Pneumonia infecciosa é entre as infecções mais comuns em humanos. Um modelo apropriado na vivo é fundamental para compreender a patogênese da doença e testar a eficácia da terapêutica de romance. Com este modelo de pneumonia de aspiração orofaríngea murino, um pode examinar a patogênese e novos tratamentos contra essas infecções mortais.
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Artigo de método
Modelo murino aspiração orofaríngea da Pneumonia bacteriana associada e hospitalares
Neste artigo
Resumo
Resumo
Modelos de infecção murino são essenciais para compreender a patogênese da doença e testar a eficácia da terapêutica novela projetada para combater agentes patogénicos causadores. Pneumonia infecciosa está entre as infecções mais comuns apresentadas pelos pacientes na clínica e, portanto, garante um modelo apropriado na vivo . Pneumonia típica modelos usam inoculação intranasal, que deposita excessivos organismos fora do pulmão, causando complicações fora do alvo e sintomas, tais como sinusite, gastrite, enterite, trauma físico ou micropartículas de nebulização para imitar o aerossol Espalhe mais típico de pneumonia viral, fúngica ou tuberculosa. Estes modelos não refletem com precisão a patogênese da pneumonia bacteriana típica ou cuidados de saúde-adquirida na Comunidade. Em contraste, este modelo murino de pneumonia por aspiração orofaríngea imita a rota da gota em pneumonia adquirida na saúde. Suspensão em orofaringe de ratos anestesiados inocular 50 µ l das bactérias faz com que aspiração reflexiva, o que resulta em uma pneumonia. Com este modelo, pode-se examinar a patogênese de patógenos causadores de pneumonia e novos tratamentos para combater estas doenças.
Introdução
Infecção respiratória inferior é a mais mortal das doenças transmissíveis do mundo e a causa mais comum de morte nos países em desenvolvimento1. Globalmente, estas infecções são responsáveis por mais de 3,2 milhões de mortes1. Além disso, uma pneumonia nosocomial está entre as formas mais comuns e mortais de infecções adquiridas de saúde e é causada por patógenos mais resistentes aos antibióticos,2,3. A rota típica de aquisição da pneumonia bacteriana para ambos adquirida na Comunidade e pneumonia nosocomial é a aspiração do conteúdo da orofaringe em alvéolos. Murino modelos utilizados para estudar estas doenças frequentemente usam inoculação intranasal4, depositando muito das bactérias fora do pulmão, causando complicações fora do alvo e sintomas como sinusite e traumas físicos, que são incongruentes com a doença progressão em humanos que os modelos foram projetados para emular. Outros modelos podem usar câmaras de inalação e dispositivos de micromisting, que com mais precisão imitam pneumonias virais, tuberculosas e fúngicas, mas não com precisão recapitular a rota normal de aquisição para pneumonias bacterianas típicas.
O modelo de uma pneumonia de aspiração orofaríngea murino pode ser utilizado para simular a rota natural e patogênese da pneumonia bacteriana. Pela inoculando 50 µ l da suspensão bacteriana em orofaringe de ratos anestesiados com uma pipeta, aspiração reflexiva segue, o que resulta em uma pneumonia infecciosa. Usando este modelo, um pode examinar a patogênese de patógenos causadores de pneumonia e novos tratamentos para combater estas doenças com um modelo de fidelidade maior, mais semelhante a infecções de pneumonia de aspiração observadas em humanos. Além disso, ao contrário dos modelos semelhantes que infectam através da cavidade oral5,6, este modelo garante que o inóculo completo atinge os pulmões em vez do intestino, onde pode causar inflamação fora do local e infecções, como a gastrite e enterite. Finalmente, ao contrário de outro modelo publicado que requer um laringoscópio e inocula-se através da traqueia7, este modelo não obstrua as vias aéreas com uma agulha de gavagem e não exige a injeção para a entrega de inóculo. Em vez disso, inoculação depende o reflexo de aspiração natural do mouse.
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Protocolo
Todos os procedimentos que envolvam animais devem ser aprovados do pesquisador institucional Cuidado Animal e Comissão de utilização (IACUC).
1. preparação do inóculo bacteriano
- Isole colônias bacterianas.
- Raia uma estirpe bacteriana (por exemplo, a. baumannii "HUMC1") em ágar-ágar estéril apropriado (por exemplo, ágar Tryptic soy), tendo o cuidado de gerar colónias isoladas.
