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Artigo de método

Intracraniana optou rota de infecção para investigar papéis de biofilmes de Streptococcus suis em meningite em um modelo de infecção do rato

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DOI:

10.3791/57658

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1 de julho de 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, 2Key Lab of Animal Bacteriology, Ministry of Agriculture, 3OIE Reference Lab for Swine Streptococcosis, 4School of Medicine, Tsinghua University, 5Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses

Neste artigo

Resumo

Aqui, descrevemos a rota intracraniana optou de infecção em camundongos para estudar funções de biofilmes de Streptococcus suis meningite. Este modelo de infecção também é adequado para estudar a patogênese das outra meningite bacteriana e a eficácia de novas drogas contra meningite bacteriana.

Resumo

Streptococcus suis é não só um importante patógeno bacteriano de suínos no mundo, mas também um agente zoonótico emergente. Em humanos e suínos, a meningite é uma grande manifestação de S. suis infecções. Um modelo apropriado de infecção é uma ferramenta essencial para compreender os mecanismos das doenças causadas por agentes patogénicos. Várias rotas de infecção em camundongos foram desenvolvidas para estudar a patogênese da infecção por S. suis . No entanto, as rotas intraperitoneal, intranasais e intravenosa de infecção não são adequadas para estudar as funções dos componentes de superfície S. suis em meningite diretamente no cérebro, tais como a matriz extracelular de biofilmes. Embora intracisternal inoculação tem sido usada para infecção de S. suis , o site precisa de injeção não foi descrito. Aqui, na rota de infecção intracraniana optou foi descrita em um modelo do rato para investigar os papéis de biofilmes em S. suis meningite. S. suis planctônicos nas células ou biofilme estado foram diretamente injetado no espaço subaracnoide dos ratos através do site de injeção localizado 3,5 mm rostral do bregma. A análise histopatológica e aumento da expressão do mRNA de TLR2 e citocinas do tecido cerebral dos ratos injetados com células de biofilme estado claramente indicaram que o S. suis biofilme tem um papel definitivo na meningite S. suis . Esta rota de infecção tem óbvias vantagens sobre outras vias de infecção, permitindo o estudo da interação hospedeiro-bactéria. Além disso, ele permite que o efeito de componentes bacterianas no anfitrião respostas imunes diretamente no cérebro para ser avaliado e imita a entrada de bactérias no sistema nervoso central. Esta via de infecção pode ser estendida para investigar os mecanismos de meningite causada por outras bactérias. Além disso, ele também pode ser usado para testar a eficácia das drogas contra meningite bacteriana.

Introdução

Streptococcus suis (S. suis) é um importante patógeno bacteriano de suínos no mundo, causando doenças graves, incluindo meningite, pneumonia, septicemia, endocardite e artrite1. É também um agente zoonótico emergente. Até agora, tem sido relatado que nove sorotipos podem causar infecção nos seres humanos, incluindo os sorotipos 2, 4, 5, 9, 14, 16, 21, 24 e 31,2,3,4. Em humanos e suínos, a meningite é um dos principais sinais clínicos de S. suis infecções. No Vietnã e Tailândia, o S. suis é a principal causa de meningite em adultos5. Biofilmes microbianos são microorganismos que aderem-se uns aos outros e se concentram em uma interface; Eles são essenciais para a virulência bacteriana, sobrevivência em diversos ambientes e a resistência aos antibióticos5. Biofilmes são tipicamente rodeados por uma matriz extracelular que geralmente contém polissacarídeos, proteínas e DNA6. O último é capaz de eliciar respostas inflamatórias do hospedeiro e a produção de citocinas7. Formação de biofilme foi relatada para ser envolvido em meningite estreptocócica em estudos anteriores. Biofilmes contribuam para meningite Streptococcus agalactiae em um modelo de peixe tilápia e formação de biofilmes foi revelada dentro de tecidos do cérebro e ao redor meníngea superfícies na vivo através de de inoculação intra-abdominal8. Durante a meningite, Streptococcus pneumoniae está em um estado de biofilme e bactérias em um biofilme estado foram mais eficazes na indução de meningite em um rato infecção modelo9. Além disso, no nosso anterior estudo, o estado de biofilme associado S. suis em cérebro de rato contribui para a virulência bacteriana por sobrevivência análise10. No entanto, a evidência direta para envolvimento de biofilme em S. suis meningite requer mais investigação.

