aquecimento quente, como mostrado na Figura 3a para aproximadamente 15-20 min. fornecer suporte térmico antes do procedimento protege contra a mortalidade potencial.
    3. Coloque um pano de papel ou toalha de papel sobre a parte superior do recipiente pequeno para melhor conter o calor. O rato deve acalmar-se enquanto aquece. Figura 3 B mostra materiais necessários para a cirurgia.
    4. Coloque o mouse em um recipiente fechado que é ligado ao vaporizador isoflurano na capa química se estiver usando um sistema aberto.
    5. Em um sistema aberto, administre 5% de isoflurano por 1-2 min a uma vazão de 2-3,5 L/min. Monitore continuamente o status do mouse.
      1. Uma vez que o mouse está inconsciente ou não mais se movendo, coloque o mouse sobre uma almofada cirúrgica branca e encaixar a cabeça com um cone de nariz que é fixado ao vaporizador para permitir a administração contínua de isoflurano durante a cirurgia.
    6. Em um sistema aberto, administrar 2-3% isoflurano na mesma vazão durante a cirurgia e ajustar ao fluxo de isoflurano para manter a profundidade da anestesia.
    7. Minimize a concentração e a duração do isoflurano administrado durante a cirurgia. DB/DB -/- camundongos são muito sensíveis à anestesia por isso é melhor manter a exposição ao isoflurano a um mínimo. Se o rato ainda estiver responsivo após 2 min a 5% de isoflurano, fixe o cone nasal e administre 3-5% de isoflurano por 15-30 s antes de iniciar a cirurgia.
      1. Confirme a anestesia adequada antes de ferir. A profundidade da anestesia é confirmada pela falta da resposta aos estímulos físicos tais como a pitada forte do dedo do pé. O comprimento do tempo do rato a anestesia inalada está 5 minutos assim que nenhuma pomada do veterinário é aplicada aos olhos.
  3. Ferindo
    1. Pulverize uma limpeza de papel com 70% de etanol ou um towelette de etanol clínico e limpe a parte de trás do mouse para limpar a área do local da ferida. Limpe a superfície da pele para que o curativo transparente possa aderir firmemente, uma vez que a poeira da cama, comida ou pele pode impedir o curativo de furar corretamente (Figura 4A). Não limpe excessivamente, ou haverá um risco de matar as bactérias presentes na pele.
    2. Determine a posição do local da ferida. O melhor lugar para executar a ferida está no lado dorsal do mouse, centrado e longe de manchas de pele com maior pigmentação.
      Nota: nós determinamos pela experiência que estes ratos podem somente suportar a carga de uma ferida.
    3. Crie uma ferida dentro de 30-45 s usando um perfurador da biópsia da pele de 7 milímetros, uns pinças e uma tesoura cirúrgica. Pressione levemente o perfurador da biópsia no local desejado da ferida e torça o perfurador ao redor apenas profundamente bastante para deixar uma impressão ligeira do perfurador (Figura 4B). Extirpar a pele delineada puxando o centro do perfurador com pinças e cortando ao longo do contorno com tesouras cirúrgicas (figuras 4C-4E).
    4. Cubra a ferida firmemente com metade de um pedaço de curativo de filme transparente (6 cm x 3,5 cm).
    5. Parar a administração de 2% de isoflurano para o rato (Figura 4F).

7. tratamento pós-cirúrgico e recuperação

  1. Administrar o tratamento de MSA depois que a cirurgia é completa e o curativo transparente é aplicado como descrito em etapa 5,3. Deposite MSA na área da ferida o curativo.
  2. Coloque o mouse de volta no recipiente pequeno na almofada de aquecimento por 30 min para ajudar com a recuperação. Uma vez que o mouse se aqueceu, coloque o mouse de volta em sua gaiola. O efeito do isoflurano é temporário, e o mouse deve estar se movendo logo em seguida.
  3. Não deixe os ratos desacompanhado nem os retorne ao biotério até que os ratos recuperem a consciência suficiente para manter o recumbency esternal.
    Nota: a anestesia de escolha quando se trabalha com estes camundongos é isoflurano precisamente devido à sua rápida indução e subsequente emergência da anestesia.