- Incube a condições apropriadas (por exemplo, durante a noite a 37 ° C).
- Cresce a cultura durante a noite.
- Selecione um representante, colônia isolada da placa de ágar com um loop inoculando estéril e usá-lo para inocular 10 mL do meio de caldo estéril apropriado (por exemplo, caldo Tryptic soy).
- Permitir que a amostra chegar a fase estacionária em condições adequadas (por exemplo, 37 ° C, com agitação a 200 rpm durante a noite em um frasco cónico ventilado-cap, 50 mL).
- Cresce a subcultura.
- Transferi 100 μL da cultura durante a noite a 10 mL de caldo estéril fresco, usando uma pipeta.
- Permita alcançar a fase exponencial/log em condições adequadas (por exemplo, 37 ° C, com agitação a 200 rpm para 3h em um frasco cónico ventilado-cap, 50 mL).
- Lave a subcultura.
- Remova a subcultura do seu ambiente de incubação.
- Centrifugar a 4.000 × g por 5 min para as bactérias de Pelotas.
- Aspirar e desprezar o sobrenadante.
- Adicione 10 mL de salina tampão fosfato (PBS) para a pelota e vórtice vigorosamente até totalmente resuspended.
- Repita as etapas 1.4.2 - 1.4.4 duas vezes, para um total de 3 lavagens.
- Ajuste a concentração da suspensão bacteriana.
- Usando um espectrofotômetro que mede a densidade óptica em 600 nm (OD600), medir a densidade óptica da suspensão bacteriana.
- Adicionar PBS estéril à suspensão bacteriana até a densidade óptica do inóculo cai para uma OD600 de 0.5, usando a equação Ceu× Veu = Cf× Vf, onde "C" é a concentração, "V" é o volume, o "eu" é inicial, e "f" é final. * Cf sempre deve ser 0,5; Vf é a variável para resolver.
- Se a suspensão bacteriana cai abaixo de um OD600 de 0.5, centrifugá-lo a 4.000 × g por 5 min para as bactérias de pelotas e retirar uma quantidade apropriada de sobrenadante para alcançar uma OD600 de 0,5.
- Realizar diluições em série em PBS estéril (por exemplo, três diluições de 1: 100 para atingir 1 × 10-6) e placa no ágar estéril para determinar o coeficiente de correlação que revela a concentração bacteriana em formadoras unidades por mL (CFUs/mL) em um OD de600 de 0,5.
Nota: O valor do coeficiente de correlação deste irá variar para cada cepa de cada espécie e deve ser determinado antes da preparação do inóculo para a infecção. - Depois de determinar o coeficiente de correlação, usá-lo para criar um inóculo da concentração desejada (por exemplo, 2 × 108- 1 × 109 CFUs/mL); Se o inóculo desejado for maior que o OD600 de 0.5, centrifugar a suspensão bacteriana 4.000 × g por 5 min para as bactérias de pelotas e retirar uma quantidade apropriada de sobrenadante para atingir a concentração desejada.
- Execute na vivo estudos-piloto para determinar a virulência de cada isolado bacteriano em cada cepa de rato como esses valores variam entre isolados bacterianos da mesma espécie e ratos de diferentes origens genéticas. Para várias espécies de bactérias Gram-negativas, o LD100 em camundongos é geralmente 1-5 × 108 CFUs/rato, embora certas estirpes são letais em inóculos inferiores.
- Congele as alíquotas idênticas para uso futuro como inóculos sob demanda, precisos, como publicado anteriormente8 (opcional).
- Prepare 1 L de inóculo bacteriano como descrita acima, transferência para dois frascos Erlenmeyer 500 mL e centrifugar 4.000 × g por 5 min.
- Descartar a 450 mL do sobrenadante de cada frasco de Erlenmeyer e ressuspender as pelotas de bactérias no sobrenadante restante.
- Transferir o inóculo bacteriano concentrado para um copo de 250 mL contendo uma barra de agitação magnética e misture continuamente em cima de um prato de agitar a 300 rpm.
- Transferir com cuidado, exatamente 600 μL de inóculo bacteriano concentrado (por exemplo, 1 × 1010 CFUs/mL) com uma pipeta para um frasco criogênico de 1,6 mL, contendo exatamente 300 μL de estéril H2O e 300 μL de glicerol estéril; mistura e loja a-80 ° C.