Foram desenvolvidos modelos animais de infecção de S. suis em ratos usando o intraperitoneal (i.p.)11, intranasal (óssea)12, intravenosa (i.v.)13e as intracisternal (i.c.) rotas de infecção14, 15 , 16. no entanto, os i.p., óssea e i.v. rotas de infecção não são adequadas para estudar as funções dos componentes de superfície S. suis em meningite diretamente no cérebro. Estes incluem matriz extracelular de biofilmes. Mas a inoculação de i.c. foi usada para infecção de S. suis , o site precisa de injeção não foi descrito os jornais. Em contraste, as coordenadas estereotáxicos do local da injeção para inoculação intracraniana optou claramente tem sido descrita em um anterior estudo17. Isto permitiu o fácil reconhecimento do ponto de inoculação e mais simplista protocolo experimental. Além disso, na rota de infecção intracraniana optou imita a entrada de bactérias no sistema nervoso central dos seios do face ou do ouvido médio,17e a relação entre o ouvido médio e a meningite causada por S. suis tem sido demonstrado por Madsen et al.18. Além disso, aplicando-se a rota intracraniana optou de infecção em camundongos, demonstrámos que o S. suis pequeno RNA rss04 contribui para meningite em nosso anterior de estudo10.

No presente estudo, na rota de infecção intracraniana optou foi usada em ratos para investigar os papéis de biofilmes em meningite S. suis . Camundongos foram infectados com células planctônicas ou biofilme estado de S. suis por esta via de infecção. A análise histopatológica e aumento da expressão do mRNA de TLR2 e citocinas do tecido de cérebro de ratos injetados com células de biofilme estado claramente indicaram que o S. suis biofilme contribui para a meningite.

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Protocolo

Os experimentos de infecção do mouse foram aprovados pelo laboratório Animal monitoramento Comité da província de Jiangsu, China e interpretados no laboratório Animal centro de Nanjing Agricultural University (de licença: SYXK (Su) 2017-0007).

1. preparação de bactérias

Nota: Cepa virulenta de S. suis sorotipo 2 P1/7 foi isolada de um porco doente com meningite19. Estirpe P1/7 foi cultivado em caldo Todd-Hewitt (THB, fórmula por litro de THB: infusão de coração, 3,1 g neopeptone, 20,0 g de dextrose, 2,0 g; cloreto de sódio, 2,0 g; fosfato dissódico, 0,4 g;, 2,5 g de carbonato de sódio) e chapeado em ágar de Todd-Hewitt (THA, fórmula por litro de THA: Infusão de coração, 3,1 g; neopeptone, 20,0 g; dextrose, 2,0 g; cloreto de sódio, 2,0 g; fosfato dissódico, 0,4 g; carbonato de sódio, 2,5 g; ágar-ágar, 15,0 g) a 37 ° C e 5% de CO2.

  1. Coleção de estirpe células planctônicas P1/7
    1. Coletar 5 mL de células planctônicas de cultura fase log de mid (OD600= 0,6), centrifugar durante 3 min a 8000 × g e em seguida lavar 3 vezes com PBS.
    2. Ressuspender as células com 5 mL de glicerol de 25% no THB, alíquota para 5 tubos e em seguida, armazenar a-80 ° C.
  2. Coleção de estirpe P1/7 células de estado de biofilme
    1. Recolher 20 mL de uma cultura da noite e adicionar a 180 mL de THB fresco; dividir a cultura diluída em 10 placas de cultura redondo e em seguida, colocar as placas na incubadora a 37 ° C em 5% de CO2 por 24 h.
    2. Após a incubação, agitar a placa suavemente para Ressuspender as bactérias que não aderiram à placa e em seguida, descartar o sobrenadante por aspiração.
      Nota: Agitar a placa com cuidado e evite resuspending do sedimento.
    3. Adicione 5 mL de PBS para colher células-estado biofilme, Ressuspender o sedimento completamente e em seguida, transferir a amostra para um tubo novo.
    4. Proceda à sonicação células biofilme estado da última etapa com os seguintes parâmetros: 60 W, 4 ciclos, 5 s s no e 10 fora.
    5. Centrifugar por 3 min em 8000 × g e armazenar o sobrenadante a-80 ° C.
      Nota: O sobrenadante pode conter componentes de biofilme e pode ser usada para Ressuspender as bactérias do biofilme antes da infecção, conforme descrito nas experiências com animais (etapa 3).
    6. Ressuspender o sedimento com 10 mL 25% glicerol no THB e armazenar as células de estado de biofilme a-80 ° C.