    1. Os ratos da casa que se submeteram à cirurgia individualmente para evitar um rato que interfere com a ferida crônica de outro. Como mencionado acima, eles não retornam ao biotério até totalmente recuperado.
  4. Administrar a segunda dose de Buprenex 6 h após a cirurgia.
  5. Observe os ratos cuidadosamente para o primeiro 48 h após a cirurgia.
    Nota: a cirurgia, juntamente com os inibidores para criar a ferida crônica, é muito estressante no animal que já é diabético e obeso. Os camundongos que sobrevivem aos primeiros dias após a cirurgia geralmente sobreviverão à duração do experimento.

8. coleta de dados, estratégias de sobrevivência, manipulação dos ratos após Wounding, e dicas adicionais

  1. Coleta de dados
    1. Tire fotos tão cedo quanto imediatamente após a cirurgia. Biofilmes são observados em qualquer lugar entre 5-10 dias após o ferimento, e tão cedo quanto 3 dias.
    2. Se as bactérias são o foco da análise, role uma troca estéril com pressão clara em torno da ferida para 10-15 s. armazene o cotonete, em um meio de congelação apropriado para cultivo ou seque sem meios para a análise de sequenciamento independente da cultura, a-80 ° c. Colete substâncias poliméricos extracelulares através de uma espátula metálica estéril em um tubo de microcentrífuga e armazene a-80 ° c antes da análise.
    3. Não administrar a anestesia ao rato durante a manipulação para a coleção do biofilme ou a tomada da imagem. Durante estes procedimentos, coloque um pedaço de alimento na frente do mouse para acalmar o mouse para baixo e impedi-lo de fugir. A maioria dos ratos vai subir em cima da comida, sentar-se sobre ele, e não se mover.
  2. Como infecções secundárias e feridas crônicas não intencionais ou úlceras podem se desenvolver se o mouse não estiver se movendo corretamente ou se o curativo não for aplicado corretamente, verifique periodicamente a atividade do mouse e o lado ventral para feridas. A fricção entre a pele e o fundamento molhado (DB/DB-/- ratos é polyuric) pode perturbar a pele se as gaiolas não são mudadas freqüentemente.
    Nota: o acúmulo de fluido o curativo pode fazer com que o adesivo perca sua viscosidade e permita que o fluido vaze. Célula da pele morta, roupa de cama, e matéria fecal pode então furar a pele e endurecer. Estes remendos secos e os agregados na pele devem ser cancelados prontamente para impedir uma infecção secundária.
  3. Se os ratos se levantar ou sentar-se em suas patas traseiras, mova estes ratos para uma gaiola onde o acesso a alimentos e água é muito menor. Se a posição do alimento e da água na gaiola é elevada, o rato pode estar ou sentar-se em suas patas traseiras para alcançá-la. A maioria de ratos não terão um problema comer e beber se poderiam fazê-lo antes da cirurgia, embora haja uma possibilidade que alguns ratos puderam lanç sobre em suas partes traseiras. Estes "nadadeiras" podem ter grande dificuldade em virar para que eles vão precisar de assistência e monitoramento adicional.
  4. Deixe o curativo transparente na pele por até 20 dias se a pele é clara de detritos, pele flakey e cabelo. Se algum destes ocorrer na pele, retire o curativo antigo e aplique uma nova peça.
    1. Para tirar o curativo, levemente apertar a pele diretamente atrás da cabeça, em seguida, puxe o curativo longe da cabeça em um movimento suave.
    2. Para colocar um pedaço de molho em segurança, ter o mouse ficar o mais ainda possível. É importante que a pele está limpa e livre de células mortas escamosa da pele, poeira da cama, e pedaços de comida. Coloque e, em seguida, pressione o curativo na pele ao redor da ferida para fixar.
    3. Se colocar uma parte de alimento na frente do rato não limita seus movimentos, a seguir coloc o rato sobre a gaiola do fio. Uma vez que o rato agarrou um trilho na gaiola, segure a cauda tão perto do corpo quanto possível e puxe com força mínima. Como o mouse puxa para a frente a parte de trás vai esticar e endireitar para fácil aplicação; Coloque o curativo firmemente neste ponto.