Nota: O glicerol necessário para armazenamento pode confundir os resultados experimentais e causar excesso de mortalidade, por isso é necessário lavá-lo. - Quando estiver pronto para uso, descongele a amostra durante 10 minutos à temperatura ambiente.
- Transferir 1 mL para um frasco de Erlenmeyer de 50 mL, adicionar 9 mL de PBS estéril e centrifugar a 4.000 × g por 5 min para as bactérias de Pelotas. Aspirar o sobrenadante e ressuspender a quantidade pré-determinada de CFUs (1 mL × congelado a concentração das ações em CFUs/mL) em um volume adequado de PBS para atingir a concentração desejada para o inóculo infeccioso.
2. anestesiar os ratos
- Xilazina/cetamina
Nota: A anestesia com cetamina/xilazina tem uma longa duração, que dispõe de tempo suficiente para o pesquisador, que é novo nesta técnica para concluir o procedimento de inoculação antes o mouse desperta.- Prepare-se 10 mL de solução injetável, combinando 8,5 mL de pharmaceutifcal série PBS, 1ml de 100mg/mL solução estoque de cetamina (concentração final 10 mg/mL) e 0,5 mL de 20 mg/mL solução estoque de xilazina (concentração final 10 mg/mL).
- Administre 10 μL/g por injeção intraperitoneal de (IP) (por exemplo, 250 μL para um rato de 25-g).
- Aplica a pomada oftálmica aos olhos dos ratos anestesiados com cetamina/xilazina, porque seus olhos estão danificados durante longos períodos de anestesia.
- Coloque o mouse em uma gaiola e monitorar até ele acorda da anestesia.
Nota: O animal não deve ser deixado sem supervisão até que recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal.
- Isoflurano
Nota: Os ratos rapidamente acordam da anestesia induzida por isoflurano após ser removido da câmara de indução, então este método de anestesia só deve ser usado depois de se tornar proficientes em procedimento de inoculação.- Coloque os ratos ingênuo em uma câmara de indução apropriadamente dimensionados com oxigênio fluindo.
- Depois que a câmara é vedada, anestesiar os ratos usando um vaporizador de precisão para adicionar isoflurano em 4% (v/v) pelo menos 5 min; confirmar a anestesia, removendo um rato da câmara de indução e medir o tempo que demora para acordar da anestesia (~ 60 s).
Nota: Esteja ciente de que anestesia vezes podem variar com base em diretrizes institucionais e alguns animais podem exigir mais de 5 min para tornar-se totalmente anestesiado. - Manter a anestesia por até 10 min. ajustando a concentração de isoflurano para 2-3%; se a duração total da anestesia é > 15 min, aplique pomada oftálmica nos olhos de ratos anestesiados.
- Coloque o mouse em uma gaiola e monitorar até ele acorda da anestesia, como no passo 2.1.
3. inocular/infectar ratos
- Suspender um rato anestesiado, pendurá-lo pelos seus incisivos superiores em uma corda forte, fina (por exemplo, fio dental) fixados a um objeto fixo a uma altura de aproximadamente duas vezes do mouse comprimento do corpo (por exemplo, 20 cm) acima da superfície de funcionamento (por exemplo bancada de laboratório).
- Suavemente puxe a língua do rato fora de sua boca utilizando pinça estéril, sem corte-terminado. Transferi a língua para um dedo estéril, com luvas para evitar o esmagamento acidental da língua do rato. Segure a língua fora da boca, permitindo o acesso à orofaringe e evitando a deglutição do inóculo para o lado.
- Enquanto segura a língua do rato, coloque o inóculo de 50 μL (suspensão bacteriana) na orofaringe utilizando uma micropipeta; a orofaringe está localizada na junção da cavidade oral e faringe em direção a parte traseira da boca.
Nota: É muito importante entregar apenas líquido pipetando para a primeira parada da micropipeta. O rato vai parar de respirar por alguns segundos quando o inóculo é colocado na orofaringe; eventualmente, aspiração reflexiva fará com que o mouse inalar a suspensão bacteriana, indicada pelo ruído crepitante distintivo do líquido entrar nos pulmões, o que resulta em infecção de uma pneumonia. - Se o inóculo não é colocado longe de volta suficiente para bloquear a respiração normal, beliscar as narinas com fórceps para forçar reflexiva aspiração através da boca e inalação subsequente do inóculo.