2. análise de microscopia eletrônica de varredura (MEV) de digitalização

  1. Corrigir o biofilme coletadas células de estado e células planctônicas usando paraformaldeído 4% para 12-24 h a 4 ° C.
  2. Lavar as amostras rapidamente com água destilada e desidratar as amostras sequencialmente com uma crescente concentração de etanol (25%, 50%, 70%, 90% e 100%) por 30 min em cada solução.
  3. Aderir as amostras secas para titulares com fita dupla-face de metal e, finalmente, revesti-los em um evaporador com ouro e paládio.
  4. Observar as amostras por um microscópio eletrônico de varredura usando os seguintes parâmetros: EHT (Extra alta tensão) = 10 kV; WD (distância de trabalho) = 7.0 ou 8.0 mm; Ampliação = 5000 ×; A um sinal = SE1.

3. animal experimentos

  1. Usar o SPF 6 semanas camundongos BALB/c fêmeas neste estudo. Infectar todos os mouses através da rota intracraniana optou de infecção cujo local de injeção é localizada 3,5 mm rostral do bregma. As coordenadas estereotáxicos do local da injeção foram claramente descritas por Chiavolini et al.17.
    1. Para a análise histopatológica, dois grupos de ratos (5 ratos por grupo) de infectar células de estado usando células planctônicas ou biofilme na dose de 3 × 107 formadoras unidades (CFU), e outro 5 ratos foram injetados com PBS como um controle.
    2. Para a deteção de expressão de RNAm de TLR2 e citocinas no cérebro, infectar dois grupos adicionais de ratos (6 ratos por grupo) usando células planctônicas ou biofilme estado células na dose de 3 × 107 UFC.
    3. Determine o número de bactérias viáveis por chapeamento diluições em série para THA.
    4. Eutanásia em todos os ratos a pós-infecção de 12 h para futuras pesquisas.
      Nota: O glicerol em meio de estoque deve ser removido antes da infecção. Ambas as células planctônicas e células de estado de biofilme recuperadas de-80 ° C são lavadas 3 vezes com PBS. Em seguida, células planctônicas são resuspended com PBS e diluídas para a dose adequada para a infecção; biofilme estado células são resuspended com o sobrenadante armazenado (da etapa 1.2.5) e diluídas para a dose adequada para a infecção. O volume de infecção não deve ser mais de 50 µ l.
  2. Detectando a expressão de RNAm de TLR2 e citocinas no tecido cerebral
    1. Extrai o RNA total do tecido cerebral usando um kit de extração de RNA.
      1. Para cada rato, use tecido de cérebro inteiro para extração de RNA. Divida o tecido de cérebro inteiro em 5 tubos. Ocupam de tecido cerebral de 100mg e adicionar 1 mL de solução de Lise para cada tubo que contém a matriz lysing fornecida pelo kit.
      2. Processar o tubo em um homogeneizador para 40 s em uma configuração de 6.0 e em seguida centrifugar o tubo a 12000 × g e 4 ° C por 5 min.
      3. Após a centrifugação, transferi a fase superior para um novo tubo de microcentrifugadora.
      4. Incubar a amostra transferida durante 5 min à temperatura ambiente; Adicionar 300 µ l de clorofórmio, vórtice para 10 s e então incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
      5. Centrifugar o tubo a 12000 × g e 4 ° C por 5 min. transferir a fase superior para um novo tubo.
      6. Adicionar 500 µ l de etanol absoluto frio para o tubo, antes invertendo por 5 vezes e em seguida armazenar a amostra a-20 ° C durante pelo menos 1 h.
      7. Centrifugar o tubo a 12000 × g e 4 ° C por 15 min e retirar o sobrenadante. Lave o pellet com 500 µ l de etanol frio de 75% em livre de RNase H2O.
      8. Remover o etanol, o ar seco a pelota durante 5 min à temperatura ambiente e ressuspender o RNA em 100 µ l de RNase-livre H2O.
      9. Incubar o RNA durante 5 min à temperatura ambiente e determinar a concentração de RNA usando um bioanalyzer RNA.