    4. Nunca reutilize um curativo antigo. Aplique sempre o novo curativo na parte de trás para obter a maior aderência.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A Figura 5 mostra um exemplo de uma ferida sem tratamento de nervos inibidores que progridem para o fechamento da ferida e uma ferida com o tratamento de nervos inibidores que progridem para a cronicidade. A limpeza transparente foi deixada no lugar na ferida crônica de modo que o biofilme e a acumulação fluida possam ser vistos.

A iniciação crônica da ferida ocorre em menos de 6 horas e a margem da...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uma vez que as feridas crônicas são criadas nos camundongos, o modelo pode ser usado para estudar os processos de cicatrização de feridas envolvidas no início da cronicidade. O modelo também pode ser usado para testar a eficácia de uma ampla gama de produtos químicos e drogas que podem reverter o desenvolvimento de feridas crônicas e cicatrização prejudicada e levar ao fechamento da ferida e cicatrização. Os pontos de tempo diferentes após o início da cronicidade podem ser estudados: por exemplo, dias 1-5 após o...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm agradecimentos.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
B6. BKS(D)-Leprdb/J O Laboratório Jackson 00697Homozigotos e heterozigotos disponíveis 
Loção Removedora de Pêlos Nair com Aloe Calmante e LanolinaNairum depilatório químico
Buprenex (buprenorfina HCl)Henry Stein Animal Health0591220,3 mg/ml, Classe 3
3-Amino-1,2,4-triazol (ATZ)TCIA0432
Ácido merpantossuccínico (MSA)Aldrich88460
Solução tampão fosfato (PBS)autoclave esterilizada
IsofluranoHenry Schein Animal Health029405NDC 11695-6776-2
O tanque de oxigêniodeve ser compatível com o sistema de vaporização
Vaporizador de isofluranoJA Baulch & Associados 
Máquina de cortar cabelo WahlLithium Ion Pro
Acu Punch 7mm punções de biópsia de peleAcuderm Inc.P750
Tegaderm 3MRef: 1624WCurativo de filme transparente (6 cm x 7 cm)
Almofada de aquecimentoConairAlmofada de aquecimento seco úmido
Seringas de insulinaBD3294610,35 mm (28G) x 12,7 mm (1/2")
70% etanol
Kimwipes
Pinças
Tesouracirúrgica afiada
Espátula
Tubulação Nariz
de rato cone
Luvas
pequenos recipientes
de metal fino de plástico

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Singer, A. J., Clark, R. A. F. Cutaneous wound healing. New England Journal of Medicine. 341 (10), 738-746 (1999).
  2. Nouvong, A., Ambrus, A. M., Zhang, E. R., Hultman, L., Coller, H. A. Reactive oxygen species and bacterial biofilms in diabetic wound healing. Physiological Genomics. 48 (12), 889-896 (2016).
  3. MacLeod, A. S., Mansbridge, J. N. The innate immune system in acute and chronic wounds. Advanced Wound Care. 5 (2), 65-78 (2016).
  4. Zhao, G., et al. Biofilms and Inflammation in Chronic Wounds. Advanced Wound Care. 2 (7), 389-399 (2013).
  5. Wlaschek, M., Scharffetter-Kochanek, K. Oxidative stress in chronic venous leg ulcers. Wound Repair and Regeneration. 13 (5), 452-461 (2005).
  6. Stadelmann, W. K., Digenis, A. G., Tobin, G. R. Physiology and healing dynamics of chronic cutaneous wounds. American Journal of Surgery. 176 (2), 26-38 (1998).
  7. Loots, M. A., Lamme, E. N., Zeegelaar, J., Mekkes, J. R., Bos, J. D., Middelkoop, E. Differences in cellular infiltrate and extracellular matrix of chronic diabetic and venous ulcers versus acute wounds. Journal of Investigative Dermatology. 111 (5), 850-857 (1998).
  8. Costerton, W., Veeh, R., Shirtliff, M., Pasmore, M., Post, C., Ehrlich, G. The application of biofilm science to the study and control of chronic bacterial infections. Journal of Clinical Investigation. 112 (10), 1466-1477 (2003).
  9. Fux, C. A., Costerton, J. W., Stewart, P. S., Stoodley, P. Survival strategies of infectious biofilms. Trends in Microbiology. 13 (1), 34-40 (2005).