- Após a inoculação, solte a língua, remover o mouse da cadeia de suspensão, colocá-lo em uma gaiola e monitorar até ele acorda da anestesia, como no passo 2.1.
4. monitorar a progressão da doença
Nota: Devido ao sofrimento dos animais, vários indicadores devem ser usados para indicar quando os ratos se tornam moribundos; eutanásia deve ser realizada após esta determinação, em conformidade com um protocolo IACUC previamente aprovado; vários marcadores de moribundity incluem a temperatura corporal, perda de peso, aparência, da marcha e outros biomarcadores que podem ser obtidos a partir do sangue (por exemplo, através do iSTAT)9,10,11,12, 13,14,15,16.
- Eutanásia nos ratos, de acordo com protocolo previamente aprovado de IACUC (por exemplo, CO2 , seguido por deslocamento cervical).
- Remova os pulmões de eutanásia mouse cortando a traqueia, artéria pulmonar e veia pulmonar perto dos pulmões.
- Microscopia
- Coloque os pulmões (ou parte) em um molde do espécime.
- Encha o molde de amostra com temperatura de corte ideal (O.C.T.) composto, submergindo completamente o tecido.
- Congelar a amostra a-80 ° C.
- Envie a amostra para um laboratório de patologia de seção e montar em lâminas de microscopia.
- Carga bacteriana
- Pese o tecido pulmonar em uma balança analítica.
- Transferi o tecido pulmonar para frasco cónico de 50 mL contendo 2-5 mL de PBS estéril (dependendo do tamanho do tecido).
- Homogeneizar o tecido pulmonar com um homogeneizador.
- Realize diluições em série do homogeneizado em PBS estéril para atingir aproximadamente 1.000 CFUs/mL, com base na carga bacteriana esperada nos pulmões.
- Por exemplo, se 1 × 109 CFUs/mg é esperado, realizar três diluições de 1: 100: transferir 100 μL de homogeneizado a 9,9 mL de PBS e vortex; Esta é a primeira diluição 1: 100. Transferir 100 µ l da primeira diluição 1: 100 para 9,9 mL de PBS e vortex; Esta é a segunda diluição de 1: 100. Transferir 100 μL da segunda diluição de 1: 100 para 9,9 mL de PBS e vortex; Esta é a diluição de 1: 100 terceira e final.
- Se a carga bacteriana nos pulmões é desconhecida, execute uma série de diluições para capturar a escala prevista.
- Placa dilution(s) em ágar estéril.
- Prepare-se estéril Tryptic Soy caldo (TSB) com placas de agar (TSA): Combine 30 g de TSB, 15 g de ágar-ágar, 1 L de água, misturar com um agitador magnético e aqueça até ferver a ~ 100 ° C durante 5 min. deixe esfriar e então autoclave no ciclo líquido durante 15 min. permitir arrefecer à ~ 55 ° C, transferência 10ml recém autoclavado TSA para pratos de Petri estéril e deixar arrefecer à temperatura ambiente. Deixe secar na bancada para 2-5 d ou descobertos sob uma armário por 10 min de biossegurança.
- Transferir 100 µ l da diluição para uma placa de Petri contendo TSA estéril e espalharam TSA usando um difusor ou vidro grânulos.
- Armazenar o prato de Petri durante a noite a 37 ° C numa incubadora umidificado (ou seja, incubadora 37 ° C, contendo um copo 1-L descoberto, cheio de água)
- Determinar CFUs/mL pulmão homogenate baseado no chapeamento de ágar (por exemplo, 100 CFUs na placa TSA com 100 μL de terceira e última diluição descrita acima seria 100 CFUs/100 μL × 100dil #1 × 100dil #2 × 100dil #3 = 1 × 109 CFUs/mL).
- Calcular o tecido de pulmão CFUs/mg baseado dividindo homogenate de pulmão CFUs/mL por mg pulmão homogeneizado de tecido/mL (por exemplo, se o exemplo descrito acima usado 100 mg de tecido pulmonar homogeneizado em 5 mL de PBS e, em seguida, 1 × 109 CFUs/mL ÷ 100 mg / 5 mL = 5 × 10-7 CFUs/mg).
- Microscopia
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Resultados
Cuidadosamente, seguindo o protocolo, reproduzíveis e robustos de dados podem ser facilmente obtidos. É fundamental para aderir do inóculo personalizado preparação protocolo para experiências ser comparado com um outro. Também é importante tratar adequadamente os ratos durante o processo de infecção. Não se esqueça de colocar os ratos em uma câmara de anestesia desprovido de isoflurano. Os ratos entrará em pânico se eles são colocados em uma câmara que tenha sido previamente preenchida co...