    2. Realize a síntese do cDNA, incluindo eliminação de DNA genômico (gDNA), usando um thermocycler com um kit de reagente de transcrição reversa (RT).
      1. Adicionar 1 µ g de RNA para um 2 µ l contendo de tubo de buffer de eliminação de x gDNA 5, 1 µ l de enzima de eliminação gDNA e livre de RNase H2O, até que o volume atinge 10 µ l. incube durante 2 min a 42 ° C.
      2. Adicionar 10 µ l de mistura de mestre (1 µ l da enzima RT Mix I, 1 µ l do Mix de Primer RT, 4 µ l de 5x Buffer 2 e 4 µ l de RNase-livre H2O) para a solução de reação da última etapa e, em seguida, misture delicadamente. Proceder imediatamente com a reação de RT: 37 ° C por 15 min e, em seguida, 85 ° C por 5 s.
      3. Realizar a análise quantitativa de PCR (RT-qPCR) em tempo real usando uma máquina de PCR em tempo real com um kit SYBR RT-qPCR. Adicione 10 µ l de 2 x enzima, 0,8 µ l de cartilha para a frente, 0,8 µ l de primer reverso, 0,4 µ l de 50 x ROX referência tintura II, 2 µ l de modelo do cDNA e livre de RNase H2O, até um volume total de 20 µ l.
      4. Executar cada amostra em triplicata, utilizando os seguintes parâmetros térmicos: 30 s a 94 ° C, seguida de 40 ciclos de 5 s a 95 ° C e 34 s a 60 ° C, com uma fase final de 15 s a 1 min a 60 ° C, 95 ° C e 15 s a 95 ° C. Primers para RT-qPCR estão listados na tabela 1. Genes de limpeza B2m e 18s rRNA foram usados como controles internos.
    3. Calcule a variação da dobra relativo baseada no método 2-ΔΔCt .
  3. Observação de cortes histológicos
    1. Após a fixação de 24 h com formol a 10%, reconstrua o tecido cerebral fixa em tamanhos adequados de pedaços de tecido em 2-3 mm.
    2. Coloque os pedaços de tecido em uma gaveta de encastre e mergulhe em uma nova solução fixador para desidratação com um desidratador de vácuo automático.
    3. Retire o tecido fixo e desidratá-lo sequencialmente em concentrações crescentes de etanol (70%, 80%, 95%, 95% e 100%) por 30 min em cada solução.
    4. Transparentize a amostra com xilol durante 15 min, mergulhá-lo em parafina líquida a 60 ° C por 90 min e em seguida incorporar usando uma máquina de encastre.
    5. Corte o tecido de bloco incorporado de parafina em fatias de 3 µm, telha a fatia na água a 45 ° C e em seguida secá-lo no ar.
    6. Incubar a seção para 3h a 60 ° C, manchá-la usando a hematoxilina e eosina (HE) método e selá-lo com a goma neutra.
    7. Observe as alterações histopatológicas do cérebro com microscópio óptico. Um sistema de classificação de quatro pontos foi usado para avaliar as alterações histológicas. Utilize um teste pareado t para análise estatística.
      Congestão/hemorragia: ausente, Pontuação 0; pequena área de congestão/hemorragia focal, escore 1; grande área de congestão/hemorragia focal, ou vários locais de pequena área de congestão/hemorragia focal, pontuação 2; até três sites grandes congestionamentos focal/hemorragia, marcar 3; difusa de congestionamento/hemorragia, marcar 4.
      Necrose: ausente, Pontuação 0; necrose focal, escore 1; difundir a ocorrência de 1-10 células necróticas, pontuação 2; focos de necrose confluente, pontuação de 3; extensa necrose confluente, marcar 4.
      Infiltração de células inflamatórias: ausente, Pontuação 0; focais e algumas infiltrações, escore 1; infiltração multifocal ou infiltrações com formação de agregados, pontuação 2; até três agregados, marcar 3; e mais de quatro agregados, marcar 4.

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Resultados

SEM análise foi realizada para examinar a formação de biofilmes nas condições experimentais. Como mostrado na Figura 1, há uma diferença significativa na formação de biofilme entre células planctônicas (Figura 1A) e células de estado de biofilme (Figura 1B). SEM a análise mostrou que as bactérias do biofilme foram aos montes e múltiplas camadas e eles foram encerrado...