  10. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
  11. Armstrong, D. G., Wrobel, J., Robbins, J. M. Are diabetes-related wounds and amputations worse than cancer. International Wound Journal. 4 (4), 286-287 (2007).
  12. James, G. A., et al. Biofilms in chronic wounds. Wound Repair and Regeneration. 16 (1), 37-44 (2008).
  13. Chen, H., et al. Evidence that the diabetes gene encodes the leptin receptor: Identification of a mutation in the leptin receptor gene in db/db mice. Cell. 84 (3), 491-495 (1996).
  14. Coleman, D. L. Obese and diabetes: Two mutant genes causing diabetes-obesity syndromes in mice. Diabetologia. 14 (3), 141-148 (1978).
  15. Garris, D. R., Garris, B. L. Genomic modulation of diabetes (db/db) and obese (ob/ob) mutation-induced hypercytolipidemia: cytochemical basis of female reproductive tract involution. Cell Tissue Research. 316 (2), 233-241 (2014).
  16. Dhall, S., et al. Generating and reversing chronic wounds in diabetic mice by manipulating wound redox parameters. Journal of Diabetes Research. , 2014, Article ID 562625 (2014).
  17. Feinstein, R. N., Berliner, S., Green, F. O. Mechanism of inhibition of catalase by 3-amino-1,2,4-triazole. Archives of Biochemistry and Biophysics. 76 (1), 32-44 (1958).
  18. Margoliash, E., Novogrodsky, A. A study of the inhibition of catalase by 3-amino-1:2:4:-triazole. Biochemical Journal. 68 (3), 468-475 (1958).
  19. Margoliash, E., Novogrodsky, A., Schejter, A. Irreversible reaction of 3-amino-1:2:4-triazole and related inhibitors with the protein of catalase. Biochemical Journal. 74 (2), 339-348 (1960).
  20. Shiba, D., Shimamoto, N. Attenuation of endogenous oxidative stress-induced cell death by cytochrome P450 inhibitors in primary cultures of rat hepatocytes. Free Radical Biology and Medicine. 27 (9-10), 1019-1026 (1999).
  21. Ishihara, Y., Shimamoto, N. Critical role of exposure time to endogenous oxidative stress in hepatocyte apoptosis. Redox Report. 12 (6), 275-281 (2007).
  22. Valenti, V. E., de Abreu, L. C., Sato, M. A., Ferreira, C. ATZ (3-amino-1,2,4-triazole) injected into the fourth cerebral ventricle influences the Bezold-Jarisch reflex in conscious rats. Clinics. 65 (12), 1339-1343 (2010).
  23. Welker, A. F., Campos, E. G., Cardoso, L. A., Hermes-Lima, M. Role of catalase on the hypoxia/reoxygenation stress in the hypoxia-tolerant Nile tilapia. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (9), 1111-1118 (2012).
  24. Bagnyukova, T. V., Vasylkiv, O. Y., Storey, K. B., Lushchak, V. I. Catalase inhibition by amino triazole induces oxidative stress in goldfish brain. Brain Research. 1052 (2), 180-186 (2005).
  25. Falck, E., Karlsson, S., Carlsson, J., Helenius, G., Karlsson, M., Klinga-Levan, K. Loss of glutathione peroxidase 3 expression is correlated with epigenetic mechanisms in endometrial adenocarcinoma. Cancer Cell International. 10 (46), (2010).
  26. Chaudiere, J., Wilhelmsen, E. C., Tappel, A. L. Mechanism of selenium-glutathione peroxidase and its inhibition by mercaptocarboxylic acids and other mercaptans. Journal of Biological Chemistry. 259 (2), 1043-1050 (1984).
  27. Dunning, S., et al. Glutathione and antioxidant enzymes serve complementary roles in protecting activated hepatic stellate cells against hydrogen peroxide-induced cell death. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (12), 2027-2034 (2013).
  28. Franco, J. L., et al. Methylmercury neurotoxicity is associated with inhibition of the antioxidant enzyme glutathione peroxidase. Free Radical Biology and Medicine. 47 (4), 449-457 (2009).
  29. Sundberg, J. P., Silva, K. A. What color is the skin of a mouse. Veterinary Pathology. 49 (1), 142-145 (2012).
  30. Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation. Molecular Imaging & Biology. 13 (6), 1114-1123 (2011).