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Discussão
Para ter certeza, os ratos não são seres humanos em miniatura. Resultados obtidos em modelos do rato devem ser considerados no contexto e posteriormente interpretados para aplicabilidade aos seres humanos, com base em diferenças e semelhanças entre as duas espécies de6. Também é importante escolher a tensão apropriada do mouse como certos estão mais suscetíveis a algumas infecções do que outros; o mesmo se aplica para a cepa de patógeno de escolha16.
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Divulgações
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas no National Institutes of Health [Grant número R01 AI117211, R01 AI130060, R21 AI127954 e R42 AI106375 BS] e Food and Drug Administration [contrato HHSF223201710199C a BML].
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ágar | BD | 214530 | Combine com TSB para fazer |
| grânulos TSA, vidro de borosilicato | Kimble | 135003 | Esterilize por cozimento ou autoclavagem antes de cada uso |
| Copo, 250 mL | Pyrex | 1003 | Usado durante a alíquota precisa de inóculos bacterianos concentrados |
| Centrífuga | Sorvall | ST 40R | Capaz de 4.000&vezes; g em 4° Câmara C |
| para Anestesia | Kent Scientific Corporation | VetFlo-0720 | Acomoda até 5 camundongos |
| Criomolde, Tamanho Intermediário | Sakura Tissue-Tek | 4566 | Moldes de amostra de vinil descartáveis, 15&vezes; 15 vezes; Fio |
| Dental | Oral-B | 37000469537 | Amarre ao poste estável aprox. 6" acima da altura da mesa |
| Fórceps | VWR | 82027-440 | Usado para puxar suavemente a língua para fora da boca do rato |
| Homogeneizador para Tecido Pulmonar | Omni International | TM125-115 | Autoclave antes do primeiro uso; enxágue entre as amostras |
| Isoflurano para Anestesia | Abbott | 10015516 | Pode ser usado medicamento alternativo; modificar o procedimento de acordo |
| com o cartucho iSTAT | Abbott | 03P79-25 | Vários cartuchos estão disponíveis para atender às suas necessidades |
| Cetamina, 100 mg/mL | Western Medical Supply | 4165 | Diluir 1:10 em PBS para 1 mg/mL e combinar com xilazina a 1 mg/mL |
| Pomada para olhos | Akorn | Lágrimas | renovadas Evite tocar no olho com a ponta do dispensador |
| Temperatura ideal de corte (OCT) Composto | Fisher Scientific | 23-730-571 | Usado para congelar amostras de pulmão a -80 ° C para preparar para a patologia seccionando |
| Placa de Petri | VWR | 25384-302 | Poliestireno, descartável, esterilizado, 100&vezes; 15 mm |
| de solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Corning | 21-031-CM | PBS de Dulbecco sem cálcio e magnésio |
| Pontas de pipeta, 200-μ L | VWR | 10017-044 | Autoclave antes do uso |
| Pipetter, 200-μ L | Gilson | Pipetman P200 | Autoclave e calibre antes de usar |
| Espalhador, Célula Bacteriana | Bel-Art | F377360006 | Esterilize por cozimento ou autoclave antes de cada uso |
| Barra de Agitação, Magnética, 7,9 mm de Diâmetro e tempos; 38,1 mm de Comprimento | VWR | 58948-150 | Usado para agitar inóculos bacterianos concentrados durante a alíquota |
| Placa de Agitação, Corning Magnético | PC-620D | Usado para agitar inóculos bacterianos concentrados durante a alíquota | |
| Caldo de soja tríptico (TSB) | BD | 211822 | Combine com ágar para fazer frasco TSA |
| , cônico, estéril, 50 mL | Corning | 431720 | Usado para preparar inóculos bacterianos |
| Frasco, cônico, estéril, 500 mL | Corning | 431123 | Usado para concentrar inóculos para preparar inóculos congelados |
| Frasco, criogênico, 2,0 mL | Corning | 430659 | Usado para armazenamento criogênico de inóculos bacterianos concentrados |
| Xilazina, 20 mg / mL | Akorn | AnaSed | Diluir 1:20 em PBS para 1 mg / mL e combinar com cetamina a 1 mg / mL |
Referências
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Reimpressões e permissões