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Discussão

A rota intracraniana optou de infecção descrita aqui tem óbvias vantagens sobre outras vias de infecção. Ele permite que os investigadores a estudar a interação hospedeiro-bactéria e o efeito de componentes bacterianas em respostas imunes host diretamente no cérebro, que imitam a entrada de bactérias no sistema nervoso central. Assim, esta via de infecção pode ser estendida para investigar os mecanismos de meningite causada por outras bactérias. Além disso, ele também pode ser usado para testar a eficácia das drogas cont...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por subsídios da pesquisa nacional de chave e programa de desenvolvimento da China [2017YFD0500102]; a Fundação Nacional de ciências naturais da China [31572544]; o laboratório estadual chave de veterinária etiológico biologia [SKLVEB2016KFKT005]; a agricultura de Shanghai aplicada tecnologia desenvolvimento programa, China [G2016060201].

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Caldo Todd Hewitt (THB)Becton, Dickinson and CompanyDF0492078Dissolva 30 g do pó em 1 L de água purificada. Autoclave a 121° por 15 min.
ÁgarDSBIO16C0050Dissolver 15 g do pó em 1 L de THB. Autoclave a 121° por 15 min.
Sistema de purificação de água de referência Milli-QMerck KGaAZ00QSVCUSsem Dnase/Rnase
NaClTianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd10019318Dissolver 8 g de NaCl, 0,2 g KCl, 1,42 g Na2HPO3, 0,27 g KH2PO4 em 1 L de água purificada. Autoclave a 121° por 15 min. Use KOH para ajustar o pH para 7,4.
Na2HPO3Xilong Scientific Co., Ltd9009012-01-09Dissolva 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,42 g de Na2HPO3, 0,27 g de KH2PO4 em 1 L de água purificada. Autoclave a 121° por 15 min. Use KOH para ajustar o pH para 7,4.
KClXilong Scientific Co., Ltd9009017-01-09Dissolver 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,42 g de Na2HPO3, 0,27 g de KH2PO4 em 1 L de água purificada. Autoclave a 121° por 15 min. Use KOH para ajustar o pH para 7,4.
KH2PO4Xilong Scientific Co., Ltd9009019-01-09Dissolver 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,42 g de Na2HPO3, 0,27 g de KH2PO4 em 1 L de água purificada. Autoclave a 121° por 15 min. Use KOH para ajustar o pH para 7,4.
KOHXilong Scientific Co., Ltd9009014-01-09Dissolver 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,42 g de Na2HPO3, 0,27 g de KH2PO4 em 1 L de água purificada. Autoclave a 121° por 15 min. Use KOH para ajustar o pH para 7,4.
GlycerolSionpharm Chemical Reagent Co., Ltd10010618Diluído com volume igual de água purificada, autoclave a 121° por 15 min
4% de paraformaldeídoSionpharm Chemical Reagent Co., Ltd80096675
25% de GlutaraldeídoSionpharm Chemical Reagent Co., Ltd3009243610 vezes diluído com água purificada para fixação.
EtanolSionpharm Chemical Reagent Co., Ltd10009218
ChloroformSionpharm Chemical Reagent Co., Ltd10006818
SpctrophotometerDeNovix Inc.Triturador de células DS-11 +
ultrassomNingBo Scientz Biotechnology Co., LtdJY96-IIN
CentrífugaHitachi Koki Co., LtdCT15RE
GeladeiraAucma Co., LtdDW-86L500
Microscópio eletrônico de varreduraZeissEVO-LS10
FastRNA Pro Green KitMP Biomedicals# 6045-050
Instrumento FastPrep-24MP Biomedicals116005500
Instrumento para PCRSensoQuest GmbH1124310110
QuantStudio 6 FlexThermo Fisher Scientific4485689
SYBR Premix Ex Taq IITakara Biomedical Technology (Beijing) Co., LtdRR820A
Kit de reagentes PrimeScript RT com borracha degDNATakara Biomedical Technology (Beijing) Co., LtdRR047A
Processador de tecidos totalmente fechadoLeica Biosystems Nussloch GmbHASP200S
Módulo de incorporação de parafina aquecidaLeica Biosystems Nussloch GmbHEG1150H
micrótomo rotativo semiautomatizadoLeica Biosystems Nussloch GmbHRM2245
Banho-maria para seções de parafinaLeica Biosystems Nussloch GmbHHI1210
Autostainer XLLeica Biosystems Nussloch GmbHST5010
Agilent 2100Agilent TechnologiesG2939A
Microscópio ópticoOlympusBX51

Referências

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