  31. Kim, J. H., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. Nature Protocols Exchange. , (2016).
  32. Aasum, E., Hafstad, A. D., Severson, D. L., Larsen, T. S. Age-dependent changes in metabolism, contractile function, and ischemic sensitivity in hearts from db/db mice. Diabetes. 52 (2), 434-441 (2003).
  33. Vannucci, S. J., et al. Experimental stroke in the female diabetic, db/db, mouse. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21 (1), 52-60 (2001).
  34. Janssen, B. J., et al. Effects of anesthetics on systemic hemodynamics in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 287 (4), 1618-1624 (2004).
  35. Osborn, O., et al. Metabolic characterization of a mouse deficient in all known leptin receptor isoforms. Cellular and Molecular Neurobiology. 30 (1), 23(2010).
  36. Scales, B. S., Huffnagle, G. B. The microbiome in wound repair and tissue fibrosis. Journal of Pathology. 229 (2), 323-331 (2013).
  37. Gjødsbøl, K., et al. No need for biopsies: Comparison of three sample techniques for wound microbiota determination. International Wound Journal. 9 (3), 295-302 (2012).
  38. Wolcott, R. D., et al. Analysis of the chronic wound microbiota of 2,963 patients by 16S rDNA pyrosequencing. Wound Repair Regeneration. 24 (1), 163-174 (2016).
  39. Gjødsbøl, K., Christensen, J. J., Karlsmark, T., Jørgensen, B., Klein, B. M., Krogfelt, K. A. Multiple bacterial species reside in chronic wounds: a longitudinal study. International Wound Journal. 3 (3), 225-231 (2006).
  40. Dowd, S. E., et al. Survey of bacterial diversity in chronic wounds using Pyrosequencing, DGGE, and full ribosome shotgun sequencing. BMC Microbiology. 8 (43), (2008).
  41. Price, L. B., et al. Community analysis of chronic wound bacteria using 16S rrna gene-based pyrosequencing: Impact of diabetes and antibiotics on chronic wound microbiota. PLoS One. 4 (7), 6462(2009).
  42. Scales, B. S., Huffnagle, G. B. The microbiome in wound repair and tissue fibrosis. Journal of Pathology. 229 (2), 323-331 (2013).
  43. Dowd, S. E., et al. Polymicrobial nature of chronic diabetic foot ulcer biofilm infections determined using bacterial tag encoded FLX amplicon pyrosequencing (bTEFAP). PLoS One. 3 (10), 3326(2008).
  44. Price, L. B., et al. Macroscale spatial variation in chronic wound microbiota: A cross-sectional study. Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 80-88 (2011).
  45. Gontcharova, V., Youn, E., Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. Comparison of bacterial composition in diabetic ulcers and contralateral intact skin. Open Microbiology Journal. 4, 8-19 (2010).
  46. Smith, K., et al. One step closer to understanding the role of bacteria in diabetic foot ulcers: characterising the microbiome of ulcers. BMC Microbiologyogy. 16 (54), (2016).
  47. Gardner, S. E., Hillis, S. L., Heilmann, K., Segre, J. A., Grice, E. A. The Neuropathic diabetic foot ulcer microbiome is associated with clinical factors. Diabetes. 62 (3), 923-930 (2013).
  48. Loesche, M., et al. Temporal stability in chronic wound microbiota is associated with poor healing. Journal of Investigative Dermatology. 137 (1), 237-244 (2017).
  49. Kalan, L., et al. Redefining the chronic-wound microbiome: Fungal communities are prevalent, dynamic, and associated with delayed healing. MBio. 7 (5), 01058-01116 (2016).
  50. Blakytny, R., Jude, E. The molecular biology of chronic wounds and delayed healing in diabetes. Diabetic Medicine. 23 (6), 594-608 (2006).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Modelo de Ferida Cr nicaIndu o de Estresse OxidativoProcesso de Cicatriza o de FeridasForma o de BiofilmeInibi o de Enzimas AntioxidantesCamundongos Db dbProcedimento de Curativo de FeridaPseudomonas AeruginosaEnterobacter Cloacae

Artigos relacionados